利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素的方法，包括如下步骤：将菌株接种到完全培养基的斜面上制成斜面种子；然后将斜面种子上的单菌落或孢子一次接种到摇瓶、一级种子培养基中进行培养；其次按照发酵罐体积的1～3%取一级种子接种于发酵罐内进行发酵得到一次发酵营养液；再将一次发酵营养液用膜过滤或离心分离的方式处理得到菌体，将所述菌体加入PBS缓冲液中，加酶混匀后进行高压匀浆得到细胞破碎混合液；然后将其用膜过滤或离心的方法处理得到粗蛋白液；再将粗蛋白液用梯度离心分离或两次超滤膜过滤，得到所述泛素及类泛素。该方法选用原料价格低廉，有效降低生产价格，且制备过程简单，可用于大规模生产。
【专利说明】利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】，特别涉及一种利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素的方法。
【背景技术】
[0002]泛素蛋白由76个氨基酸残基组成，其分子量约为8.5kDa，以“泛素”为名是因为它在生物体中广泛存在。泛素一个最主要的功能就是帮助清理细胞，标记需要分解掉的蛋白质，将受损、老化、凋零的细胞及蛋白质分解，以实现蛋白的再循环利用，对病变、损伤、衰老的细胞进行定位清除，使其被水解。
[0003]随着社会进步和经济发展，人们的生活节奏不断加快，对于保健品和保养品的需求也日益增多。虽然高科技医学治疗技术、诊断技术日新月异，但是却无法阻挡慢性病大量发生且快速蔓延的趋势。目前尚未发现有效药物或手术能够预防、消除甚至治疗任何慢性病。
[0004]通过泛素补充机体本身存在的再生修复因子，利用几乎所有组织器官中均存在的干细胞的自动再生修复功能，很方便的用自身生产的“原配件”自动修复或再造因任何病变、损伤而衰老的细胞和组织。进行自再生修复和复原，达到对病变、损伤、衰老细胞进行定位的新陈代谢，使生命环境复原。因此泛素及类泛素食品有助于治疗慢性疾病。
[0005]自1975年泛素在小牛胰脏中分离出来，目前国内外已对泛素及类泛素作用的机理、纯化、应用作了大量的研究。但是现在尚未见到利用发酵获得菌体蛋白提取生产泛素及类泛素的方法。
【发明内容】
[0006]为了解决现有泛素、类泛素`生产过程复杂、生产价格昂贵的技术问题，本发明提供了一种利用单细胞菌体蛋白提取泛素`及类泛素的方法，该方法选用原料价格低廉，有效降低生产价格，且制备过程简单，可用于大规模生产。
[0007]为此，本发明技术方案如下:
[0008]一种利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素的方法，包括如下步骤:
[0009]I)将菌株接种到完全培养基的斜面上，在28~37°C条件下培养2~5天，制成斜面种子；
[0010]2)将斜面种子上的单菌落或孢子在无菌条件下接种到摇瓶中，在28~37°C条件下培养12~48h，再将摇瓶内培养好的菌液转接到一级种子培养基中，在28~37°C条件下培养12~48h，得到一级种子；
[0011]3)按照发酵罐体积的I~3%取一级种子接种于发酵罐内，在28~37°C、起始pH=5.0~7.5的条件下进行培养，至菌体浓度达到最大值时停止发酵，得到一次发酵营养液；
[0012]4)将所述一次发酵营养液用孔径0.01~I μ m的陶瓷膜在0.05MPa~0.5MPa条件下进行过滤，收集第一截留物得到菌体，或者用离心机在4000~SOOOrpm条件下离心分离15~30min，收集沉淀得到菌体，再将所述菌体用无菌水洗涤2~3次；再进行离心分离，得到一级菌体；
[0013]5)将所述一级菌体置于磷酸盐缓冲液中制得菌悬液，向菌悬液中加入0.5~3wt%的酶，充分混合后静置0.5~2h，然后将其放入高压匀浆机，在85~95MPa条件下多次匀浆，得到细胞破碎混合液；
[0014]6)将细胞破碎混合液用0.01~I μ m的陶瓷膜在0.05~0.5MPa条件下过滤，收集滤过液得到粗蛋白液；或者用离心机在4000~8000rpm条件下离心分离15~30min,收
集上清液得到粗蛋白液；
[0015]7)将所述粗蛋白液利用5~20wt%的蔗糖梯度溶液在60000~80000rpm条件下进行4~6h梯度离心，收集浓度为5~10wt%蔗糖溶液带内的沉淀物即为所述泛素及类泛素；或者用截留分子量为14万的超滤膜过滤所述粗蛋白液，收集滤过液并将其用截留分子量为4000~12000的中性超滤膜过滤，收集第二截留物即得所述泛素及类泛素；
[0016]步骤I)中所述菌株为大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、丙酸杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、果糖芽孢杆菌、芽孢梭菌、微球菌、链球菌、明串珠菌、或对人体无致病作用的霉菌、放线菌和酵母菌，或原生生物中的藻类。
[0017]一种利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素粉的方法，包括如下步骤: [0018]I)将菌株接种到完全培养基的斜面上，在28~37°C条件下培养2~5天，制成斜面种子；
[0019]2)将斜面种子上的单菌落或孢子在无菌条件下接种到摇瓶中，在28~37°C条件下培养12~48h，再将摇瓶内培养好的菌液转接到一级种子培养基中，在28~37°C条件下培养12~48h，得到一级种子；
[0020]3)按照发酵罐体积的I~3%取一级种子接种于发酵罐内，在28~37°C、起始pH=5.0~7.5的条件下进行培养，至菌体浓度达到最大值时停止发酵，得到一次发酵营养液；
[0021]4)将所述一次发酵营养液用孔径0.01~I μ m的陶瓷膜在0.05MPa~0.5MPa条件下进行过滤，收集第一截留物得到菌体，或者用离心机在4000~SOOOrpm条件下离心分离15~30min，收集沉淀得到菌体，再将所述菌体用无菌水洗涤2~3次；再进行离心分离，得到一级菌体；
[0022]5)将所述一级菌体置于磷酸盐缓冲液中制得菌悬液，向菌悬液中加入0.5~3wt%的酶，充分混合后静置0.5~2h，然后将其放入高压匀浆机，在85~95MPa条件下多次匀浆，得到细胞破碎混合液；
[0023]6)将细胞破碎混合液用0.01~I μ m的陶瓷膜在0.05~0.5MPa条件下过滤，收集滤过液得到粗蛋白液；或者用离心机在4000~8000rpm条件下离心分离15~30min,收
集上清液得到粗蛋白液；
[0024]7)将所述粗蛋白液利用5~20wt%的蔗糖梯度溶液在60000~80000rpm条件下进行4~6h梯度离心，收集浓度为5~10wt%蔗糖溶液带内的沉淀物即为所述泛素及类泛素；或者用截留分子量为14万的超滤膜过滤所述粗蛋白液，收集滤过液并将其用截留分子量为4000~12000的中性超滤膜过滤，收集第二截留物即得所述泛素及类泛素；
[0025]8)将所述泛素及类泛素置于喷雾干燥机内，在进口温度120~150°C、出口温度62~73°C条件下进行喷雾干燥，得到所述泛素及类泛素粉；
[0026]步骤I)中所述菌株为大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、丙酸杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、果糖芽孢杆菌、芽孢梭菌、微球菌、链球菌、明串珠菌或对人体无致病作用的霉菌、放线菌和酵母菌，或原生生物中的藻类。
[0027]步骤I)中所述完全培养基为麦芽汁培养基、肉汤培养基或综合马铃薯培养基。
[0028]步骤3)中所述发酵罐中发酵培养基的成分为植物副产品、工业废液或植物纤维素；所述植物副产品为糖渣、果渣、淀粉渣、饼柏或油脂废渣；所述工业废液为酿酒工业副广品、淀粉工业副广品、味精工业副广品、朽1fefe工业副广品、造纸废液、味精废液、?腐废水、甘蔗糖蜜废液、有机废水或啤酒混合废液；所述植物纤维素为植物秸杆、植物的果实、叶、皮、壳或芯。
[0029]步骤5)中加入的酶为酵解酶、溶菌酶、蜗牛酶和破壁酶中的任意一种或任意几种以任意比的混合物。
[0030]所述梯度离心的介质为浓度为5、7.5、10、12.5、12、15、17.5、20wt%的蔗糖梯度溶 液。
[0031]步骤3)中判断菌体浓度达到最大值的方法是利用紫外分光光度计在600nm时测得的吸光度值最大时对应的浓度或者目测菌丝量最大时对应的浓度。
[0032]所述培养基、摇瓶和发酵罐使用前均在115~121°C条件下灭菌15~25min。
[0033]所述摇瓶、一级种子培养基中含3wt%的葡萄糖，2wt%的可溶性淀粉，lwt%的酵母膏，0.lwt%的磷酸二氢钾和0.06wt%的硫酸镁。
[0034]所述磷酸盐缓冲液配置方法为:将0.8wt%的NaCl、0.02wt%的KCl、0.36wt%的Na2HPO4.12H20、0.024wt%的KH2PO4溶于余量水中，用盐酸调节溶液pH=7.4，灭菌后常温保
存备用。
[0035]所述发酵罐中发酵培养基的成分为植物副产品、工业废液或植物纤维素；所述植物副产品指糖渣、果渣、淀粉渣、饼柏或油脂废渣；所述工业废液指酿酒工业副产品、淀粉工业副广品、味精工业副广品、朽1fefe工业副广品、造纸废液、味精废液、?腐废水、甘庶糖蜜废液、有机废水、啤酒混合废液；所述植物纤维素为植物秸杆，植物果实、叶、皮、壳、芯。
[0036]本发明具有以下有益效果:
[0037]①在原料的选取方面，利用低廉的植物及更低廉的农业副产品废渣，如糖渣、果渣、淀粉渣、饼柏、油脂废渣等；工业废液，如酿酒工业副产品、淀粉工业副产品、味精工业副产品、柠檬酸工业副产品、造纸废液、味精废液、豆腐废水、甘蔗糖蜜废液、有机废水、啤酒混合废液等。除此外还有植物纤维素如植物秸杆，果实、皮、壳、芯、林业废弃物；微型藻类，如螺旋藻小球藻等单细胞藻类为单细胞蛋白的生产原料，节省了成本的同时实现了生产的产业链。
[0038]②利用微生物菌体蛋白为原料提取泛素及类泛素，避免了在泛素及类泛素生产过程中引入不安全因素，同时克服了目前泛素及类泛素的成本昂贵、限制性、生产过程复杂、安全性不高、适用范围极为有限等缺点。【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为标准蛋白质的吸收曲线；
[0040]图2为标准品进样体积与对应分子量的数量关系标准曲线；
[0041]图3为实施例1产品的吸光度-进样量曲线。
【具体实施方式】 [0042]以下结合实施例对本发明的方法进行详细描述。
[0043]实施例1
[0044]利用酿酒酵母提取泛素及类泛素的方法，包括如下步骤:
[0045]I)将IOwt%麦芽汁，2wt%琼脂和88wt%水，pH值自然制成斜面培养基，将酿酒酵母菌株接种到斜面培养基的斜面上在30°C条件下培养5天，制成斜面种子；
[0046]2)将斜面种子上的单菌落在无菌条件下接种到摇瓶内，摇瓶内的培养基成分为:3wt%的葡萄糖，2wt%的可溶性淀粉，lwt%的酵母膏，(λ lwt%的KH2PO4,0.06wt%的MgSO4.7H20和93.84wt%的水，在32°C条件下进行摇瓶培养24h，再将摇瓶内培养好的菌液转接到一级种子培养基中，一级种子培养基的成分与摇瓶内的培养基相同，在32°C进行培养24h后得到一级种子。
[0047]3)2L取一级种子接种于100L的发酵罐内，该发酵罐内发酵培养基为含有
0.39g/100mL硫酸镁、0.39g/100mL磷酸二氢钾和0.69g/100mL过磷酸钙的甘蔗糖蜜废液，在32°C、起始pH=5.5的条件下进行培养，当菌体浓度达到最大值时停止发酵，即在600nm时测得的吸光度值最大时停止发酵，得到一次发酵营养液；
[0048]4)将所述一次发酵营养液在5000rpm条件下离心30min,收集沉淀得到酵母菌体，再将酵母菌体用无菌水洗涤2次，离心分离得到一级菌体；
[0049]5)将所述一级菌体置于PBS缓冲液中制得菌悬液，再向其中加入lwt%的酵解酶，充分混合后静止0.5h，再将其放入高压匀浆机在95Mpa下匀浆4次，得到细胞破碎混合液；
[0050]6)将细胞破碎混合液置于离心机内，在5000rpm条件下离心30min，收集上清液得到粗蛋白液；
[0051]7)将粗蛋白液利用浓度为5、7.5、10、12.5、12、15、17.5、20wt%的蔗糖溶液进行梯度离心分离，离心转速为60000rpm，离心时间为6h ;收集浓度为5~10被％蔗糖溶液带内的沉淀物，即得所述泛素、类泛素。
[0052]为了利用所述泛素、类泛素制备其它产品，还可将其在进口温度为120°C、出口温度为73°C的条件下在喷雾干燥机内进行喷雾干燥得到泛素、类泛素粉。
[0053]利用凝胶排阻色谱法测得最终制得粉体产品中泛素、类泛素蛋白含量高于80wt%。
[0054]利用凝胶排阻色谱分离法测定泛素、类泛素粉中的蛋白含量。
[0055]称量胰蛋白酶(M=23300)、溶菌酶(M=14400)、牛胰岛素(M=5700)标准品各5.0mg,将其溶解于ImL流动相中，用微量进样器向葡聚糖G50柱进样50 μ L标准品混合液，待其进入凝胶床后，用洗脱液洗脱并收集洗脱液。流速3mL/10min,每IOmin接I管(3mL)。在280nm下测其吸光度。以洗脱液体积为横坐标，吸光值为横坐标，绘制标准蛋白质的吸收曲线，确定标准蛋白峰值所对应的洗脱液体积，如图1所示。[0056]再以此洗脱体积为横坐标，蛋白质标准品相应分子量对数值为纵坐标作图，绘制1gM-V标准曲线，采用一元线性回归法求分予量对数值与洗脱液体积的关系式。从而得到图2所示的标准品分子量分布曲线。
[0057]实验条件:
[0058]柱径:2cm填料高度:30cm
[0059]检测波长:280nm流速:3.0mL/1Omin
[0060]温度:室温18 °C 进样量:50ml
[0061]洗脱液:50mmol/L三羟甲基氨基甲烷/HCI+0.lmol/L氯化钠(pH=8.0)
[0062]准确称量实施例1得到的蛋白粉(以酵母为原料提取为例)，溶于一定体积的流动相中。按绘制标准曲线的方法进样，每IOmin接I管，在280nm下测定吸光度，绘制吸光度-进样量曲线，结果如图3所示。
[0063]从图3可看出蛋白质的分子量基本分布在12000D到4000D之间，表明该发明达到了提取泛素及类泛素的目标。
[0064]取实施例1制得产品进样测定，记录色谱图，把保留时间代入标准曲线，从中可知4000Da〈Mr〈12000Da 可达到 80% 以上。
[0065]实施例2
[0066]本实例提供一种米曲霉泛素及类泛素的提取方法，具体为:`[0067]I)将马铃薯汁 20wt%、葡萄糖 2wt%、KH2PO40.3wt %、MgSO4 7H2O0.15wt%、琼脂
1.5wt%, pH=6制成斜面培养基，将米曲霉菌株接种到斜面培养基的斜面上在28°C条件下培养5天，观察是否有杂菌长出，制成斜面种子；
[0068]2)将斜面种子上的孢子在无菌条件下接种到摇瓶内，摇瓶内的培养基成分为:3wt % 葡萄糖，2wt % 可溶性淀粉，Iwt % 酵母膏，0.1wt % KH2PO4,0.06wt % MgSO4.7H20 和93.84wt%的水，在30°C条件下进行摇瓶培养48h，再将摇瓶内培养好的菌液转接到一级种子培养基中，一级种子培养基的成分与摇瓶内培养基相同，在30°C条件下进行培养48h后得到一级种子。
[0069]3) 2L取一级种子接种于100L发酵罐内，该发酵罐内发酵培养基为含有
0.39g/100mL硫酸镁、0.39g/100mL磷酸二氢钾和0.69g/100mL过磷酸钙的糖渣、啤酒混合废液，在30°C、起始pH=5.5的条件下进行培养，当菌体浓度达到最大值时停止发酵，取10毫升待测培养液放在有刻度的离心管中，设定离心时间为5min，转速为5000rpm，离心分离，收集上清液测其菌丝体积，直至菌丝体积不再增加时，停止发酵，得到一次发酵营养液；
[0070]4)将一次发酵营养液在5000rpm条件下离心30min,收集沉淀得到米曲霉并将其用无菌水洗涤2次，收集分离后沉淀得到一级菌体；
[0071]5)将所述一级菌体置于PBS缓冲液中制得菌悬液，再向其中加入lwt%的溶菌酶，充分混合后再将其放入高压匀浆机在95Mpa下匀浆4次，得到细胞破碎混合液；
[0072]6)将细胞破碎混合液置于离心机内，在5000rpm条件下离心30min，收集上清液得到粗蛋白液；
[0073]7)将粗蛋白液利用浓度为5、7.5、10、12.5、12、15、17.5、20wt%的蔗糖溶液进行梯度离心分离，离心转速为60000rpm，离心时间为6h ;收集浓度为5~10被％蔗糖溶液带内的沉淀物，即得所述泛素、类泛素。[0074]为了利用所述泛素、类泛素制备其它产品，还可将其在进口温度为120°C、出口温度为73°C的条件下在喷雾干燥机内进行喷雾干燥得到泛素、类泛素粉。
[0075]利用凝胶排阻色谱法测得最终制得粉体产品中泛素、类泛素蛋白含量高于80wt%。
[0076]实施例3
[0077]本实例提供一种乳酸菌及类泛素的提取方法，具体为:
[0078]I)将0.5wt%蛋白胨、3wt%牛肉膏、0.5wt % NaCl> 1.5wt%琼脂和余量水，制成pH=7.2的斜面培养基，将乳酸菌菌株斜面培养基的斜面上，在37°C条件下培养2天，观察是否有杂菌长出，制成斜面种子；
[0079]2)将斜面种子上的单菌落在无菌条件下接种到摇瓶内，摇瓶内的培养基成分为:3界七％葡萄糖，2wt%可溶性淀粉，1￥丨％酵母膏，0.lwt%KH2P04,0.06wt%MgS04.7H20和余量水，在37°C条件下进行摇瓶培养18h，再将摇瓶内的培养好的菌液转接到一级种子培养基中，一级种子培养基的成分与摇瓶内培养基相同，在37°C条件下培养18h,得到一级种子；
[0080]3)取3L —级种子接种于100L发酵罐内，该发酵罐内发酵培养基为含有
0.39g/100mL硫酸镁、0.39g/100mL磷酸二氢钾和0.69g/100mL过磷酸钙的植物油脂提取的生产废液；在32°C，起始pH=6.0的条件下进行培养，至菌体浓度达到最大值时停止发酵，即在600nm时测 得的吸光度值最大时停止发酵，得到一次发酵液。
[0081]4)将所述一次发酵液在5000rpm条件下离心30min,收集沉淀得到乳酸菌菌体,再将所述乳酸菌菌体用无菌水洗涤2次，离心分离得到一级菌体；
[0082]5)将所述一次菌体悬浮于PBS缓冲液中，加入占其质量lwt%的溶菌酶，充分混合后，放入高压匀浆机在95Mpa条件下匀浆3次，得到细胞破碎混合液；
[0083]6)将细胞破碎混合液置于离心机，在5000rpm下离心30min，收集上清液得到粗蛋白液；
[0084]7)将所述粗蛋白液先通过分子量为14万的超滤膜，然后收集分子量小于14万的滤过液，再将滤过液用截留分子量为4000~12000的中性超滤膜过滤并收集截留物，即得所述泛素、类泛素。
[0085]为了利用所述泛素、类泛素制备其它产品，还可将其在进口温度为120°C、出口温度为73°C的条件下在喷雾干燥机内进行喷雾干燥，得到泛素、类泛素粉。
[0086]利用凝胶排阻色谱法测得最终制得粉体产品中泛素、类泛素蛋白含量高于80wt%。
【权利要求】
1.一种利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素的方法，其特征在于:包括如下步骤: 1)将菌株接种到完全培养基的斜面上，在28~37°C条件下培养2~5天，制成斜面种子; 2)将斜面种子上的单菌落或孢子在无菌条件下接种到摇瓶中，在28~37°C条件下培养12~48h，再将摇瓶内培养好的菌液转接到一级种子培养基中，在28~37°C条件下培养12~48h,得到一级种子； 3)按照发酵罐体积的1~3%取一级种子接种于发酵罐内，在28~37°C、起始pH=5.0~.7.5的条件下进行培养，至菌体浓度达到最大值时停止发酵，得到一次发酵营养液； 4)将所述一次发酵营养液用孔径0.01~1 μ m的陶瓷膜在0.05MPa~0.5MPa条件下进行过滤，收集第一截留物得到菌体，或者用离心机在4000~8000rpm条件下离心分离15~30min,收集沉淀得到菌体，再将所述菌体用无菌水洗涤2~3次；再进行离心分离，得到一级菌体； 5)将所述一级菌体置于磷酸盐缓冲液中制得菌悬液，向菌悬液中加入0.5~3wt%的酶，充分混合后静置0.5~2h，然后将其放入高压匀浆机，在85~95MPa条件下多次匀浆，得到细胞破碎混合液； 6)将细胞破碎混合液用0.01~1 μ m的陶瓷膜在0.05~0.5MPa条件下过滤，收集滤过液得到粗蛋白液；或者用离心机在4000~8000rpm条件下离心分离15~30min,收集上清液得到粗蛋白液； 7)将所述粗蛋白液利用5~20wt%的蔗糖梯度溶液在60000~80000rpm条件下进行4~6h梯度离心，收集浓度为5~10wt%蔗糖溶液带内的沉淀物即为所述泛素及类泛素；或者用截留分子量为14万的超滤膜过滤所述粗蛋白液，收集滤过液并将其用截留分子量为4000~12000的中性超滤膜过滤，收集第二截留物即得所述泛素及类泛素； 步骤I)中所述菌株为大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、丙酸杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、果糖芽孢杆菌、芽孢梭菌、微球菌、链球菌、明串珠菌或对人体无致病作用的霉菌、放线菌和酵母菌，或原生生物中的藻类。
2.一种利用单细胞菌体蛋白提取泛素及类泛素粉的方法，其特征在于:包括如下步骤: 1)将菌株接种到完全培养基的斜面上，在28~37°C条件下培养2~5天，制成斜面种子; 2)将斜面种子上的单菌落或孢子在无菌条件下接种到摇瓶中，在28~37°C条件下培养12~48h，再将摇瓶内培养好的菌液转接到一级种子培养基中，在28~37°C条件下培养12~48h,得到一级种子； 3)按照发酵罐体积的1~3%取一级种子接种于发酵罐内，在28~37°C、起始pH=5.0~.7.5的条件下进行培养，至菌体浓度达到最大值时停止发酵，得到一次发酵营养液； 4)将所述一次发酵营养液用孔径0.01~1 μ m的陶瓷膜在0.05MPa~0.5MPa条件下进行过滤，收集第一截留物得到菌体，或者用离心机在4000~8000rpm条件下离心分离15~30min，收集沉淀得到菌体，再将所述菌体用无菌水洗涤2~3次；再进行离心分离，得到一级菌体；5)将所述一级菌体置于磷酸盐缓冲液中制得菌悬液，向菌悬液中加入0.5~3wt%的酶，充分混合后静置0.5~2h，然后将其放入高压匀浆机，在85~95MPa条件下多次匀浆，得到细胞破碎混合液； 6)将细胞破碎混合液用0.01~I μ m的陶瓷膜在0.05~0.5MPa条件下过滤，收集滤过液得到粗蛋白液；或者用离心机在4000~8000rpm条件下离心分离15~30min,收集上清液得到粗蛋白液； 7)将所述粗蛋白液利用5~20wt%的蔗糖梯度溶液在60000~80000rpm条件下进行4~6h梯度离心，收集浓度为5~10wt%蔗糖溶液带内的沉淀物即为所述泛素及类泛素；或者用截留分子量为14万的超滤膜过滤所述粗蛋白液，收集滤过液并将其用截留分子量为4000~12000的中性超滤膜过滤，收集第二截留物即得所述泛素及类泛素； 8)将所述泛素及类泛素置于喷雾干燥机内，在进口温度120~150°C、出口温度62~73°C条件下进行喷雾干燥，得到所述泛素及类泛素粉； 步骤I)中所述菌株为大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、丙酸杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、果糖芽孢杆菌、芽孢梭菌、微球菌、链球菌、明串珠菌或对人体无致病作用的霉菌、放线菌和酵母菌，或原生生物中的藻类。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤I)中所述完全培养基为麦芽汁培养基、肉汤培养基或综合马铃薯培养基。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤3)中所述发酵罐中发酵培养基的成分为植物副产品、工业 废液或植物纤维素； 所述植物副产品为糖渣、果渣、淀粉渣、饼柏或油脂废渣； 所述工业废液为酿酒工业副产品、淀粉工业副产品、味精工业副产品、柠檬酸工业副产品、造纸废液、味精废液、豆腐废水、甘蔗糖蜜废液、有机废水或啤酒混合废液； 所述植物纤维素为植物秸杆、植物的果实、叶、皮、壳或芯。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤5)中加入的酶为酵解酶、溶菌酶、蜗牛酶和破壁酶中的任意一种或任意几种以任意比的混合物。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述梯度离心的介质为浓度为5、7.5、10、12.5、12、15、17.5、20wt% 的蔗糖梯度溶液。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤3)中判断菌体浓度达到最大值的方法是利用紫外分光光度计在600nm时测得的吸光度值最大时对应的浓度或者目测菌丝量最大时对应的浓度。
8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述培养基、摇瓶和发酵罐使用前均在115~121 °C条件下灭菌15~25min。
【文档编号】C07K14/39GK103695507SQ201310652572
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】赵金梁, 赵发 申请人:天津替代医学科技有限公司