专利名称：一种预测肝移植术后受者急性排斥发生风险的引物及方法
技术领域：
本发明涉及肝移植监测技术领域，尤其涉及一种预测肝移植术后受者急性排斥发生风险的引物及方法。
背景技术：
肝脏移植是终末期肝脏疾病的最有效的治疗方案之一，肝移植术后受者面临着严重的移植物急性排斥风险。近年来得益于术后免疫抑制剂广泛应用以及新型免疫抑制剂面世，全球肝移植中心平均急性排斥发生率约为15%至45%。
移植受者与供者间的遗传差异是移植物排斥反应主要诱因，来自免疫系统的T淋巴细胞在排斥反应中发挥重要作用。急性排斥反应的病理学判断的重要标准就是移植肝汇管区中出现大量单核的炎性细胞浸润。急性排斥过程中抗原递呈细胞表面的B7家族蛋白与T细胞表面的配体作用，启动T细胞内的信号改变，调控T细胞的免疫活性；宿主T细胞一旦激活后，T细胞开始发生克隆增殖、分化为效应细胞、迁移至移植物并加速移植物功能丧失。研究表明共刺激分子如B7家族蛋白，可作为抗移植物排斥的重要治疗靶点。从蛋白结构特点来分析B7蛋白属于IgG超家族，通常表达在APC细胞表面。目前研究得比较透彻的B7蛋白为B7-1和B7-2 (即⑶80和⑶86)，这两个B7蛋白可结合不同的T细胞胞膜蛋白，发挥免疫共刺激或共抑制作用。例如当B7-1或B7-2与T细胞表面的CD28结合时能够传递共刺激信号，而与另一个配体CTLA-4结合时能够传递共抑制信号。已有研究表明B7-H3可作为共刺激因子促进⑶4+和⑶8+细胞增殖、IFN- Y分泌以及CD8+细胞毒活性。小鼠异基因型心脏移植模型研究表明，移植后的B7-H3基因敲除小鼠和对照组都发生排斥现象，但是对受者施用诸如环孢素A和雷帕鸣等免疫抑制剂后，B7-H3基因敲除小鼠的慢性排斥发生率显著下降。此外B7-H3还表现出负向调节T淋巴细胞的能力，如抑制T细胞活化和细胞因子分泌等。一般认为T细胞表面既有B7-H3共刺激配体，也具有共抑制配体，而TLT-2被认为是B7-H3的免疫共刺激作用的配体。医学领域期盼着个体化治疗的建立及应用，在器官移植领域中个体化的免疫抑制方案也日益受到医疗工作者的关注。各种生物科学技术，如基因表达芯片、蛋白质组、质谱分析及全基因组相关性分析等手段正揭示着大量的分子标志物(包括mRNA、miRNA、蛋白、小分子化学物质以及SNP、SSR、L0H和CNV等遗传标签)。这些标志物往往参与着各种生理生化过程，可指示疾病诊断、分期以及临床反应、预后等。患者彼此间的遗传特性决定了各种生理差异，促使医疗工作者能够通过病患的遗传特性及时预判移植物排斥反应，并在机体组织发生不可逆转损伤前进行干预。此外以上所述的各类标志物皆可通过客观手段进行有效测定，避免了主观判断。研究表明细胞因子和共刺激分子的SNP与多种实体器官移植术后的急性排斥的发生相关，但是相关研究的发现并未近一步加强鉴别移植受者急性排斥风险，以及建立一套可定性定量的急排危险鉴定模型，使受者获得合理的免疫抑制治疗。
发明内容
本发明提供了一种预测肝移植术后受者急性排斥发生风险的引物，利用该引物可以扩增B7-H3基因SNP位点(rs2127015)及检测其基因型。一种预测肝移植术后受者急性排斥发生风险的引物，包括一对PCR扩增引物和用于对扩增片段测序的延伸引物，其中PCR扩增弓丨物包括正向引物GGGAAATAACCAGTITTATggggaaga；反向引物TGCATTTTCAAAACCCCagtga； 其中，延伸引物为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAGATCGATAATCTTGT TCTTAATCC。本发明还提供了一种预测肝移植术后受者急性排斥发生风险的方法，包括(I)检测受者B7-H3基因单碱基突变位点rs2127015的基因型；(2)检测受者是否感染HBV ；(3)计算受者急性排斥发生风险指数A ；A = -1. 122+1. 493XB+0. 817XC其中，当所述基因型为T/T和C/T时，B = 1，当所述基因型为C/C时，B = O ;如受者已感染HBV，C = 1，如受者未感染，C = O。3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)为(a)从受者外周血中提取基因组DNA ；(b)以基因组DNA为模板，利用引物对a进行PCR扩增，收集扩增产物；(c)利用延伸引物b对扩增产物进行测序，确定B7-H3基因单碱基突变位点rs2127015的基因型；弓丨物对a 的正向引物为GGGAAATAACCAGTTTTATggggaaga ；弓丨物对a 的反向引物为TGCATTTTCAAAACCCCagtga ；延伸引物b为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAGATCGATAATCTTGT TCTTAATCC。本发明设计的弓I物特异性好，能有效扩增rs2127015位点周围的DNA片段，通过延伸引物可以对扩增产物进行正确测序，确定rs2127015位点的基因型。本发明方法操作简单，预测受者发生急性排斥的型敏感性达为69. 8%，特异性未54. 7%。
图1为B7-H3和TLT-2基因单核苷酸多态性位点检测引物表。图2为B7-H3和TLT-2基因单核苷酸多态性与移植肝急性排斥发生的相关性分析表。图3为B7-H3和TLT-2基因单倍型分析图，SNPl至SNPll分别代表rsl 1072431、rsll574495、 rsl2593558、 rsl2594627、 rs2127015、 rs3816661、 rs7176654、 rs4714431、rs6915083、rs7754593 和 rs9394767。
图4为B7-H3和TLT-2基因单倍型与移植肝急性排斥发生的相关性分析表。图5为移植受者原发病与急性排斥发生的相关性分析表。图6为本发明急排风险预测模型的AUROC分析图；实线表示ROC曲线，虚线为参照线。
具体实施例方式一、人群选择共入组患者388名，其中341名男性、47名女性、年龄21至69岁。在回顾性研究中入组患者299名，为2006至2009年进行肝脏移植手术受者。前瞻性研究中入组受者89名，为2010至2011年进行肝脏移植手术受者。入组受者的病因包括了乙肝感染、肝细胞肝癌、重型肝炎和肝硬化失代偿。
二、免疫抑制方案移植术后首月他克莫司血药浓度控制在10_12ng/mL,第一年其它月份中浓度控制在8-10ng/mL,此后控制在5-8ng/mL。期间吗替麦考酹酯每天用量为l_2g。皮质类固醇激素的施用方法为，手术当天施用IOOOmg泼尼松龙，继而在术后第一天施用240mg甲基强的松龙，其后每天降低甲基强的松龙用量，至术后2月时停药。三、急性排斥定义急性排斥通过肝脏活检、Banff病理分级明确，术后6月内发生的排斥反应被认为是急性排斥。四、DNA提取及基因型鉴定基因组DNA提取自移植受者外周血，提取设备采用Promega公司Maxwell 16自动化DNA提取仪，提取步骤参照相应说明文件。通过Hapmap网站分析B7-H3和TLT-2基因SNP位点信息，入选SNP位点需符合最小等位基因频率不低于20%以及r2不小于O. 8。提取后的DNA样本用IyL 1% agarose电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计，然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度5-10ng/y I。分别根据不同SNP位点配置PCR体系反应体系(10μ I):其中包含 Ix GC buffer I (TAKARA)，3. OmM Mg2+，O. 3mM dNTP, IU HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc. ), I μ I 样本 DNA 和 I μ I 扩增引物(见图1)。PCR 循环程序95°C 2 分钟；11 个循环 X (94°C 20 秒，65°C -O. 5°C / 循环 40 秒，720C I 分 30 秒);24 循环 X (94°C 20 秒，59°C 30 秒，72V1. 5 分钟);72°C 2 分钟；保持
4。。。PCR 产物纯化，在 10 μ I PCR 产物中加入 IU SAP 酶和 IU Exonuclease I 酶，37°C温浴I小时，然后75°C灭活15分钟。SNaPshot多重单碱基延伸检测反应延伸反应体系(ΙΟμΙ):包括5μ1 SNaPshot Multiplex Kit (ABI)，2 μ I 纯化后多重PCR产物，1μ I延伸引物混合物(见图1)，2μ I超纯水。PCR反应程序96°C I分钟，28个循环X (96 V 10秒，50 V 5秒，60 V 30秒);持
续 4。。。延伸产物纯化，在10 μ I延伸产物中加入IU SAP酶，37°C温浴I小时，然后75°C灭活15分钟。延伸产物上ABI3130XL测序仪取O. 5μ I纯化后的延伸产物，与O. 5 μ lLizl20SIZE STANDARD，加入 9 μ I H1-Di 混匀，95°C变性 5 分钟后上 ABI3130XL 测序仪；ABI3130XL测序仪上收集的原始数据用 GeneMapper 4. O (AppliedBiosystems Co. , Ltd. , USA)分析。五、相关性分析根据急性排斥反应发生与否，将回顾性研究中入组的299名患者分成急排发生与未发生2组。列联表形式，卡方检验方法对各组中原发病、B7-H3以及TLT-2基因SNP位点多态性分布进行分析。图2的结果显示B7-H3基因rs2127015位点和TLT-2基因rs6915083和rs7754593位点与急性排斥相关性密切，P值均小于O. 05，统计具有显著性意义。比值比(OR，odd ratio)提示B7-H3基因rs2127015位点T等位基因携带者以及TLT-2基因 rs6915083和rs7754593位点G等位基因携带者为急性排斥高风险患者。图3、图4表明，B7-H3及TLT-2基因各SNP位点间能够形成单倍型，但各单倍型与急性排斥风险无关。图5提示HBV感染与急性排斥相关，P值小于O. 05，具有显著性差异；比值比结果乙肝感染患者发生急性排斥的风险更高。而后采用多因素分析方法对以上4个因子再次进行验证，结果显示仅HBV感染以及B7-H3基因的SNP位点rs2127015的多态性可作为肝移植后急性排斥的独立危险因素，而TLT-2基因的rs6915083和rs7754593则未能通过统计检验。六、模型构建卡方检测表明受者的乙肝感染以及B7-H3基因rs2127015的T/T和C/T基因型都增加了受者术后急性排斥发生风险，因此设定高风险因子为I (即乙肝感染和T/T、C/T基因型)，而低风险因子为O (即未感染乙肝和C/C基因型)，采用ROC回归分析可建立模型，急性排斥风险指数=-1. 122+1.493XB+0. 817XC(其中，当所述基因型为T/T和C/T时，B =1，当所述基因型为C/C时，B = O ;如受者已感染HBV，C = 1，如受者未感染，C = O)。继而采用AUROC方法分析，确定该模型对急性排斥发生预测的敏感性和特异性分别为69. 8%和54. 7% (如图6所示)。根据模型对各受者急排风险的评分，所有受者可以为3组(大于I分、I分到O分和小于O分)，即高、中、低风险组。其中高、中风险组的急排发生率为20. 8%和11. 2 %，而低风险组的急排发生率仅为4. 3 %。七、模型前瞻性验证募集89例2010至2011年间行肝移植手术的患者，根据其乙肝感染及B7-H3基因rs2127015位点多态性计算各个患者的急性排斥风险分值并依据得分分组，而后对89位患者进行至少6个月的随访，明确受者急性排斥发生情况。最后发现高中低风险组受者发生急性排斥的风险分别为17. 0%,9. 5%以及4. 8%。以上结果表明利用该模型能够较好得预测急性排斥发生，该模型便于临床工作者对移植受者采用个体化免疫治疗方案。
权利要求
1.一种预测肝移植术后受者急性排斥发生风险的引物，包括一对PCR扩增引物和用于对扩增片段测序的延伸引物 其中PCR扩增引物包括 正向引物GGGAAATAACCAGTITTATggggaaga ； 反向引物=TGCATTTTCAAAACCCCagtga ； 其中延伸引物为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAGATCGATAATCTTGT TCTTAATCC。
2.一种预测肝移植术后受者急性排斥发生风险的方法，包括 (1)检测受者B7-H3基因单碱基突变位点rs2127015的基因型； (2)检测受者是否感染HBV； (3)计算受者急性排斥发生风险指数A;A = -1. 122+1. 493XB+0. 817XC 其中，当所述基因型为T/T和C/T时，B = 1，当所述基因型为C/C时，B = O ;如受者已感染HBV，C = 1，如受者未感染，C = O。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)为 (a)从受者外周血中提取基因组DNA; (b)以基因组DNA为模板，利用引物对a进行PCR扩增，收集扩增产物； (c)利用延伸引物b对扩增产物进行测序，确定B7-H3基因单碱基突变位点rs2127015的基因型； 引物对 a 的正向引物为=GGGAAATAACCAGTTTTATggggaaga ； 引物对a的反向引物为=TGCATTTTCAAAACCCCagtga ； 延伸引物b为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAGATCGATAATCTTGT TCTTAATCC。
全文摘要
本发明公开了一种预测肝移植术后受者急性排斥发生风险的引物即方法，引物包括一对PCR扩增引物和用于对扩增片段测序的延伸引物，分别如SEQ ID NO.13～15所示，该方法包括(1)检测受者B7-H3基因单碱基突变位点rs2127015的基因型；(2)检测受者是否感染HBV；(3)计算受者急性排斥发生风险指数A；A＝-1.122+1.493×B+0.817×C。本发明方法操作简单，预测受者发生急性排斥的型敏感性达为69.8％，特异性未54.7％。
文档编号C12Q1/68GK103014162SQ20121054361
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者余晓波, 周琳, 谢海洋, 郑树森 申请人:浙江大学医学院附属第一医院