适用于时间分辨荧光免疫法的加样方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于时间分辨巧光免疫分析技术领域，尤其设及适用于时间分辨巧光免疫 法的加样方法。
【背景技术】
[0002] 时间分辨巧光免疫分析法测定样本中物质的含量时，其步骤通常包括：
[0003] 1)加样:在容器中将标记物与缓冲液混合均匀，配制标记物工作液;然后将样本加 入固相载体包被反应板中，向每孔中加入配制好的标记物工作液；
[0004] 2)反应板在室溫下，缓慢振荡解育；
[0005] 3)用上述的工作洗涂液洗板，拍干；
[0006] 4)向每孔中加入增强液;将抗体固相载体于室溫下缓慢振荡后检测。
[0007] 其中，第一步的加样方法至关重要，影响着测定结果的准确性和稳定性。对于目前 的加样方法来说，为了使标记物充分与样本的待测物质结合，尽可能提高样本的分析准确 性，通常将标记物通过缓冲液稀释至较低浓度，然后向固相载体包被反应板加入多于1〇化1 体积的标记物工作液。
[000引运种的操作方法由于多种试剂均需要由操作者在每次检测前配制，必须增加因加 样引起的误差和由于操作者不同操作或操作批次不同所造成的误差。另一方面，由于参与 反应的各种试剂及缓冲液之间常常会发生某种化学反应，或者是某些试剂与缓冲液配制到 说明书要求的工作浓度后，影响测定结果的稳定性，因此不能在操作前将待加样试剂和缓 冲试剂混合保存。同时，由于引入了一个中间容器，运样的加样方法不但操作繁琐，更使操 作时间延长，而且增加了引入污染的可能性，往往导致反应产生假阳性或假阴性结果，造成 实验失败。
【发明内容】
[0009] 为了解决现有技术中存在的上述问题，降低各实验室之间关于同一检验和/或实 验因不同操作者甚至同一操作者不同批次操作造成的上述误差，提高实验结果的精确度、 可信性W及实验的反应时间，本发明提供了一种适用于时间分辨巧光免疫分析的加样方 法。
[0010] 本发明采用的技术方案为:一种适用于时间分辨巧光免疫法的加样方法，包括:将 样本加入固相载体包被反应板中，向每孔中加入缓冲液，然后加入标记物工作液，所述标记 物工作液的浓度允许在所述缓冲液与标记物工作液的体积均不大于50化时与固相载体充 分结合。
[0011] 优选地，所述样本中的待测物质为甲胎蛋白、新生儿促甲状腺激素、风疹病毒IgM、 弓形虫IgM、巨细胞病毒IgM和单纯瘤疹病毒IgM中的至少一种。
[001^ 优选地，当所述样本中的待测物质为甲胎蛋白时，所述加样方法为:将样本加入固 相载体包被反应板中，向每孔中加入20~30化缓冲液，然后加入3~化L标记物工作液;其 中，所述标记物工作液通过将甲胎蛋白单克隆抗体与铜系元素离子馨合物按5:1~5的质量 比混合制得母液，再将母液用缓冲液稀释200~300倍而成。
[0013] 更优选地，所述缓冲液的制备方法为：在含O.Olg/L的乙二胺四乙酸二钢的 50mmol/L、pH7.8的Tris-Hcl溶液中加入10.Oml/L~200.Oml/L的小牛血清、牛丫-球蛋白和 鼠IgG中的至少一种。
[0014] 优选地，当所述样本中的待测物质为新生儿促甲状腺激素时，所述加样方法为:将 样本加入固相载体包被反应板中，向每孔中加入40~50化缓冲液，然后加入40~50化标记 物工作液;其中，所述标记物工作液通过将促甲状腺激素单克隆抗体与铜系元素离子馨合 物按10:5~10的质量比混合制得母液，再将母液用缓冲液稀释300~400倍而成。
[0015] 更优选地，所述缓冲液的制备方法为：在含O.Olg/L的乙二胺四乙酸二钢的 50111111〇1/1、口^.8的时13-化1溶液中加入10.01111/1~200.01111/1的小牛血清、1'讯661140和鼠 IgG中的至少一种。
[0016] 优选地，当所述样本中的待测物质为新生儿风疹病毒IgM时，所述加样方法为:将 样本加入固相载体包被反应板中，再立即向每孔中加入20~30化生物素化抗原，解育5~ lOmin，再向每孔中加入20~30化缓冲液，然后加入20~30化标记物工作液;其中，所述标记 物工作液通过将链霉亲和素与铜系元素离子馨合物按1:1~5的质量比混合制得母液，再将 母液用缓冲液稀释500~1000倍而成。
[0017] 更优选地，所述缓冲液的制备方法为：在含O.Olg/L的乙二胺四乙酸二钢的 50mmol/L、pH7.8的Tris-Hcl溶液中加入10.Oml/L~200.Oml/L的小牛血清和鼠IgG中的至 少一种。
[0018] 目前，人们普遍认为若标记物不经过缓冲液在中间容器中稀释，直接加入标记物， 再加入缓冲液运样的做法在较小的体积用量下，是无法保证标记物与缓冲液充分混合的， 从而无法实现短时间内准确检测待测物质的目的。若使用现有的方法通过提高标记物的浓 度来提高反应速度，则无法保证校准品背景的巧光值小于等于2000,从而根据此方法制得 的试剂盒无法满足质量要求。本发明通过巧妙的选择标记物工作液的浓度及使用体积等参 数，不仅可W实现在较小的体积用量下，通过"直接加入标记物，再加入缓冲液"运样的操作 实现短时间内准确检测待测物质的目的，同时根据此方法制得的试剂盒还可W在满足质量 要求的条件下，节省标记物的用量(不是体积，而是体积和浓度换算后的质量）。
[0019] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0020] 本发明的适用于时间分辨巧光免疫法的加样方法免除了中间容器混合缓冲液与 标记物的步骤，操作简单、方便，减小了引入污染的可能性，有效降低了各实验室之间关于 同一检验和/或实验因不同操作者甚至同一操作者不同批次操作造成的上述误差，提高实 验结果的精确度、可信性，由于标记物工作液中的标记物浓度增加，可显著缩短反应时间。
[0021] 根据本发明的适用于时间分辨巧光免疫法的加样方法可制备快速型的试剂盒，而 且试剂盒中标记物的用量相对于现有的试剂盒更少。本发明的方法尤其适用于全自动仪器 上使用。
【具体实施方式】
[0022] 为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明 作进一步说明。
[0023] 实施例1
[0024]本发明适用于时间分辨巧光免疫分析的加样方法在测定甲胎蛋白中的应用
[0025] 1)产前筛查甲胎蛋白（AFP)快速测定试剂盒
[0026] 甲胎蛋白快速测定试剂盒里的主要组分：（1)固相载体；（2)铜系元素标记物工作 液，4ml/瓶(直接加入微孔板）；（3)缓冲液，4ml/瓶(直接加入微孔板）；（4)校准品，1.5ml/ 瓶;（5)浓缩洗液W及(6)增强液；
[0027] 固相载体的制备方法:将AFP单克隆抗体用包被缓冲液(可W使用50mmol/L，pH9.6 的碳酸缓冲液、20mmo1/L，pH4.5的憐酸盐缓冲液、50mmol/L，pH7.8的TriS-HC1缓冲液或 5〇111111〇1/1，口略5的巧樣酸盐缓冲液)稀释至最适浓度，在固相上进行包被，将固相洗涂1次， 然后再用封闭液进行封闭，将固相甩干，惊干，真空包装，2~8°C保存备用；
[002引所述铜系元素标记物为Eu3+-N2-[P-异氯酸-苄基]-二乙締Ξ胺四乙酸钢标记AFP单克隆抗体，所述铜系元素标记物工作液的制备方法如下：
[00巧]按照化标记试剂盒说明书操作。将1 .Omg的AFP单克隆抗体加入Millipore公司的 带有滤膜的离屯、管中，l〇〇〇〇r/min离屯、5~6min，再用标记缓冲液重复洗涂6次，将处理得到 的20化LAFP单克隆抗体加入到l.Omg的预先用标记缓冲液溶解的Eu3+标记试剂充分混匀，2 ~8°C振荡解育72h。反应液经分别用50mmol/L抑7.80Tris-HCl缓冲液平衡的S邱harose 化-6B柱（lcmX40cm)层析，分别A280监测收集第一峰中的洗脱液;将洗脱液用缓冲液稀释 240倍即得所述铜系元素标记物工作液；
[0030] 缓冲液为在含O.Olg/L的乙二胺四乙酸二钢的50mmol/L、pH7.8的Tris-Hcl溶液中 加入10.Oml/L~200.Oml/L的小牛血清、牛丫 -球蛋白或鼠IgG;
[0031] 校准品的制备方法为：WWH01#InternationalS化ndand(72/225)，将甲胎蛋白用 含有lOg/LBSA的50mmol/L，pH7.8的Tris-HCl缓冲液分别稀释成0，1.0，10.0，30.0，100.0， 500.0u/ml〇
[0032] 浓缩洗液为在含0.385mol/L化Cl，0.124mol/L、抑7.8的Tris-Hcl缓冲液中加入 1.Oml/L~10.Oml/L的Tween-20;
[0033] 增强液为在含有lml/LTritonX-100、0.1mol/L邻苯二甲酸氨钟-冰醋酸溶液中加 入1~5mg/U3-糞甲酯Ξ氣丙酬、15~30mg/L的Ξ正辛基氧化憐。
[0034] 2)使用甲胎蛋白快速测定试剂盒测定甲胎蛋白
[0035] W本实施例中制备的产前筛查甲胎蛋白快速测定试剂盒采用时间分辨巧光免疫 分析法测定甲胎蛋白的具体操作如下：