抗蓝舌病病毒血清16型vp2蛋白单克隆抗体btv16-3g10及其识别的b细胞表位多肽和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗蓝舌病病毒血清16型VP2蛋白单克隆抗体BTV16-3G10及其识别的B细胞表位多肽和应用，属于蓝舌病防治领域。本发明还涉及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，间接免疫荧光试验显示该单克隆抗体只与BTV16呈现特异性反应，而不与蓝舌病病毒其他血清型，茨城病病毒，中山病病毒产生交叉反应。进一步的，本发明利用截短表达抗原短肽和肽扫描技术鉴定出该抗体所识别的BTV16-VP2蛋白B细胞表位多肽。本发明的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的BTV16-VP2蛋白B细胞表位可用于制备成BTV16型特异性鉴别诊断试剂，并为BTV表位标记疫苗的研制奠定了基础。
【专利说明】抗蓝舌病病毒血清16型VP2蛋白单克隆抗体BTV16-3G10及其识别的B细胞表位多肽和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，尤其涉及一株分泌抗BTV16 VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体；本发明还涉及一个B细胞表位多肽，尤其涉及由上述单克隆抗体所识别的BTV16 VP2蛋白B细胞表位多肽；本发明还涉及上述杂交瘤细胞株、单克隆抗体以及B细胞表位多肽在制备诊断或预防BTV16感染药物中的应用，属于蓝舌病的防治领域。
【背景技术】
[0002]蓝舌病(Bluetongue, BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的反刍动物虫媒传染病。BTV能感染大多数家养的和野生的反刍动物，因动物的易感性不同表现出不同的临床症状。不同流行地区易感动物的死亡率差别很大，一般都可达到30%，在某些地区甚至更高。由于BT对世界经济的影响，世界动物卫生组织(OIE)将BT列为法定通报性疾病，我国将其划定为一类动物疫病。BT所造成的相关经济损失一方面通过直接降低动物的生产能力和增加动物的死亡率，更重要的是由于控制动物的流动、控制牛精液出口以及实施这些控制措施所需的费用而间接造成的动物贸易损失。
[0003]BT最早于1876年发现于南非的绵羊，1902年被命名为“抗疟疾绵羊卡他热”，1905年被正式命名为“蓝舌病”。20 世纪初，由于高度易感的非本土绵羊品种的引进致使BT开始在非洲蔓延。BT被认为是一种地方流行性疾病，位于纬度40° S和53° N的美洲、非洲、亚洲、澳洲是高发地区，仅1996年造成全球范围内的经济损失高达30亿美元。1979年我国首次在云南绵羊发现蓝舌病，随后在29个省均检出BT阳性家畜，如山西(1991)、甘肃(1990)、四川(1988)、安徽(1985)、湖北(1983)等。2006年以来，随着气候变暖，BT尤其是BTV8在欧洲许多国家如比利时、荷兰、法国、德国等爆发，造成了严重的经济损失，同时也扩大了 BTV的传统分布范围。覃绍敏等(2011)对广西11个地区的山羊BT进行了血清学调查，结果表明阳性率为6.3%-45.1%，平均阳性率为20.5%。
[0004]BTV血清型众多，目前已发现24个血清型，而随着气候变化新的血清型不断出现，如最近又相继分离到的BTV25 (瑞士，2008年)和BTV26 (科威特，2011年)。然而由于各个血清型之间交叉免疫保护性差，使得疫苗免疫错综复杂不能起到很好的保护作用，到目前为止尚未有有效的疫苗。早期准确诊断，早期预防，是防止本病爆发的最有效方法。所以，必须加强我国BT的相关工作的研究，做好必要的技术储备。
[0005]BTV属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus),其基因组为分节段的线性双链RNA，包含10个节段，大小约为19kb，共编码11种蛋白。其中VP2蛋白位于病毒的最外侧，呈长钉状突出病毒表面，参与病毒对哺乳动物细胞的吸附和侵入，具有血凝活性，中和活性，是决定血清特异性的主要抗原。因此，筛选出一株可以分泌型特异性抗体的杂交瘤细胞株，并鉴定出其所分泌的单克隆抗体所识别的BTV16-VP2蛋白特异性B细胞表位对BTV16型特异性诊断方法的建立，及疾病的预防或治疗具有重要作用，并为BTV表位标记疫苗的研制奠定了基础。
【发明内容】
[0006]本发明目的之一是提供一株分泌抗蓝舌病病毒血清16型(Bluetongue virus16，BTV16) VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0007]本发明目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与BTV16发生特异性反应，而不与蓝舌病病毒其他血清型(BTV1-15，17-24)，茨城病病毒(Ibaraki virus, IBAV),中山病病毒(Chuzan virus, CV)产生交叉反应;
[0008]本发明目的之三是鉴定一个BTV16-VP2蛋白的BTV16型特异性B细胞表位。
[0009]本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0010]本发明通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达的BTV16 VP2重组蛋白为免疫原免疫Balb/c鼠，取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合。此外，本发明还利用真核重组VP2蛋白作为包被抗原经间接ELISA方法筛选得到一株稳定分泌抗BTV16 VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BTV16-3G10，分类命名是:分泌抗BTV16 VP2蛋白单克隆抗体3G10的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；其微生物保藏号是=CGMCC N0.8153，保藏时间:2013年8月28日；保藏单位是:中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏地址是:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，所述的单克隆抗体BTV16-3G10其所特异性识别的BTV16 VP2蛋白线性B细胞表位的氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示(34EWSGHDVTEIPNR 觀 F49)。
[0011]本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，其命名为BTV16-3G10, Western blot检测结果表`明BTV16-3G10可与BTV16-VP2蛋白发生特异性反应，而与BHK-21细胞不发生反应，间接免疫荧光试验(IFA)显示该单克隆抗体只与BTV16呈现特异性反应，而不与蓝舌病病毒其他血清型(BTV1-15，17-24)，茨城病病毒(IBAV),中山病病毒(CV)产生交叉反应。
[0012]本发明利用原核表达短肽技术和肽扫描技术对BTV16-3G10所识别的BTV16-VP2蛋白的B细胞表位进行了鉴定，最终将该表位精确定位为:34EWSGHDVTEIPNR觀F49 (SEQ IDN0.1所示)。同时，序列比对结果显示34EWSGHDVTEIPNR觀F49在BTV16型不同地区分离株中是高度保守的，而在蓝舌病病毒其他血清型以及和蓝舌病病毒同处于呼肠孤病毒科环状病毒属的其他代表病毒之间几乎没有保守性，说明该表位为BTV16型的特异性表位。
[0013]此外，本发明还提出了所述杂交瘤细胞株在制备诊断BTV16病毒感染药物中的应用。及
[0014]所述的单克隆抗体在制诊断或预防BTV16病毒感染药物中的应用。以及
[0015]所述的BTV16-VP2 蛋白线性 B 细胞表位多肽 34EWSGHDVTEIPNR觀F49 (SEQ ID N0.1所示)在制备诊断BTV16感染药物中的应用。
[0016]综上所述，本发明制备并鉴定出了一种特异性针对BTV16-VP2蛋白的单克隆抗体，本发明的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的BTV16-VP2蛋白病毒特异性B细胞表位多肽为建立BTV16型特异性免疫学检测方法和VP2蛋白的功能研究奠定了基础。【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为SDS-PAGE鉴定重组VP2蛋白的真核表达与纯化；
[0018]M:蛋白Marker ；1:野生型杆状病毒感染Sf9细胞裂解液；2:未感染杆状病毒的Sf9细胞裂解液；3:感染重组杆状病毒的Sf9细胞裂解液；4:纯化的BTV-16VP2蛋白；5:纯化BTV-16 VP2蛋白的洗液(不含BTV-16 VP2蛋白，但含有其他杂蛋白)；
[0019]图2为应用Western blot试验检测单克隆抗体BTV16-3G10与BTV16-VP2蛋白的反应性结果；
[0020]1:接种有野生型杆状病毒的昆虫细胞裂解液；2:通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达、纯化的BTV16VP2重组蛋白；3:BTV16感染的BHK-21细胞裂解沉淀；4:BHK-21细胞裂解沉淀；M:标准蛋白Marker
[0021]图3为应用IFA试验检测单克隆抗体BTV16-3G10与BTV16的反应性结果；
[0022]a:MAb BTV16-3G10;b:BTV16型鼠阳性血清对照；c:鼠阴性血清对照
[0023]图4为原核表达重组MBP短肽与单克隆抗体BTV16-3G10反应性的间接ELISA分析；
[0024]图5为通过肽扫描技术合成短肽与单克隆抗体BTV16-3G10反应性的间接ELISA分析；
[0025]图6为所鉴定B细胞表位的保守性及特异性分析；
[0026]A:单克隆抗体BTV16-3G10所识别的B细胞在BTV1-26间的保守性分析；B:单克隆抗体BTV16-3G10 所识别的B细胞在呼肠孤病毒科环状病毒属内代表病毒间的保守性分析；
[0027]图7为BTV16型不同地区分离毒株的VP2蛋白上与BTV16-3G10所识别的B细胞表位相应区段不完全一致的短肽与BTV16-3G10的间接ELISA分析。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0029]主要实验材料和来源
[0030]1.细胞与病毒
[0031]BHK-21细胞、SP2/0骨髓瘤细胞以及BTV1-24型毒株、茨城病病毒、中山病病毒由本研究室保存。
[0032]2.主要试剂
[0033]胎牛血清、DMEM培养基购自GIBCO公司；50%PEG、50XHAT、50XHT、FITC标记羊抗鼠IgG抗体购自Sigma公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG抗体购自北京中杉金桥公司；邻苯二胺(OPD)购自哈尔滨博瑞生物技术有限公司；预染蛋白Marker购自Fermentas公司；SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒购于Southern Biotechnology公司。
[0034]3.实验动物[0035]6-8周龄BALB/c小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。
[0036]实施例1BTV-16VP2蛋白真核表达及纯化
[0037]1、引物设计
[0038]真核表达采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，根据GenBank中登录的BTV16的L2基因序列(JN671907)设计PCR扩增引物，BTV16L2-22F:5/ -ACGAATTCATGGAGGAGCTAGTTATACC-3/ (EcoR I) ；BTV16L2-2901R:5/ -CCGTCGACTTAAATATTTAGAAGCTTCGTG-3' (Sail)。
[0039]2、BTV-16VP2蛋白的真核表达载体构建及VP2蛋白的真核表达与纯化
[0040]首先利用引物BTV16L2-22F与BTV16L2-2901R扩增BTV-16 VP2基因(扩增片段大小为2896bp)，并进行胶回收。然后利用限制性内切酶EcoR I和Sal I对回收获得的VP2基因与杆状病毒的穿梭载体pFastBaC?HT A分别进行双酶切。利用T4DNA快速连接酶将已酶切的VP2基因和pFastBac?HT A进行连接，在DNA连接仪中25°C连接5min。将上述连接产物转化E.coli DH5a感受态细胞，37°C恒温倒置过夜培养。随机挑取单个菌落，分别接种到5mL LB液体培养基(Amp+ΙΟΟμ g/mL)中，37°C过夜培养。提取重组质粒进行初步筛选，空载体pFastBac?HT A作为阴性对照。对疑似重组质粒分别进行双酶切鉴定与PCR鉴定。将上述鉴定全部正确的含有阳性重组质粒的菌液进行测序，测序正确的重组质粒命名为 pFast_VP2。
[0041]将重组质粒pFast_VP2转化感受态细胞E.coli DHlOBac?，首先将_80°C保存的感受态细胞DHlOBac? (100 μ L)置于冰上融化；将重组质粒pFast_VP2 I μ L加入到融化的DHlOBac?中混匀，冰浴30min后迅速42°C热激60s，再冰浴5min。在超净台内向混合物中加入室温的无抗生素的SOC液体培养基900μ L，37°C震荡培养4h。将上述菌液分别做10倍、100倍稀释，将原倍、10倍以及100倍稀释的菌液各100 μ L分别涂板(LA-Bac平板即含50 μ g/mL卡那霉素、7 μ g/mL庆大霉素、10 μ g/mL四环素、100 μ g/mL X-gal和40 μ g/mL IPTG的LB固体培养基)上，37°C恒温倒置培养48h，然后进行蓝白斑筛选。随机挑选单个白色菌落划线培养接种到新的LA-Bac平板上做进一步的培养鉴定，挑取白色菌落分别接种至5mL含50 μ g/mL卡那霉素、7 μ g/mL庆大霉素、10 μ g/mL四环素的LB液体培养基中，同时挑取蓝色菌落作为阴性对照，37°C培养24h后分别提取重组杆粒与空杆粒。PCR鉴定正确的重组杆粒，命名为BAC-VP2，用于转染获得重组杆状病毒。
[0042]利用杆状病毒转染试剂Cellfectin Reagent，将重组杆粒BAC-VP2转染Sf9昆虫细胞，获得带有VP2基因的重组杆状病毒BACV-VP2，分别设立野生型杆粒转染与单独的转染试剂作为阴性对照。具体操作如下:
[0043](I)使用Sf9细胞铺板。六孔细胞培养板中每孔Sf9细胞(细胞活力在97%以上)
4.5X105个/mL，于27°C恒温培养箱中至少培养lh，使细胞完全贴壁。
[0044]( 2 )转染准备(每孔用量):
[0045]a:A液使用Sf9基础培养液(Grace粉(IXlL)I瓶、酵母提取物3.3g、水解乳蛋白
3.3g、碳酸氢钠(NaHC03) 0.35g)将I μ g重组杆粒BAC-VP2稀释至100 μ L中;
[0046]b:B液使用Sf9基础培养液将6 μ L Cellfectin Reagent转染试剂稀释至100μ L ；
[0047]c:Α液与B液混匀后，室温孵育15_45min。
[0048]对照组1:将I μ g野生型杆粒加入到100 μ L Sf9基础培养液中与B液混合；[0049]对照组2:只加入B液。
[0050](3)转染时，先弃掉细胞培养板中的原来的Sf9完全培养液，再用Grace基础培养液清洗细胞，2mL/次，共清洗2次。
[0051](4)将800 μ L Grace基础培养液加入到已孵育好的A液和B液的混合物中，然后混匀并将混合好的约ImL的脂类-DNA复合物加入到Sf9昆虫细胞培养板中。
[0052](5) 27°C恒温孵育5h，弃掉转染液，加入新的Sf9完全培养液(0.1%1000X双抗，10%胎牛血清(FBS)，89%Sf9昆虫细胞基础培养液)，3.0mL/孔，27°C下孵育72h或至病变出现。收获细胞培养上清即为一代重组杆状病毒。然后取一代重组杆状病毒继续接种Sf9昆虫细胞，摸索出最适合的Sf9昆虫细胞生长密度，最佳重组杆状病毒代次以及最适宜的收毒时间。
[0053]将重组杆状病毒感染的Sf9细胞沉淀经超声波裂解并进行SDS-PAGE电泳，结果显示重组BTV16 VP2蛋白在Sf9细胞中获得表达，分子质量约为llOku，与预期大小相符。使用Ni2+NTA树脂对VP2蛋白进行纯化，结果显示获得较纯的VP2蛋白(图1所示)。
[0054]实施例2单克隆抗体的制备
[0055]1.小鼠免疫
[0056]以通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达、纯化的BTV16 VP2重组蛋白免疫4只6周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫3次，每次免疫间隔两周，一免将重组VP2蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，二免和三免将重组VP2蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，免疫剂量为50 μ g/只，免疫途径为腹腔免疫。
[0057]分别在二免和三免后一周对小鼠进行断尾采血，分离血清(4 °C，1000Orpm,20min)，用间接ELISA检测抗体水平。在细胞融合前3天，对免疫效果好的BALB/c小鼠再进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射50 μ g免疫抗原(不加佐剂)。
[0058]2.细胞融合
[0059]融合前I天准备饲养细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取脾并分离脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞4: I的 比例用PEG进行细胞融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上。
[0060]3.阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆
[0061]利用通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达、纯化的BTV16 VP2重组蛋白建立间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的亚克隆，至少亚克隆3次，将亚克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。最终获得一株可以稳定分泌抗BTV16-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是=CGMCC N0.8153 ;并将其分泌的单克隆抗体命名为BTV16-3G10。
[0062]4.单克隆抗体的大量制备
[0063]给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射石蜡油，0.5mL/只，I周后腹腔注射IXio6个杂交瘤细胞，7~IOd后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽一次，将抽取的腹水10000r/min离心IOmin,去除上层油脂和沉淀,上清分装保存于_2(TC。
[0064]实施例3单克隆抗体的鉴定
[0065]1.单克隆抗体的亚类鉴定
[0066]按照SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒操作说明书对实施例I所得到的单克隆抗体进行亚类鉴定。
[0067]结果显示本发明单克隆抗体BTV16-3G10的重链为IgG1，轻链为κ链。
[0068]2.Western blot 试验
[0069]将接种有野生型杆状病毒的昆虫细胞裂解液，通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达、纯化的BTV16VP2重组蛋白，离心收获BTV16病毒上清后的细胞沉淀和BHK-21细胞沉淀处理后进行SDS-PAGE电泳，然后经电转印将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为18V电压30min ;用5%脱脂奶粉封闭液将转印后的硝酸纤维素膜4°C封闭过夜；加入单克隆抗体上清室温孵育lh，用PBST (含0.5mL/L吐温-20的pH7.4的PBS缓冲液)洗涤三次，再与4000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG抗体室温孵育lh，PBST洗涤3次后，用DAB显色试剂盒显色，扫描记录。
[0070]试验结果证实,本发明所制备的单克隆抗体BTV16-3G10能够与通过Bac_to_Bac杆状病毒表达系统表达、纯化的BTV16 VP2重组蛋白以及天然BTV16-VP2蛋白发生特异性反应，而不与对照组接种有野生型杆状病毒的昆虫细胞裂解液以及BHK-21细胞发生反应(图2)，同时根据本实验结果推测BTV16-3G10所识别的BTV16VP2蛋白B细胞表位应该是一个线性表位。
[0071]3.1FA 试验
[0072]应用IFA试验检测单克隆抗体BTV16-3G10与BTV16的反应性结果如图3所示。
[0073]实施例4 B细胞表位的鉴定
[0074]1.MBP融合短肽的表达及B细胞表位多肽的初步鉴定
[0075]为鉴定BTV16-3G10所识别的B细胞线性表位，我们根据BTV16 VP2蛋白的核苷酸序列(Gene Bank accessio`n n0.JN671907)设计合成87对互补的引物，每对引物编码16个氨基酸，相邻两对引物编码的氨基酸序列有5个氨基酸重叠区。87对引物所编码的氨基酸序列覆盖BTV16 VP2蛋白全长，将表达的87条MBP融合短肽分别命名为MBP-VP2-LMBP-VP2-2等等。所合成的引物经退火后通过EcoRI和SalI酶切位点分别连接到pMAL?-C4X质粒上，成功构建87个重组质粒。经测序鉴定正确后，将重组质粒分别转化到E.coli BL21感受态细胞中(DE3;N0Vagen，USA)，经鉴定转化成功后，将携带有重组质粒的大肠杆菌于LB/Amp培养基中培养至OD值为0.5-0.7，加入终浓度为0.5mM的IPTG，37°C继续培养6小时，以使蛋白充分表达。菌液9000g离心后(lOmin，4°C )进行超声破碎，通过SDS-PAGE和Western blot试验确定87条MBP融合短肽的成功表达。
[0076]将表达的87条MBP融合短肽作为包被抗原包被ELISA板，同时将MBP标签蛋白作为包被抗原对照，包被量均为IOOng/孔，通过间接ELISA试验初步鉴定BTV16-3G10所识别的表位区域。
[0077]结果显示BTV16-3G10 能与 MBP-VP2-4 (34EWSGHDVTEIPNR觀F49)发生特异性反应(图4)。进而将BTV16-3G10所识别的BTV16-VP2蛋白B细胞表位初步定位于34EWSGHDVTEIPNR觀F49，即 SEQ ID N0.1 所示。
[0078]3.B细胞表位的精确定位
[0079]利用肽扫描技术合成如下短肽(表1)，并对其进行间接ELISA检测，包被量为IOOng/孔，进而精确定位B细胞表位。
[0080]表1针对BTV16-3G10所合成的短肽[0081]
【权利要求】
1.一株分泌抗蓝舌病病毒血清16型(Bluetongue virus 16，BTV16) VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BTV16-3G10，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号为=CGMCC N0.8153，其所特异性识别的BTV16 VP2蛋白线性B细胞表位的氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.BTV16VP2蛋白线性B细胞表位多肽，其特征为:其氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示，所述表位多肽被权利要求2所述的单克隆抗体所识别。
4.权利要求1所述杂交瘤细胞株在制备诊断或预防蓝舌病病毒血清16型感染药物中的应用。
5.权利要求2所述单克隆抗体在制备诊断或预防蓝舌病病毒血清16型感染药物中的应用。
6.权利要求3所述BTV16VP2蛋白线性B细胞表位多肽在制备诊断蓝舌病病毒血清16型感染药物中的应用。`
【文档编号】C07K16/10GK103740650SQ201310652908
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】吴东来, 徐青元, 杨涛 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所