专利名称：一种特异性识别激活Gαo蛋白单克隆抗体及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物科学和药物研发领域。
背景技术：
G蛋白是细胞内主要的信号传导蛋白，G蛋白中Gd亚基的激活与否是细胞信号传 导的一个标志，对于细胞迁移和分化起着关键的信号传导作用。鉴于其功能，该类蛋白成为 细胞生物学和新药发现即药物筛选的一个主要研究目标，据统计大约有70%的药物是通过 G蛋白途径发挥作用的，通过对G蛋白以及相关信号通道激活的检测是药物筛选的主要途
径之一。G蛋白有两种构象与GTP结合时的激活态和GDP结合时的钝化态。通常情况下， 绝大多数G蛋白是与GDP结合的钝化型。与GDP结合的G蛋白能与各种各样的受体相互作 用，这种相互作用增加了受体与配体的结合亲和力。一旦受体与配体结合，受体被激活，a 亚基就与β和Y亚基分离，同时离开受体。由于解离下来的α亚基与GDP的结合亲和力 下降，GDP就能够与游离在细胞内的GTP发生交换，产生与GTP结合的激活型的G蛋白。被 激活的G蛋白就与效应蛋白相互作用，改变了第二信使的浓度，从而发生信号转导响应。如 此这般，配体与受体短短几毫秒时间的接触可以延长为几十秒，乃至更长时间的反应，使输 入的信号可以被大大地放大。G α ο是G α家族中一种，其功能是通过激活，与效应蛋白相互作用，抑制腺苷酸环 化酶，降低第二信使的浓度，同时还有更多的理化作用也在逐步揭示中。现有的所有针对Ga ο蛋白的抗体都只仅仅能监测总的Ga ο蛋白水平，无法分辨 Ga ο蛋白的激活状态。
发明内容
本发明的目的是解决上述问题而提供了一种特异性识别激活Ga ο蛋白单克隆 抗体及其制备方法，利用本发明的方法制备出的单克隆抗体可以特异性识别G α ο蛋白的 激活状态。本发明所采用的技术方案是一种特异性识别激活Ga ο蛋白单克隆抗体，是由中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)保藏号为CCTCC C2010108的杂交瘤产生的。一种权利要求1所述的特异性识别激活G α ο蛋白单克隆抗体的制备方法，包括 以下步骤1)构建表达G a O蛋白的表达质粒，表达G a0蛋白；2)通过GTP Y s激活G α ο蛋白；3)以此激活的G α ο蛋白作为抗原免疫可产生单克隆抗体的动物，完成免疫周 期；4)融合脾细胞和S/P20细胞，通过激活的抗原筛选出表达特异性识别激活G Q0蛋白单克隆抗体的融合细胞株；5)以该细胞株的细胞通过可产生单克隆抗体的动物生产，而获得特异性识别激活 G α ο蛋白单克隆抗体。优选地，所述可产生单克隆抗体的动物为小鼠、大鼠和兔子。进一步地，所述可产生单克隆抗体的动物为小鼠或大鼠时，在步骤幻中以该细胞 株的细胞通过小鼠或大鼠生产腹水，而获得特异性识别激活Ga ο蛋白单克隆抗体。进一步地，所述可产生单克隆抗体的动物为兔子时，在步骤幻中以该细胞株的细 胞通过兔子生产血清，而获得特异性识别激活G α ο蛋白单克隆抗体。本发明具有以下优点本发明的特异性识别激活G α ο蛋白单克隆抗体，能特异性的识别激活G α ο蛋白， 对于Ga ο蛋白的激活理化变化研究可以从根本上予以揭示，对于利用Ga ο蛋白途径进行 细胞生物学研究和新药筛选研发起到了关键的作用。
杂交瘤细胞株M10#01，于2010年10月27日在中国典型培养物保藏中心(中国武汉大 学)，保藏号为 CCTCC C2010108。
图1为试验样品的免疫印染实验图谱；图2为试验样品中激活Ga ο蛋白含量的标准曲线图。
具体实施例方式实施例1利用免疫沉淀-免疫印迹结合法来证明本发明的单克隆抗体可以识别激活Ga ο 蛋白。首先需要制备试验样品，样品分为两种，贴壁细胞样品和悬浮细胞样品。1.贴壁细胞样品的制备(1)待细胞长到90%的汇合密度时，根据需要加入激活或抑制因子进行细胞刺激。(2)吸走培养基，并用预冷的PBS洗涤两次。(3)彻底吸走最后的PBS溶液，并添加预冷的IX的细胞裂解液(每100毫米的细 胞培养板加入0. 5毫升细胞裂解液)。(4)将细胞培养板放置于冰上10分钟。(5)用细胞刮片从细胞培养板上彻底的刮离细胞。(6)转移细胞裂解物到一个大小适合的管中，并放置于冰上。(7)如果发生核裂解，细胞裂解液可能会变得非常粘稠，难以用移液器吸走，这时 可以通过一个27半轨针头吹打3次以剪切基因组DNA。(8)将细胞裂解液于4°C，12，OOOxg离心10分钟。(9)取出上清，放置冰上，立即使用。如果不立即使用，可以快速冰冻于-70°C。2.悬浮细胞样品的制备(1)细胞培养至需要密度后，根据需要加入激活或抑制因子进行细胞刺激。(2)进行细胞计数，通过离心收集细胞。
(3)吸走培养基，并用预冷的PBS洗涤两次。(4)彻底吸走最后的PBS溶液，并添加预冷的IX的细胞裂解液(每100毫米的细 胞培养板加入0. 5毫升细胞裂解液)。(5)用移液器反复吹打进行细胞裂解。(6)转移细胞裂解物到一个大小适合的管中，并放置于冰上。(7)如果发生核裂解，细胞裂解液可能会变得非常粘稠，难以用移液器吸走。这时 可以通过一个27半轨针头吹打4次以剪切基因组DNA。(8)将细胞裂解液于4°C，12，OOOxg离心10分钟。(9)取出上清，放置冰上，立即使用。如果不立即使用，可以快速冰冻于-70°C。两种试验样品制备完成以后，利用免疫沉淀-免疫印迹结合法进行试验，具体分 为三个部分1.激活G α ο蛋白的免疫沉淀实验(1)等分0. 5毫升的细胞裂解液(上述试验样品中贴壁细胞样品或悬浮细胞样品 其中的一种)到微量离心管中。(2)用实验缓冲液调整每个样品体积至1ml。(3)每管中加入Iul的本发明单克隆抗体。(4)通过涡旋或摇勻的方法迅速混勻proteinA/G琼脂糖微珠。(5)快速添加20ul的悬浮微珠至每个样品管中。(6)在4°C孵育1小时，并轻微搅拌。(7)在5000xg离心1分钟沉淀微珠。(8)吸走并丢弃上清，确保不吸走微珠。(9)用0. 5ml实验缓冲液洗涤微珠3次，每次都通过离心去除上清。(10)在最后一次洗涤后，离心后，小心的吸走全部上清。(11)加入20ul样品缓冲液(SDS-PAGE)到20ul微珠中。(12)将样品煮5分钟。(13)在 5，OOOx g 离心 10 秒。2. SDS-PAGE 电泳和转膜(1)将离心后的20ul上清全部点入8%的聚丙烯酰胺胶中，最好同时点一个预染 的蛋白质Marker (用于检测转膜是否成功)。(2)按照厂家说明书进行SDS-PAGE。(3)按照厂家的说明书进行转膜，将蛋白质从凝胶上转移至PVDF膜或者硝酸纤维 素膜上。3.免疫印迹进行检测(以下所有步骤均在室温下进行)(1)继电泳之后，将PVDF膜浸没于100%的甲醇中15秒，然后让其于室温干燥5 分钟。(注意，如果使用的是硝酸纤维素膜，这一步可以跳过。)(2)采用含5%脱脂奶粉或者3% BSA的TBST于室温下封闭膜1小时，并轻轻搅 拌。然后将膜于任意一个抗Ga ο蛋白的单抗或者多抗进行孵育室温1-2小时或者4°C过 夜，并伴有轻轻搅拌，抗体的配制仍然采用含5%脱脂奶粉或者3% BSA的TBST。(3)用TBST洗膜3次，每次5分钟。
(4)将膜与2抗进行孵育(如果2使用的是鼠单抗，2抗可以是羊抗鼠的HRP标记 抗体，如果使用的是兔多抗，2抗可以是羊抗兔的HRP标记抗体)，室温1小时并伴有轻轻搅 拌。2抗的配制仍然采用含5%脱脂奶粉或者3% BSA的TBST。(5)用TBST洗膜3次，每次5分钟。通过以上步骤，可以获得以下结果，参照图1。从图1中可以看出，第1泳道为Ga ο 蛋白，通过LPA处理(3泳道)和没有处理O泳道)的MEF细胞。细胞裂解液与激活Ga ο 构型特异性单抗进行孵育，通过proteinA/G沉淀下来的活性6(10蛋白经过303^^^^，转膜 后，再用另外一个抗Ga ο的单抗或者多抗进行检测。从而得出的结论是本发明单克隆抗体 可以识别激活Ga ο蛋白。实施例2采用ELISA方法定量检测出试验样品中激活G α ο蛋白的含量。(1)以0. IM NaC03 PH9. 6包被液稀释激活本发明单克隆抗体，以每孔200ng包被 ELISA板，放置室温2小时或4度过夜。(2)倒出孔内溶液，拍干，每孔加入200ulPBST洗涤，3次，每次5分钟。(3)用稀释液将激活600蛋白 500叫/1111 5 倍比稀释 500、100、20、4、0. 8、0. 16ng/ ml作为标准。(4)同时准备试验样品，细胞或组织处理液上清。(5)每孔加入以上处理的样品和标准品50ul及兔抗G α ο蛋白抗体，放置室温2小 时。(6)倒出孔内溶液，拍干，每孔加入200ulPBST洗涤，3次，每次5分钟。(7)用稀释液将酶标二抗稀释成1 50000，IOOul/孔，放置室温1小时。(8)倒出孔内溶液，拍干，每孔加入200ulPBST洗涤，3次，每次5分钟。(9)显色，并读取数据，其具体数值见表1。(10)制作标准曲线，由标准曲线读取试验样品中激活Ga ο的含量，其标准曲线参 照图2。表1试验样品的激活G α ο数值
权利要求
1.一种特异性识别激活Gd ο蛋白单克隆抗体，其特征在于，是由中国典型培养物保藏 中心(CCTCC)保藏号为CCTCC C2010108的杂交瘤产生的。
2.—种权利要求1所述的特异性识别激活Ga ο蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在 于，包括以下步骤1)构建表达Gaο蛋白的表达质粒，表达Ga ο蛋白；2)通过GTPγ s激活Ga ο蛋白；3)以此激活的Gao蛋白作为抗原免疫可产生单克隆抗体的动物，完成免疫周期；4)融合脾细胞和S/P20细胞，通过激活的抗原筛选出表达特异性识别激活Gaο蛋白 单克隆抗体的融合细胞株；5)以该细胞株的细胞通过可产生单克隆抗体的动物生产，而获得特异性识别激活Gα ο 蛋白单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的特异性识别激活Gaο蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在 于，所述可产生单克隆抗体的动物为小鼠、大鼠和兔子。
4.根据权利要求2或3任意一项所述的特异性识别激活Gα ο蛋白单克隆抗体的制备 方法，其特征在于，所述可产生单克隆抗体的动物为小鼠或大鼠时，在步骤5)中以该细胞株 的细胞通过小鼠或大鼠生产腹水，而获得特异性识别激活Ga ο蛋白单克隆抗体。
5.根据权利要求2或3任意一项所述的特异性识别激活Gα ο蛋白单克隆抗体的制备 方法，其特征在于，所述可产生单克隆抗体的动物为兔子时，在步骤5)中以该细胞株的细胞 通过兔子生产血清，而获得特异性识别激活G α ο蛋白单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种特异性识别激活Gαo蛋白单克隆抗体及其制备方法，属于生物科学和药物研发领域。该特异性识别激活Gαo蛋白单克隆抗体是由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏号为CCTCC NO:C2010108的杂交瘤产生的。利用本发明的方法制备出的单克隆抗体可以特异性识别Gαo蛋白的激活状态。
文档编号C07K16/18GK102060926SQ20101055974
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月25日 优先权日2010年11月25日
发明者不公告发明人 申请人:武汉纽斯特生物技术有限公司