专利名称：高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别是指一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法。
背景技术：
抗人神经巢蛋白单克隆抗体简称Nestin，该产品一直被作为神经干细胞特异性的标志，它是一个中等纤维骨架蛋白，属于第VI类中间丝蛋白，因其在中枢神经系统发育过程中的瞬时性表达而被克隆，而抗人Nestin单克隆抗体是对人神经干细胞进行鉴定最特异的方法，完全符合分子免疫学原理。随着分子生物学和基因治疗技术的飞快发展，采用神经干细胞移植治疗脊髓损伤(SCI)已被公认为最新、最有前途的治疗方法之一。由于国内外科研机构将主要精力放在神经干细胞的体外培养、扩增、移植方面，因此，神经干细胞检测体系的建立尤为重要。单克隆抗体技术目前已被国家级重点实验室所掌握，但要想获得高效价、高特异性的单克隆抗体在现有技术中尚未见到报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法。
本发明的整体技术构思是利用细胞融合、亚克隆及多例多种组织和细胞的特异性筛选技术，获得高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体，由于此单抗效价高、特异性好，可直接应用于基础医学研究，或制成多种体外诊断试剂盒进行神经干细胞的鉴定和神经干细胞移植后的疗效评价。
高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，它包括如下工艺步骤(1)动物免疫将高纯度的人神经巢蛋白1-10ml充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高纯度人神经巢蛋白，用酶联免疫吸附实验方法测定其抗血清；(2)分离脾细胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后的Sp2/0细胞调整为细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬液；(3)细胞融合将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按1∶10-100比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美国海克隆公司出品)进行细胞培养；(4)筛选杂交瘤细胞待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；(5)单克隆抗体特异性筛选选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于1∶10000的阳性孔的上清，与多种成人正常组织、肿瘤组织、人胚胎组织及人体外培养细胞株进行免疫组化特异性筛选；(6)单克隆抗体纯化保存选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司制造)将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，1.44(吸光单位)浓度为1-10mg/ml。
本发明的具体工艺步骤和各步骤中的工艺参数是步骤(1)将将高纯度的人神经巢蛋白1-10ml加等量的完全福氏佐剂并经充分乳化，与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～22周，每只腹腔注射0.2-0.5ml，隔周免疫一次，第三次免疫后第三天抽取外周血；测定抗血清。
步骤(1)进行完毕后采用酶联免疫吸附实验方法测定抗血清，该方法由如下操作步骤组成a、包被以50mmol/L、pH＝9的碳酸盐缓冲液将步骤(1)中的高纯度人神经巢蛋白1∶500稀释，包被96孔聚乙烯板，真空抽干，密封4℃保存备用；b、封闭每孔加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液200μl洗涤、内含1％山羊血清；
c、加样每孔加入第三次免疫后3天的小鼠外周血清50-100μl(1∶5000-10000稀释)，每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)，洗涤；d、加入酶标二抗每孔100-200μl，洗涤；e、显色每孔加入底物50-100μl；f、比色以空白调零，405nm波长测定光密度(O.D)；g、结果判断P/N＝测定标本O.D均值/阴性血清O.D均值，P/N≥2.1为阳性。
步骤c中的工艺条件为每孔加入1∶5000-10000稀释后的第三次免疫后3天的小鼠外周血清50-100μl，每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)，温度为37℃、时间为1小时，洗涤3次。
步骤e中的工艺条件为室温、时间为10分钟，然后使用终止液终止反应，经酶标仪在波长450nm处读取光密度值。
步骤(2)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后15小时的Sp2/0细胞调整为1-9×105/ml细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞1-9×106/ml。
步骤(3)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的比值按1∶10-100的比例混合，30-60秒内逐渐加入浓度为45％的聚乙二醇溶液(分子量＝4000)，静止90-120秒，使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1分钟滴加4.5ml 1640培养液；间隔2分钟滴加5ml 1640培养液(美国海克隆公司出品)，然后加1640培养液至50ml，1500rpm/分钟离心10分钟，以HAT选择性培养基(美国海克隆公司出品)按20-50％的孔为1个细胞/孔进行细胞培养。
步骤(4)中是将细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，然后进行抗原特异的免疫组织化学测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。
步骤(5)中选用的成人正常组织和人胚胎组织包括主要脏器和神经组织，肿瘤组织包括常见和多发肿瘤组织，与以上各种组织和细胞的阳性表达低于5％，与98％以上的从胚胎中分离的神经干细胞呈阳性表达。
步骤(6)中选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将5×105杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去，在接种一周后有明显的腹水产生，每只小鼠可收集10-15ml的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，吸光单位＝1.44时浓度为1-10mg/ml。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于所获得的抗人神经巢单克隆抗体效价高、特异性非常好。可直接标记多种示踪物，借助目前先进的检测仪器如流式细胞仪、化学发光检测仪、磁性分选仪等进行神经干细胞的阳选。
本发明所公开的方法是将高纯度人神经巢蛋白经免疫动物、细胞融合、克隆化培养、以及大量的组织细胞原位特异性筛选从而获得高效价、高特异性的抗人Nesting单克隆抗体，此抗体可直接应用于临床检测和基础研究。单克隆抗体在生物学和医学研究领域中具有极大的应用价值，是亲和层析中重要的配体，是免疫组化中主要的抗体，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。作为神经干细胞的检测试剂，抗人神经巢蛋白单克隆抗体可以充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，可将抗原抗体反应的特异性大大提高，减少了可能的交叉反应，使试验结果可信度更大。单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。
其各项指标如下1、免疫BLAB/C鼠的抗血清酶联免疫吸附实验效价大于1∶50002、阳性克隆孔酶联免疫吸附实验效价大于1∶100003、阳性克隆孔腹水酶联免疫吸附实验效价大于1∶500004、阳性克隆孔特异性表达与人神经干细胞呈阳性表达，与其它组织细胞呈阴性表达如下人体外原代培养细胞
人体外培养细胞系
注阴性(-)阳性(+)成人正常组织
人胚胎组织
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，它包括如下工艺步骤(1)动物免疫将高纯度的人神经巢蛋白1ml充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高纯度人神经巢蛋白，用酶联免疫吸附实验方法测定其抗血清；(2)分离脾细胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后的Sp2/0细胞调整为细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬液；(3)细胞融合将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按1∶10比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美国海克隆公司出品)进行细胞培养；(4)筛选杂交瘤细胞待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；(5)单克隆抗体特异性筛选选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于1∶10000的阳性孔的上清，与多种成人正常组织、肿瘤组织、人胚胎组织及人体外培养细胞株进行免疫组化特异性筛选；(6)单克隆抗体纯化保存选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司制造)将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，1.44(吸光单位)浓度为1-10mg/ml。
步骤(1)将高纯度的人神经巢蛋白1ml加等量的完全福氏佐剂并经充分乳化，与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～22周，每只腹腔注射0.2-0.5ml，隔周免疫一次，第三次免疫后第三天抽取外周血；测定抗血清。
步骤(1)进行完毕后采用酶联免疫吸附实验方法测定抗血清，该方法由如下操作步骤组成a、包被以50mmol/L、pH＝9的碳酸盐缓冲液将步骤(1)中的高纯度人神经巢蛋白1∶500稀释，包被96孔聚乙烯板，真空抽干，密封4℃保存备用；b、封闭每孔加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液200μl洗涤、内含1％山羊血清；c、加样每孔加入第三次免疫后3天的小鼠外周血清50-100μl(1∶5000稀释)，每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)，洗涤；d、加入酶标二抗每孔100μl，洗涤；e、显色每孔加入底物100μl；f、比色以空白调零，405nm波长测定光密度(O.D)；g、结果判断P/N＝测定标本O.D均值/阴性血清O.D均值，P/N≥2.1为阳性。
步骤c中的工艺条件为每孔加入1∶5000稀释后的第三次免疫后3天的小鼠外周血清50μl，每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)，温度为37℃、时间为1小时，洗涤3次。
步骤e中的工艺条件为室温、时间为10分钟，然后使用终止液终止反应，经酶标仪在波长450nm处读取光密度值。
步骤(2)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后15小时的Sp2/0细胞调整为9×105/ml细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞9×105/ml。
步骤(3)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的比值按1∶10的比例混合，30秒内逐渐加入浓度为45％的聚乙二醇溶液(分子量＝4000)，静止90秒，使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1分钟滴加4.5ml 1640培养液；间隔2分钟滴加5ml 1640培养液(美国海克隆公司出品)，然后加1640培养液至50ml，1500rpm/分钟离心10分钟，以HAT选择性培养基(美国海克隆公司出品)按36％的孔为1个细胞/孔进行细胞培养。
步骤(4)中是将细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，然后进行抗原特异的免疫组织化学测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。
步骤(5)中选用的成人正常组织和人胚胎组织包括主要脏器和神经组织，肿瘤组织包括常见和多发肿瘤组织，与以上各种组织和细胞的阳性表达低于5％，与98％以上的从胚胎中分离的神经干细胞呈阳性表达。
步骤(6)中选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将5×105杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去，在接种一周后有明显的腹水产生，每只小鼠可收集15ml的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，吸光单位＝1.44时浓度为1mg/ml。
此抗人神经巢单克隆抗体经56例体外培养的神经干细胞进行免疫组化原位表达均为阳性，与多种多例数的组织和细胞进行免疫组化原位表达阳性率低于5％。表明此单抗特异性很高，适合提供给临床进行神经干细胞移植的鉴定和疗效评价，也可制成免疫组化或酶联免疫吸附实验试剂盒开展医学基础研究。
权利要求
1.高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于它包括如下工艺步骤(1)动物免疫将高纯度的人神经巢蛋白1-10ml充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高纯度人神经巢蛋白，用酶联免疫吸附实验方法测定其抗血清；(2)分离脾细胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后的Sp2/0细胞调整为细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬液；(3)细胞融合将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按1∶10-100比例混合，加入聚乙二醇使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基进行细胞培养；(4)筛选杂交瘤细胞待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；(5)单克隆抗体特异性筛选选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于1∶10000的阳性孔的上清，与多种成人正常组织、肿瘤组织、人胚胎组织及人体外培养细胞株进行免疫组化特异性筛选；(6)单克隆抗体纯化保存选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，吸光单位为1.44时浓度为1-10mg/ml。
2.根据权利要求1所述的高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)将将高纯度的人神经巢蛋白1-10ml加等量的完全福氏佐剂并经充分乳化，与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～22周，每只腹腔注射0.2-0.5ml，隔周免疫一次，第三次免疫后第三天抽取外周血；测定抗血清。
3.根据权利要求1或2所述的高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)进行完毕后采用酶联免疫吸附实验方法测定抗血清，该方法由如下操作步骤组成a、包被以50mmol/L、pH＝9的碳酸盐缓冲液将步骤(1)中的高纯度人神经巢蛋白1∶500稀释，包被96孔聚乙烯板，真空抽干，密封4℃保存备用；b、封闭每孔加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液200μl洗涤、内含1％山羊血清；c、加样每孔加入稀释5000-10000倍的第三次免疫后3天的小鼠外周血清50-100μl，每板设一正常对照、阳性对照及磷酸盐缓冲液空白，洗涤；d、加入酶标二抗每孔100-200μl，洗涤；e、显色每孔加入底物50-100μl；f、比色以空白调零，405nm波长测定光密度O.D；g、结果判断P/N＝测定标本O.D均值/阴性血清O.D均值，P/N≥2.1为阳性。
4.根据权利要求3所述的高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤c中的工艺条件为每孔加入1∶5000-10000稀释后的第三次免疫后3天的小鼠外周血清50-100μl，每板设一正常对照、阳性对照及磷酸盐缓冲液空白，温度为37℃、时间为1小时，洗涤3次。
5.根据权利要求3所述的高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤e中的工艺条件为室温、时间为10分钟，然后使用终止液终止反应，经酶标仪在波长450nm处读取光密度值。
6.根据权利要求1所述的高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后15小时的Sp2/0细胞调整为1-9×105/ml细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞1-9×106/ml。
7.根据权利要求1所述的高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的比值按1∶10-100的比例混合，30-60秒内逐渐加入分子量＝4000、浓度为45％的聚乙二醇，静止90-120秒，使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1分钟滴加4.5ml1640培养液；间隔2分钟滴加5ml1640培养液，然后加1640培养液至50ml，1500rpm/分钟离心10分钟，以HAT选择性培养基按20-50％的孔为1个细胞/孔进行细胞培养。
8.根据权利要求1所述的高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤(4)中是将细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，然后进行抗原特异的免疫组织化学测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。
9.根据权利要求1所述的高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤(5)中选用的成人正常组织和人胚胎组织包括主要脏器和神经组织，肿瘤组织包括常见和多发肿瘤组织，与以上各种组织和细胞的阳性表达低于5％，与98％以上的从胚胎中分离的神经干细胞呈阳性表达。
10.根据权利要求1所述的高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤(6)中选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将5×105杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去，在接种一周后有明显的腹水产生，每只小鼠可收集10-15ml的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，吸光单位＝1.44时浓度为1-10mg/ml。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，特别是指一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法。动物免疫、分离脾细胞、细胞融合、筛选杂交肿瘤细胞、单克隆抗体特异性筛选、单克隆抗体纯化保存等工艺步骤，本发明解决了现有技术存在的高效价、高特异性的单克隆抗体在现有技术中尚属空白的问题。可直接应用于临床检测和基础研究，在生物学和医学研究领域中具有极高的应用价值，单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。
文档编号C12N5/18GK1903879SQ200610012998
公开日2007年1月31日 申请日期2006年8月1日 优先权日2006年8月1日
发明者李彬 申请人:李彬