Vegf－c或vegf－d物质及刺激神经干细胞的方法

专利名称：Vegf－c或vegf－d物质及刺激神经干细胞的方法
技术领域：
本发明提供与细胞和分子生物学及医学有关的、尤其是脉管形成(vascularization)和血管发生(angiogenesis)领域及脉管系统与神经系统相互作用领域中的物质和方法。
背景技术：
神经毡蛋白(neuropilin)受体蛋白与其在脑衰蛋白(collapsin)/脑信号蛋白(semaphorin)分子家族中的配体的相互作用促进神经元生长锥的发育和轴突导向——在神经元组织发育过程中调节正在延伸的轴突的路径的过程。神经元生长锥的不适当回缩将导致不期望的组织过度神经支配(innervation)。
脑衰蛋白/脑信号蛋白属于在氨基端含有大约500个氨基酸的特征性脑信号蛋白域的分子家族。目前已知脑信号蛋白家族的20多个成员，既有分泌形式的也有膜结合形式的，这些成员基于一级蛋白质结构可以分成6个不同的亚组。分泌形式的和膜结合形式的脑信号蛋白均以二硫键连接的同二聚体形式与其受体结合，并且膜结合脑信号蛋白的胞质尾区可以诱导这些配体在细胞膜中簇集。
III型脑信号蛋白是含有后跟有C2型免疫球蛋白样结构域的脑信号蛋白域的分泌蛋白，已经发现其整体涉及神经元生长锥的排斥和萎陷(repulsion and collapse)-一种防止背根神经节、交感神经元和颅神经元及脊神经元的不适当神经支配的过程。
近来鉴定了III型脑信号蛋白的两个受体，神经毡蛋白-1(NRP-1)(Kolodkin等，Cell.90753-762，1997和He等，Cell.90739-51，1997)和神经毡蛋白-2(NRP-2)(Chen等，Neuron，19547，1997)。神经毡蛋白-1，最初从非洲爪蟾属神经系统分离的一种I型膜蛋白，通过脑信号蛋白III受体表达克隆被鉴定为是Sema III和其它脑信号蛋白家族成员的一种高亲和性受体。使用与神经毡蛋白-1同源的序列通过PCR的进一步分析鉴定了相关受体神经毡蛋白-2，该受体表现出与NRP-1在整个蛋白质长度上大约44％的同源性。
NRP-1和NRP-2两者的细胞外部分都表现出有趣的细胞结合域混合，具有命名为a1/a2、b1/b2和c的5种不同蛋白质域。a1/a2(CUB)域类似于在补体成分C1r和Cs中发现的蛋白质序列，而b1/b2域类似于在凝血因子V和VIII中发现的域。c域的中心部分类似于meprin/A5/mu-磷酸酶(MAM)同源域，对于神经毡蛋白的二聚体化是重要的。神经毡蛋白的胞内区域包含跨膜域和一个大约43个氨基酸的短的高度保守胞质尾区，该尾区具有目前未知的催化活性。a1/a2和b1/b2域两者是促进脑信号蛋白与神经毡蛋白结合所必需的。
由于神经毡蛋白的短胞质尾区不具有信号传导能力，故神经毡蛋白可能与其它受体偶联以传递由脑信号蛋白结合所导致的细胞内信号。对此设想的研究得出神经毡蛋白与另一脑信号蛋白受体(丛蛋白(plexin))家族相互作用的结论，该家族具有包含能够经历磷酸化和启动下游信号转导级联的sex-丛蛋白域的胞质尾区(Tamagnone等，Trends in Cell Biol.，10377-83，2000)。丛蛋白最初作为膜结合脑信号蛋白的孤儿受体分离，并且丛蛋白单独不能结合分泌型脑信号蛋白，例如III型亚家族中的那些分泌型脑信号蛋白。目前，大量证据证明III型脑信号蛋白的结合由受体复合体介导，该复合体包括同或异二聚体神经毡蛋白和转导细胞内信号所必需的丛蛋白分子。丛蛋白与神经毡蛋白的相互作用赋予了脑信号蛋白结合的特异性，并且还可以增加这些配体的结合亲和性。在Fujisawa等(Current Opinion inNeurobiology，8587，1998)和Tamagnone等(Trends in Cell Biol.，10377，2000)中综述了脑信号蛋白通过其受体的信号转导。
神经毡蛋白-1(Tagaki等，Neuron 7295-307，1991；Fujisawa等，CellTissue Res.290465-70，1997)，一种基因定位在染色体10p12上的140kD蛋白质(Rossingnol等，Genomics 57459-60，1999)，于各种各样的发育期组织，包括神经组织、心血管系统的毛细管和脉管、和骨骼组织中表达，并且持续存在于许多成年组织，最显著地胎盘和心脏中。除了结合Sema3A外，NRP-1也结合其它几种脑信号蛋白家族成员，包括Sema3B、Sema3C(SemaE)和Sema3F(SemaIV)(低亲和力)(He等，Cell 90739-51，1997；Kolodkin等，Cell 90753-62，1997)。NRP-1基因座的纯合突变体小鼠不仅表现出在轴突导向上的缺陷，还显示出脑中脉管化的改变以及心脏大脉管形成缺陷(Kawasaki等，Development 1264895，1990)。有趣的是，NRP-1在胚胎中的过表达导致过度的毛细管和脉管形成以及出血，这提示NRP-1在脉管的发育中起作用(Kitsukawa等，Development，1214309，1995)。
最近的证据显示，神经毡蛋白-1可以作为血管内皮生长因子同种型(VEGF/VEGF-A)的受体(Soker等，Cell 92735，1998)，血管内皮生长因子是胚胎发育中脉管化和脉管发生的关键介质(见Robinson等，J.Cell Science，114853-65中的综述)并在肿瘤的脉管发生中有显著作用。VEGF与受体酪氨酸激酶(RTK)VEGFR-1和VEGFR-2的结合有利于脉管发育。非肝素依赖性VEGF121同种型和结合肝素的VEGF165在体外以相同的亲和力与VEGFR-2结合，但是不引起等同生物化学反应，这说明有额外的因子介导VEGFR-2的活化(Whitaker等，J.Bio Chem.27625520-31，2001)。对VEGF几种剪接变体的结合的分析揭示NRP-1不结合VEGF121同种型，但以肝素依赖性方式在NRP-1的b域中选择性地结合VEGF165变体(Giger等，Neuron 211079-92，1998)。NRP-1对VEGF165同种型显示出的结合亲和性与NRP-1对其Sema3A配体的结合亲和性相当。NRP-1对VEFG165的这种差别亲和性可能解释该剪接变体超过非肝素结合型VEGF121的信号转导能力，并且可能说明神经毡蛋白-1在VEGF结合中作为共受体与VEGFR-2相互作用(Whitaker等，2001)，这类似于其在丛蛋白/脑信号蛋白复合体中的角色。VEGF165通过VEGF外显子7与NRP-1结合，该外显子赋予该分子肝素结合亲和性并且其不存在于VEGF121同种型中。NRP-1也与其它VEGF家族成员，VEGF-B(Migdal等，J.Biol.Chem.27322272-78，1998)、胎盘生长因子(PIGF-2)(Makinen等，J.Biol.Chem.27421217-222，1999)和VEGF-C(国际专利公布WO00/23565)结合。
神经毡蛋白-2(Chen等，Neuron 19547-59，1997)，一种基因定位在染色体2q34上的120kD蛋白质(Rossingnol等，Genomics 57459-60，1999)，在发育的胚胎中表现出与神经毡蛋白-1相似的组织分布，但是其似乎不在毛细血管的内皮细胞中表达(Chen等，Neuron 19547-59，1997)，而在毛细淋巴管中表达。NRP-2也是脑信号蛋白受体，以高亲和性和Sema3F结合，以和Sema3C/NRP-1结合相当的亲和性与Sema3C结合，NRP-2似乎也以非常低的亲和性和Sema3A发生相互作用(Kolodkin等，Cell 90753-62，1997)。NRP-2缺陷小鼠在交感神经元和海马神经元的Sema3F依赖性形成上存在缺陷，并在外周和中枢神经系统的轴突投射(axonal projection)上存在缺陷，这暗示NRP-2参与轴突导向(Chen等，Neuron 2543-56，2000；Giger等，Neuron2529-41，2000)并提示NRP-1和NRP-2在发育中具有不同作用。NRP-2敲除小鼠在发育过程中显示出没有或具有严重减少的小淋巴管和毛细管，但动脉、静脉和较大的淋巴管正常，这提示NRP-2是小淋巴管和毛细管发育所必需的(Yuan等，Development 1294794-806，2002)。此外，在向平滑肌细胞分布神经的位点，例如肠系膜、肌和粘膜下神经丛中也已经注意到NRP-2的表达(Cohen等，Biochem.Biophy.Res.Comm.284395-403，2001)。
实验室证据确立，与NRP-1类似，神经毡蛋白-2优先地结合VEGF165，并表现出另外与VEGF145同种型——VEGF的另一肝素结合型剪接变体——的结合(Gluzman-Poltorak等，J.Biol Chem.27518040-45，2000)。神经毡蛋白-2与缺少外显子7的VEGF145剪接变体的相互作用由VEGF145的外显子6介导，该外显子与外显子7一样能够介导肝素结合活性。VEGF145不能结合NRP-1，这进一步支持了神经毡蛋白-1和神经毡蛋白-2在脉管发育中功能不同的理论。VEGF145最初从雌性生殖道癌分离(Pavelock等，Endocrinology.142613-22，2001)，其中神经毡蛋白-2在该位置的表达与NRP-1和VEGFR-2相比表现出响应激素改变受到不同的调节。两种神经毡蛋白、VEGF和VEGFR在特定细胞类型中的共表达可能指示潜在受体/配体复合体的形成，需要更细致地研究。
VEGF/VEGFR相互作用在胚胎脉管化和脉管发生中扮演着不可缺少的角色，并且其在伤口愈合、雌性生殖系统的修复、以及肿瘤生长过程中参与成年组织的新脉管化。阐明参与调节新脉管化和脉管发生的其它因子以及它们在这些过程中的作用将有助于开发治疗方法以防止实体瘤脉管化和诱导肿瘤消退、在损伤、手术或组织移植后诱导脉管化以促进更快更有效的伤口愈合、或通过诱导形成向缺血组织提供营养的脉管和动脉来治疗局部缺血。事实上，对脉管发生过程的调节可能有助于治疗或治愈许多困扰发达国家人民的极重大疾病，例如，脑梗死/出血、急性心肌梗死和缺血及癌症。
对神经元生长的调节也有助于治疗许多先天的、变性的、及创伤相关的神经学病症。新发现的神经毡蛋白和VEGF的相互作用为分子水平干预神经元和脉管疾病和病症提供了一个靶标。然而，开发靶向治疗的任务因神经毡蛋白存在多种结合配偶体(partner)而复杂化。需要对与神经毡蛋白结合的分子进行详细描述，以便允许鉴定对神经毡蛋白活性的调节作用和优化这些分子的特异性从而优化有害脉管发生领域，如癌症或实体瘤生长领域的治疗方法，以及加强促脉管发生性质从而促进和加速所需血管的生长(例如在伤口愈合中)；和优化涉及神经元生长和组构的治疗方法。
发明概述本发明通过鉴定神经毡蛋白和VEGF-C分子之间及神经毡蛋白和VEGFR-3分子间的新分子相互作用，满足了调节脉管发生系统和神经系统的生长和功能的相关领域中的一个或多个需要。这些新描述的相互作用将促进用于调节脉管发生过程(包括淋巴管发生过程)及涉及神经细胞生长、分化和再生的过程的新物质和方法的鉴定。此外，这些新描述的相互作用也将有利于更好的治疗靶向，因为其使得可以设计出高度选择性地调节单一受体-配体相互作用的分子或调节多种相互作用的分子。
例如，VEGF-C-神经毡蛋白相互作用的发现为鉴定调节(上调/激活/刺激或下调/抑制)VEGF-C-神经毡蛋白相互作用的新治疗性分子提供了新的筛选试验方法。这些分子可以作为治疗剂(和/或引导化合物)用于受到VEGF-C/神经毡蛋白的相互作用影响的疾病和病症，包括淋巴管或血管生长在其中发挥作用的那些疾病和病症，或神经系统疾病和病症。
一个实施方案中，本发明提供鉴定调节神经毡蛋白受体与VEGF-C多肽的结合的调节剂的方法，包括步骤a)使包含神经毡蛋白多肽的神经毡蛋白组合物与包含VEGF-C多肽的VEGF-C组合物在有和无推测的调节剂分子存在下接触；b)检测神经毡蛋白多肽和VEGF-C多肽在有和无推测的调节剂分子存在下的结合；和c)基于神经毡蛋白多肽和VEGF-C多肽在推测的调节剂分子存在时的结合相对于两者在无推测的调节剂分子存在时的结合的减少或增加，鉴定调节剂化合物。
在一个变体实施方案中，该方法还包括步骤(d)通过在载体，优选地可药用载体中配制根据步骤(c)鉴定的调节剂，制备调节剂组合物。由此配制的调节剂可以用于动物研究，也可以作为治疗剂给药以进行组织成像或治疗与神经毡蛋白-VEGF-C相互作用有关的疾病，其中化合物的给药可能干扰这些分子的有害活性或促进有益活性。因此，在另一变化方案中，该方法还包括步骤(e)给包含表达神经毡蛋白受体的细胞的动物施用该调节剂组合物，和测定该调节剂组合物在动物中的生理作用。所述动物可以是人，或用于人类医学研究的任何动物模型，或重要的动物例如牲畜或宠物。在优选的变化方案中，动物(包括人类)患有以异常神经毡蛋白-2/VEGF-C生物学为特征的疾病或病症，并且调节剂改善该动物的状况(例如，通过减少疾病症状、减缓疾病进程、治愈疾病或否则改善临床结局)。
前述方法的步骤(a)涉及在有和无化合物存在时使神经毡蛋白组合物与VEGF-C组合物接触。“神经毡蛋白组合物”指包括整个神经毡蛋白受体多肽或包括至少神经毡蛋白多肽中对于此特定试验而言所必需的部分——在此情况下神经毡蛋白多肽中参与VEGF-C结合的部分——的任何组合物。神经毡蛋白组合物的例子包括(i)包含含有整个神经毡蛋白蛋白或含有与VEGF-C多肽结合的神经毡蛋白受体胞外域片段的纯化多肽的组合物；(ii)包含表面含有神经毡蛋白受体多肽的磷脂膜的组合物；(iii)经重组修饰而在表面表达增加量的神经毡蛋白受体多肽的活细胞(例如，通过将神经毡蛋白基因，优选地与附着的启动子一起，插入细胞；或通过扩增内源神经毡蛋白基因；或通过插入外源启动子或其它调节序列以上调内源神经毡蛋白基因)；和(iv)天然地在表面表达神经毡蛋白受体多肽的任何分离的细胞或组织。对于某些试验形式，可能期望目的神经毡蛋白分子(例如包含含有神经毡蛋白受体胞外域片段的多肽的组合物)与固相支持物，例如珠或试验板孔结合。“神经毡蛋白组合物”旨在也包括这样的结构。同样，融合蛋白也在考虑之列，其中神经毡蛋白多肽与另一蛋白(例如抗体Fc片段)融合以提高溶解性或提供标志物表位或实现任何其它目的。对于其它试验形式，可能优选可溶性神经毡蛋白多肽。在一个优选变化方案中，神经毡蛋白组合物包含含有与免疫球蛋白Fc片段融合的神经毡蛋白受体胞外域片段的多肽。尽管目前已知的是两个家族成员，神经毡蛋白-1和神经毡蛋白-2，但使用以后发现的其它神经毡蛋白受体家族成员来实施本发明亦在考虑之列。所选的神经毡蛋白受体优选来源于脊椎动物，更优选哺乳动物，再更优选灵长类动物，再更优选人类。尽管明显地在所选神经毡蛋白受体的功能性部分与天然受体具有相同氨基酸序列时本试验将可能产生最佳结果，但是清楚的是，当在神经毡蛋白序列中引入不消除其VEGF-C结合性质的变异时本发明仍能够实施。尤其考虑使用具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的变异序列。
VEGF-C分子天然以分泌因子形式存在，其在释放至周围环境中前经历几次酶切反应。因此，“VEGF-C组合物”指包括前VEGF-C原(prepro-VEGF-C)多肽、前VEGF-C原的中间和最终断裂产物、ΔNΔC VEGF-C、或包括至少VEGF-C中对于此特定试验而言所必需的部分——在此情况下参与结合神经毡蛋白受体的部分——的任何组合物。VEGF-C组合物的例子包括(i)包含纯化的完整前VEGF-C原多肽或包含与选用于本试验的神经毡蛋白受体结合的前VEGF-C原多肽片段的组合物；和(ii)来自分泌VEGF-C蛋白的细胞的条件培养基。对于某些试验形式，可能期望目的VEGF-C分子(例如，包含VEGF-C片段的多肽)与固相支持物如珠或试验板孔结合。“VEGF-C组合物”旨在也包括此类结构。同样地，融合蛋白也在考虑之列。本文提供的数据确立VEGF-C同种型与神经毡蛋白-1及神经毡蛋白-2结合。所选的VEGF-C多肽优选来源于脊椎动物，更优选哺乳动物，再更优选灵长类动物，再更优选人类。在一个实施方案中，VEGF-C组合物包含人前VEGF-C原的片段，该片段含有SEQ ID NO24的103-227位氨基酸。在另一实施方案中，VEGF-C组合物包含SEQ ID NO24的人前VEGF-C原序列的32-227位氨基酸。尽管明显地在所选VEGF-C的功能性部分与天然VEGF-C的相应部分具有相同氨基酸序列时本试验将可能产生最佳结果，但是清楚的是当在VEGF-C序列中引入不消除其神经毡蛋白受体结合性质的变异时本发明仍能够实施。尤其考虑使用具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的变异序列。
步骤(a)中使用的推测的调节剂化合物可以是期望测试其调节神经毡蛋白-VEGF-C相互作用的能力的任何有机或无机化学分子或生物分子或物质组合物。由于最优选的调节剂是可以作为治疗物给药的那些调节剂，故显然具有有限的毒性的分子是优选的。然而，毒性可以在后续试验中筛选，并且可以通过药剂师的设计从化合物中除去。尤其考虑筛选化学药品文库例如惯常由制药公司保持的那些文库，或组合文库，肽文库等。
上述方法的步骤(b)包括检测神经毡蛋白和VEGF-C在有和无化合物存在时的结合。可以使用用于检测分子间结合的任何技术。优选对结合提供定量测量的技术。例如，神经毡蛋白/VEGF-C之一或两者可以包含标记物，例如放射性同位素、荧光团、荧光蛋白(例如，天然或合成的绿色荧光蛋白)、染料、酶或底物等。这些标记物有利于使用标准实验室设备和技术实施定量检测。免疫测定是用于检测两种分子间的结合的一种常用高效技术。
当神经毡蛋白组合物包含在表面上天然表达或重组表达神经毡蛋白的细胞时，常常可以间接地，例如，通过检测或测量VEGF-C结合诱导的细胞内生理变化，检测VEGF-C的结合。这些可能的变化包括该神经毡蛋白相关VEGF-受体的磷酸化；细胞趋化性；细胞生长；DNA合成；细胞形态改变；离子流等。
上述方法的步骤(c)涉及基于神经毡蛋白受体多肽和VEGF-C多肽在推测的调节剂化合物存在时的结合相对于两者在无推测的调节剂化合物存在时的结合的增加或减少，鉴定调节剂化合物。一般地，更有吸引力的调节剂是以低浓度激活或抑制神经毡蛋白-VEGF-C结合由此允许以较低有效剂量在药物组合物中使用的那些调节剂。
另一实施方案中，本发明提供筛选VEGF-C生物学活性的调节剂的选择性的方法。术语“选择性”——当在本文中用于描述调节剂时——指调节剂调节一种蛋白质-蛋白质相互作用(例如，VEGF-C与神经毡蛋白-2的结合)并同时最小地影响该结合对中的一个或多个蛋白的另一蛋白质-蛋白质相互作用(例如，VEGF-C与VEGFR-2或VEGFR-3或神经毡蛋白-1的结合)的能力。具有较高选择性的调节剂显著地改变第一蛋白质-蛋白质相互作用并最小地影响另一蛋白质-蛋白质相互作用，而非选择性调节剂将改变两种或两种以上的蛋白质-蛋白质相互作用。可以理解，选择性对于设计有效药物具有巨大意义。例如，在一些情况下，由于希望调节脉管生长但不调节神经的生长，可能期望鉴定改变VEGF-C/神经毡蛋白相互作用但不改变脑信号蛋白/神经毡蛋白相互作用的调节剂。或者，可能期望使用调节神经元生长的选择性调节剂。在一些情况下可能期望无选择性地抑制所有VEGF-C相关活性，例如，在抗肿瘤治疗中。本文中鉴定的分子相互作用使得可以使用新的筛选试验以帮助鉴定调节剂的选择性。
例如，VEGF-C分子也是VEGFR-2和VEGFR-3酪氨酸激酶受体的已知配体。VEGF-C/VEGFR-3相互作用似乎完整参与淋巴管系统的发育和维持，并且其可能还参与癌通过淋巴系统的转移。在一个实例中，特异地调节VEGF-C/神经毡蛋白相互作用可能是有益的，而在另一实例中选择性地调节VEGF-C/VEGFR相互作用可能是有用的。本发明提供鉴定调节剂对神经毡蛋白-VEGF-C结合或VEGF-C-VEGFR结合的选择性的复筛选试验(counterscreen assay)。
因此，在一个变化方案中，本发明提供包括如下步骤的方法a)在有和无化合物存在下使VEGF-C组合物与神经毡蛋白组合物接触，检测在有和无化合物存在下VEGF-C和神经毡蛋白(于组合物中)的结合，其中有化合物存在下的结合与无化合物存在下的结合之间的差别将该化合物确定为VEGF-C和神经毡蛋白结合的调节剂；b)在有和无该化合物存在下使VEGF-C组合物与包含VEGF-C结合配偶体的组合物接触，检测在有和无该化合物存在下VEGF-C和结合配偶体的结合，其中有化合物存在下的结合与无化合物存在下的结合之间的差别将该化合物确定为VEGF-C和该结合配偶体结合的调节剂；其中所述结合配偶体选自(i)包含VEGFR-3胞外域的多肽；和(ii)包含VEGFR-2胞外域的多肽；和c)基于步骤(a)和(b)中检测到的结合，鉴定该调节剂化合物的选择性。
上述实施方案的步骤(a)涉及如前描述的神经毡蛋白组合物与VEGF-C组合物的接触。上述方法的步骤(b)涉及在有和无相同化合物存在下使步骤(a)中描述的VEGF-C组合物与包含VEGF-C结合配偶体的组合物接触。所述VEGF-C结合配偶体选自(i)包含VEGFR-3胞外域的多肽；(ii)包含VEGFR-2胞外域的多肽。因此，上述实施方案包括测量，相对于VEGF-C和其受体VEGFR-2和VEGFR-3的结合，VEGF-C/神经毡蛋白结合的调节剂的选择性。所选的VEGF-C结合配偶体优选来源于脊椎动物，更优选哺乳动物，再更优选灵长类动物，再更优选人类。尽管明显地在所选VEGF-C结合配偶体的功能性部分与天然VEGF-C结合配偶体具有相同氨基酸序列时本试验将可能产生最佳结果，但是清楚地当在VEGF-C结合配偶体序列中引入不消除其VEGF-C结合性质的变异时本发明仍能够实施。尤其考虑使用具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的变异序列。用于检测分子间结合的任何技术均可以使用。例如，结合配偶体或VEGF-C之一或两者可以包含标记物，例如放射性同位素、荧光团、荧光蛋白(例如，天然或人工绿色荧光蛋白)、染料、酶或底物等。这些标记物有利于使用标准实验室设备和技术进行检测。
在一个变化方案中，结合配偶体组合物包含在其表面天然或重组地表达该结合配偶体的细胞。在此情况下，常常可以间接地，例如，通过检测或测量VEGF-C结合诱导的细胞生理学变化，检测VEGF-C的结合。这些可能的变化包括相关VEGFR的磷酸化；细胞趋化性；细胞生长；细胞形态改变；离子流等。
上述方法的步骤(c)涉及基于步骤(a)和(b)中的增加的或减少的结合，鉴定调节剂化合物的选择性。构成选择性调节剂的化合物将在步骤(a)或步骤(b)中造成显著不同的结合，但不会在步骤(a)和(b)两者中均造成显著不同的结合。非特异性调节剂在步骤(a)和(b)两者中均造成显著不同的结合。
在再一实施方案中，本发明提供筛选神经毡蛋白生物学活性的调节剂的选择性的方法，包括步骤a)在有和无化合物存在下使神经毡蛋白组合物与VEGF-C组合物接触，检测在有和无化合物存在下神经毡蛋白和VEGF-C的结合，其中有化合物存在下的结合与无化合物存在下的结合之间的差别将该化合物确定为神经毡蛋白和VEGF-C结合的调节剂；b)在有和无该化合物存在下使神经毡蛋白组合物与包含神经毡蛋白结合配偶体的组合物接触，检测在有和无该化合物存在下神经毡蛋白和结合配偶体的结合，其中有化合物存在下的结合与无化合物存在下的结合之间的差别将该化合物确定为神经毡蛋白和该结合配偶体结合的调节剂；其中所述结合配偶体选自(i)包含脑信号蛋白3多肽的氨基酸序列的多肽；(ii)包含VEGF-A氨基酸序列、VEGF-B氨基酸序列、VEGF-D氨基酸序列、PIGF-2氨基酸序列、VEGFR-1氨基酸序列、VEGFR-2氨基酸序列、VEGFR-3氨基酸序列的多肽；和(iii)包含丛蛋白多肽的氨基酸序列的多肽；c)基于步骤(a)和(b)中检测到的结合，鉴定该调节剂化合物的选择性。
上述实施方案的步骤(a)涉及如前描述的神经毡蛋白组合物与VEGF-C组合物的接触。上述方法的步骤(b)涉及在有和无化合物存在下步骤(a)中描述的神经毡蛋白组合物与包含神经毡蛋白结合配偶体的组合物进行接触。神经毡蛋白结合配偶体包括除VEGF-C之外与神经毡蛋白结合的任何蛋白质。该结合配偶体的实例包括如下多肽包含脑信号蛋白3家族多肽成员的氨基酸序列的多肽；包含VEGF-A氨基酸序列的多肽、包含VEGF-B氨基酸序列的多肽、包含VEGF-D氨基酸序列的多肽、包含PIGF-2氨基酸序列的多肽、包含VEGFR-1氨基酸序列的多肽、包含VEGFR-2氨基酸序列的多肽、包含VEGFR-3氨基酸序列的多肽；和包含丛蛋白家族成员的氨基酸序列的多肽。所选的结合配偶体优选来源于脊椎动物，更优选哺乳动物，再更优选灵长类动物，再更优选人类。尽管明显地在所选神经毡蛋白结合配偶体的功能性部分与天然序列具有相同氨基酸序列时本试验将可能产生最佳结果，但是清楚地当在天然序列中引入不消除其神经毡蛋白结合性质的变异时本发明仍能够实施。尤其考虑使用具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的变异序列。
上述方法包括检测神经毡蛋白组合物和该结合配偶体在有和无所述化合物存在下的结合。用于检测分子间结合的任何技术均可以使用。例如，结合配偶体或神经毡蛋白之一或两者可以包含标记物，例如放射性同位素、荧光团、荧光蛋白(例如，天然或人工绿色荧光蛋白)、染料、酶或底物等。这些标记物有利于使用标准实验室设备和技术进行的检测。
上述方法的步骤(c)涉及基于步骤(a)和(b)中的增加的或减少的结合来鉴定调节剂化合物的选择性，和获得如前所述的选择性调节剂化合物的特征。
在另一实施方案中，本发明提供筛选神经毡蛋白生长因子受体和VEGFR-3多肽结合的调节剂的方法，包括步骤a)在有和无推测的调节剂化合物存在下使神经毡蛋白组合物和VEGFR-3组合物接触；b)检测神经毡蛋白和VEGFR-3在有和无该推测的调节剂化合物存在下的结合；和c)基于神经毡蛋白组合物和VEGFR-3组合物在有该推测的调节剂化合物存在下的结合相对于在无该推测的调节剂化合物存在下的结合的减少和增加，鉴定调节剂化合物。
前述方法的步骤(a)涉及在有和无推测的调节剂化合物存在下使所述神经毡蛋白组合物与VEGFR-3组合物接触。其中所考虑的神经毡蛋白组合物在之前已经进行过描述。“VEGFR-3组合物”包括选自如下的成员(i)包含含有完整VEGFR-3蛋白质或含有与神经毡蛋白结合的VEGFR-3片段的纯化多肽的组合物；(ii)包含在其表面含有VEGFR-3多肽的磷脂膜的组合物；(iii)经重组修饰而在其表面表达增加量的VEGFR-3的活细胞；和(iv)天然在其表面表达VEGFR-3的任何分离的细胞或组织。对于某些试验形式，可能期望将目的VEGFR-3分子(例如，包含VEGFR-3胞外域片段的多肽)与固相支持物例如珠或试验板孔结合。“VEGFR-3组合物”旨在也包括此类结构。同样地，融合蛋白也在考虑之列。对于其它试验形式，可能优选可溶性VEGFR-3肽。在一个优选变化方案中，VEGFR-3受体组合物包含与免疫球蛋白Fc片段融合的VEGFR-3受体片段。
上述方法的步骤(b)涉及检测神经毡蛋白组合物和VEGFR-3组合物在有和无所述化合物存在下的结合。用于检测分子间结合的任何技术均可以使用。例如，神经毡蛋白/VEGFR-3之一或两者可以包含标记物，例如放射性同位素、荧光团、荧光蛋白(例如，天然或人工绿色荧光蛋白)、染料、酶或底物等。这些标记物有利于使用标准实验室设备和技术进行检测。
一般地，更有吸引力的调节剂是以较低浓度激活或抑制神经毡蛋白-VEGFR-3的结合由此允许其以较低有效剂量在药物组合物中使用的调节剂。
在另一实施方案中，本发明提供筛选VEGFR-3生物学活性的调节剂的选择性的方法，包括步骤a)在有和无化合物存在下使VEGFR-3组合物与神经毡蛋白组合物接触，检测在有和无化合物存在下VEGFR-3和神经毡蛋白的结合，其中有化合物存在下的结合与无化合物存在下的结合之间的差别将该化合物确定为VEGFR-3和神经毡蛋白结合的调节剂；b)在有和无该化合物存在下使VEGFR-3组合物与包含VEGFR-3结合配偶体的组合物接触，检测在有和无该化合物存在下VEGFR-3和结合配偶体的结合，其中有化合物存在下的结合与无化合物存在下的结合之间的差别将该化合物确定为VEGFR-3和该结合配偶体结合的调节剂；其中所述结合配偶体选自
(i)包含VEGF-C多肽的多肽；和(ii)包含VEGF-D多肽的多肽；和c)基于步骤(a)和(b)中检测到的结合，鉴定该调节剂化合物的选择性。
选择性调节剂在步骤(a)或步骤(b)中造成显著的差别结合，但不在步骤(a)和步骤(b)两者中均造成显著的差别结合。
明显地，前述选择性筛选仅仅是本发明特异选择性筛选的一部分，因为神经毡蛋白、VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3均具有多种结合配偶体，由此产生大量的选择性筛选排列组合。本发明尤其考虑涉及观察如下相互作用之一(i)神经毡蛋白-1/VEGF-C；(iii)神经毡蛋白-2/VEGF-C；(v)神经毡蛋白-1/VEGFR-3；和(vi)神经毡蛋白-2/VEGFR-3；以及至少一种其它相互作用(例如，这些分子之一的已知相互作用，和来自前所述列的第二相互作用)的任何选择性筛选方法。
同样地，所有这些调节剂筛选和选择性筛选都可以任选地包括如下步骤之一或两者(1)通过将所选调节剂配制在可药用载体中制备调节剂组合物；和(2)将由此配制的调节剂施用于动物或人并确定调节剂的效果。优选地，所述动物或人患有涉及前述分子相互作用之一的疾病或病症，并且对所述动物或人进行监测以确定调节剂对期望获得改善或治愈的该疾病或病症的效果。
神经毡蛋白-2和神经毡蛋白-1与VEGF-C结合的发现，为研究许多目前已知疾病状态中涉及的生物学过程提供了新的有用物质和方法。例如，本发明提供调节哺乳动物生物体中细胞生长、迁移或增殖的方法，包括步骤(a)鉴定具有表达神经毡蛋白受体的细胞的哺乳动物生物体；和(b)向所述哺乳动物生物体施用组合物，所述组合物包含神经毡蛋白多肽或其与VEGF-C多肽结合的片段；其中以有效地调节该哺乳动物生物体中表达神经毡蛋白的细胞的生长、迁移或增殖的量施用该组合物。优选施用可溶形式的神经毡蛋白。
优选地，该哺乳动物生物体是人。此外，所述细胞优选包括脉管内皮细胞、尤其是淋巴来源的细胞，例如人微脉管内皮细胞(HMVEC)和人皮下脂肪垫微脉管细胞(HUCEC)。在一个高度优选的实施方案中，生物体患有以内皮细胞异常生长、迁移或增殖为特征的疾病。药剂的施用可以例如，通过纠正该异常生长、迁移或增殖、或降低其严重性或减少其有害症状或影响，而对该异常生长、迁移或增殖造成有益的改变。
例如，在一个变化方案中，动物患有癌症，尤其是以包含表达神经毡蛋白的内皮细胞的脉管系统为特征的癌性肿瘤。选择可以降低这些细胞的生长、迁移或增殖、并由此可以通过防止新脉管系统生长而阻滞肿瘤生长的组合物。在此情况下，可能希望施用抑制其它内皮生长因子/受体相互作用的药剂，例如VEGF家族配体的抑制剂；内抑素(endostatin)；抑制性angiopoietin等。抑制剂的实例包括对这些生长因子或其配体具有特异性的抗体物质。本发明还考虑治疗表现出表达VEGFR-3的脉管内皮细胞或表达VEGFR-3的淋巴内皮细胞的淋巴管瘤、淋巴管肉瘤和转移瘤。一个实施方案中，通过施用抑制VEGFR-3和其配体相互作用的组合物，减少或彻底破坏淋巴管发生并阻滞癌细胞扩散。在另一实施方案中，通过施用刺激VEGFR-3和其配体相互作用的组合物，增强淋巴管发生并加速伤口愈合。
本发明还考虑包括如下步骤的用于调节哺乳动物生物体中细胞的生长、迁移或增殖的方法(a)鉴定具有表达神经毡蛋白受体的细胞的哺乳动物生物体；和(b)向所述哺乳动物生物体施用组合物，所述组合物含有对该神经毡蛋白受体和VEGF-C多肽具有特异性的双特异性抗体，其中以有效地调节哺乳动物生物体中表达该神经毡蛋白受体的细胞的生长、迁移或增殖的量施用该组合物。在一个备选实施方案中，该双特异性抗体对神经毡蛋白受体和VEGFR-3多肽具有特异性。
一个实施方案中，本发明提供特异地结合神经毡蛋白受体和VEGF-C多肽的双特异性抗体。或者，本发明提供特异地结合神经毡蛋白受体和VEGFR-3多肽的双特异性抗体。
另一实施方案中，本发明还可以用于抑制中枢神经系统中的神经变性。在周围及更尤其地中枢神经系统中围绕神经元损伤的疤痕的出现与脑信号蛋白配体的组成型表达相关。而且，在阿尔茨海默氏病患者的脑中已经检测到Sema3F(神经毡蛋白-2受体的主要配体)的上调。本发明提供通过使用特异地干扰神经系统中的脑信号蛋白活性的VEGF-C组合物、改变这些脑信号蛋白-神经毡蛋白相互作用的手段。
例如，本发明提供调节哺乳动物生物体中的异常生长或神经元结疤(neuronal scarring)的方法，包括步骤(a)鉴定具有表达神经毡蛋白受体的神经元细胞的哺乳动物生物体；和(b)给所述哺乳动物生物体施用组合物，所述组合物包含VEGF-C多肽或其与神经毡蛋白受体结合的片段；其中以有效地在该哺乳动物生物体表达神经毡蛋白的细胞中减少神经元结疤的量施用该组合物。
其它可以治疗的病症包括炎症(例如，类风湿性关节炎、慢性伤口和动脉粥样硬化)。
类似地，本发明提供包含可以与神经毡蛋白受体结合的VEGF-C片段的多肽在制备用于治疗以表达神经毡蛋白受体的细胞的异常生长、迁移或增殖为特征的疾病的药物中的应用。
同样地，本发明还提供包含可以与VEGF-C结合的神经毡蛋白片段的多肽在制备用于治疗以表达神经毡蛋白受体的细胞的异常生长、迁移或增殖为特征的疾病的药物中的应用。优选缺少跨膜域的神经毡蛋白的可溶性形式。本发明还提供包含可以与VEGFR-3多肽结合的神经毡蛋白受体片段的多肽在制备用于治疗以表达VEGFR-3多肽的细胞的异常生长、迁移或增殖为特征的疾病的药物中的应用。
关于本发明的涉及向哺乳动物施用蛋白质药剂的方面，本发明的一个相关方面包括基因治疗，借此编码目的蛋白质的基因以能够实现该目的蛋白质在该动物中的表达的方式施用。例如，可以将目的基因与适宜启动子连接以启动蛋白质在目的靶细胞中的表达，而且该目的基因可以在任何能够将该基因递送至细胞的基因治疗载体中递送，所述载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、脂质体、裸DNA转移等。
本文中描述的VEGF-C作为神经营养和神经保护性生长因子起作用的证据，支持了用于治疗存在神经元丧失或功能缺陷的问题的疾病的新治疗策略。此外，本发明还提供通过使用“VEGF-C抑制剂”抑制成神经细胞瘤或其它神经来源的肿瘤的方法。任选地，VEGF-C抑制剂与VEGFR-3抑制剂或一种或多种PDGF或PDGFR抑制剂或神经生长因子抑制剂联合施用。
一个实施方案中，本发明提供在哺乳动物个体中促进神经元细胞或神经元前体细胞的募集、增殖、分化、迁移或存活的方法，包括向所述个体施用包含血管内皮生长因子C(VEGF-C)产物或血管内皮生长因子D(VEGF-D)产物的组合物。术语“募集”指动员一种细胞类型(例如使之迁移)的能力，例如向神经病理学位点调动神经元细胞和神经元前体细胞的能力。术语“增殖”指有丝分裂繁殖。术语“分化”指多能和其它非终末分化的神经元前体细胞发育成其它细胞类型的过程。分化可能涉及许多介于多能和完全分化的细胞类型之间的阶段。术语“存活”指神经元或前体细胞维持代谢和其它细胞功能的能力。
本发明中所用术语“VEGF-C产物”包括任何全长(前原-)VEGF-C多肽；维持了VEGF-C多肽的至少一种生物学活性(例如与VEGF-C受体结合)的其片段；编码并可以用于表达VEGF-C多肽的VEGF-C多核苷酸及其片段；包含该多核苷酸的载体(尤其是，表达载体和基因治疗载体)；和表达VEGF-C多肽的重组细胞。
VEGF-C多肽天然以前肽原(prepro-peptide)形式存在，在分泌至周围环境中之前其经历信号肽和C末端前肽(pro-peptide)的蛋白酶解加工。进一步蛋白酶解加工断裂N末端前肽，释放完全加工形式的VEGF-C。“VEGF-C产物”包括前VEGF-C原多肽、前VEGF-C原的中间和最终断裂产物、VEGF-CΔNΔC、VEGF-CΔC156、VEGF-CC156S、VEGF-CΔNΔCC156S、嵌合的肝素结合型VEGF-C、或前VEGF-C原中与选自VEGFR-2、VEGFR-3、神经毡蛋白-1、神经毡蛋白-2的VEGF-C受体结合的片段。优选地，VEGF-C多肽包含SEQ ID NO24中所示的氨基酸序列，或包含与VEGFR-2或VEGFR-3结合并在表达这些受体之一或两者的细胞中刺激VEGFR-2或VEGFR-3磷酸化的该氨基酸序列的片段。实验证据说明，某些VEGF-C多肽不结合神经毡蛋白和VEGFR。例如，VEGF-C ΔNΔC不结合神经毡蛋白受体但结合VEGFR-3。然而，预期缺少神经毡蛋白结合性质的VEGF-C多肽，当通过VEGF受体发挥作用时，将具有与通过VEGF-C/VEGFR相互作用介导的那些神经营养作用相似的神经营养性质。
VEGF-CΔC156类多肽和多核苷酸详细地描述在美国专利6,130,071和PCT公布WO98/33917中，两份文献均并入此处作为参考。
肝素结合型VEGF-C多肽的实例描述在2004年6月14日提交的美国临时专利申请60/478,390和美国专利申请系列10/868,577以及共提交的PCT申请＿＿(Attorney Docket No.28967/39359A(PCT)(全部并入此处作为参考)中。嵌合肝素结合型VEGF-C多肽的实例包括与VEGF的肝素结合域(例如，外显子6-8(CA89)或外显子7-8(CA65)编码的序列，两者均含有神经毡蛋白结合区——VEGF外显子7)融合的VEGF-C中的VEGF同源域(VHD)。在表达研究中，CA65分泌并释放至上清液中，而CA89除非培养基中含有肝素否则不释放至上清液中，这说明其显然以类似于已经就VEGF189描述过的方式和细胞表面硫酸肝素结合。
在一个实施方案中，VEGF-C产物包含含有SEQ ID NO24的氨基酸103-227的人前VEGF-C原片段。在另一实施方案中，VEGF-C产物包含SEQID NO24的人前VEGF-C原序列的氨基酸32-227。在再一实施方案中，考虑具有包含SEQ ID NO24的连续部分的氨基酸序列的多肽，其中所述连续部分具有选自SEQ ID NO2的32-111位的氨基酸作为其氨基末端并具有选自SEQ ID NO24的228-419位的氨基酸作为其羧基末端。正如本文其它地方更详细解释的，VEGF-C生物学活性在氨基端和羧基端前肽的加工后增加。因此，考虑选自SEQ ID NO24的102-131位或SEQ ID NO24的103-111位的氨基端。同样，考虑选自SEQ ID NO2的215-227位的羧基端。
尽管明显地当所选VEGF-C的功能性部分与天然VEGF-C的相应部分具有相同氨基酸序列时本方法将可能得到最佳结果，但清楚的是当VEGF-C序列中引入了不消除其受体结合性质的变异时本发明仍能够实施。术语“VEGF-C产物”也旨在包括由SEQ ID NO23和24中所示序列特征的人VEGF-C的等位基因变体编码的多肽。尤其考虑使用具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的变体序列。“VEGF-C产物”也包括编码或表达上述这些变体的多核苷酸、载体和细胞。
在另一变化方案中，VEGF-C产物包含编码VEGF-C多肽产物并可以在细胞中表达的多核苷酸。例如，VEGF-C产物包含选自如下的多核苷酸(a)含有编码SEQ ID NO24的人VEGF-C氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；(b)含有与SEQ ID NO23的核苷酸序列至少90％相同并编码结合VEGFR-3的多肽的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含编码含有与SEQ ID NO24至少90％相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多肽与VEGFR-3结合；(d)与SEQ ID NO23的互补序列在如下严紧条件下杂交并编码与VEGFR-3结合的多肽的多核苷酸室温两次2XSSC/0.1％SDS，55℃15分钟1XSSC/0.1％SDS，55℃15分钟0.1XSSC/0.1％SDS；和(e)(a)-(d)的编码与VEGFR-3结合的多肽的片段。等价严紧性条件可以按照Ausubel等(编)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(1994)，pp.6.0.3-6.4.10中所述通过改变温度和缓冲液或盐浓度而得到。
优选的VEGF-C多核苷酸编码上述VEGF-C多肽，包括全长前VEGF-C原、VEGF-C的中间和最终断裂产物、以及它们的片段和变体。一个实施方案中，VEGF-C产物包含编码SEQ ID NO24中所示VEGF-C多肽的多核苷酸或与VEGFR-2、VEGFR-3、NRP-1或NRP-2结合的该多核苷酸的片段。多核苷酸优选包含启动子和/或增强子以促进编码的VEGF-C蛋白质在受体生物的靶细胞中的表达，以及包含终止密码子、多腺苷酸化信号序列和其它序列以利于表达。
启动子可以是病毒启动子或细胞特异性启动子。一个实施方案中，VEGF-C产物包含含有VEGF-C编码多核苷酸的表达载体。另一实施方案中，该方法提供VEGF-C产物，其中所述VEGF-C产物包含含有该多核苷酸的病毒载体，例如复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒载体及其杂合体。此外，还考虑包含VEGF-C产物的组合物进一步包含可药用载体。
正如以下将更详细描述的，生长因子VEGF-D与VEGF-C具有氨基酸序列相似性，并且已知VEGF-D也经历从前VEGF-D原蛋白酶解成较小分泌形式的生长因子的相似加工过程，此外还已知VEGF-D与VEGF-C具有两个共同的VEGF受体，即VEGFR-3和VEGFR-2。由于这些和其它相似性，预期通过VEGF受体发挥作用的VEGF-D多肽将具有与通过VEGF-C/VEGFR相互作用介导的那些神经营养作用相似的神经营养特性。
因此，本发明的另一方面涉及实施上述刺激神经干细胞的方法(和后续段落中描述的其它方法)，其中代替(或外加)VEGF-C产物施用VEGF-D产物。
类似于VEGF-C产物，术语“VEGF-D产物”包括前VEGF-D原多肽和它的结合并刺激VEGF-D受体的片段、以及VEGF-D多核苷酸和含有其的表达物，例如复制缺陷型腺病毒、腺相关病毒和慢病毒及它们的杂合体。人类VEGF-D基因和蛋白质的详细描述见Achen等，Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.，95(2)548-553(1998)；1998年2月26日公布的国际专利公布WO98/07832；和Genbank Accession No.AJ000185，所有均并入此处作为参考。此处SEQ ID NO25和26给出了人前VEGF-D原的cDNA和推导的氨基酸序列。
哺乳动物个体可以是人，或用于人类医学研究的任何动物模型，或重要的动物例如牲畜或宠物。在优选变化方案中，所述个体患有以需要刺激神经元、神经元前体或神经干细胞募集、增殖、或分化为特征的疾病或病症，而VEGF-C产物或VEGF-D产物的施用改善动物的状况(例如，通过减轻疾病症状、减缓疾病进程、治愈疾病或否则改善临床结局)。
一个变化方案中，该方法还包括在给药前鉴定需要神经细胞或神经前体细胞募集、增殖、分化、迁移或存活的个体的步骤。该鉴定步骤包括医学诊断以确定患有可受益于神经干细胞的募集、增殖或分化的疾病或病症的个体。这可以通过运动技能评估、MRI脑成像和本领域通常用于监测神经变性病和神经病理的其它检验方法来实现。诊断可以任选地包括活组织检查和/或基于细胞的体外神经元损伤测量。例如，在阿尔茨海默氏病的疑似患者中，体外试验可以测量与阿尔茨海默氏病通常相关的分子淀粉样β蛋白的水平，从而确定脑中淀粉样蛋白斑的形成程度；此外，在阿尔茨海默氏病或帕金森病患者中，可以测量乙酰胆碱或乙酰胆碱受体水平(Banerjee等，Neurobiol Dis.7666-72，2000)。
一方面，所述鉴定包括鉴定需要治疗以促进神经元细胞或神经元前体细胞的募集、增殖、分化、迁移或存活的哺乳动物个体。另一方面，所述鉴定包括鉴定需要治疗以促进少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的募集、增殖、分化、迁移或存活的哺乳动物个体。
在一个优选实施方案中，待用VEGF-C多肽或VEGF-D多肽治疗的个体是人类。
本发明另一实施方案提供刺激神经干细胞增殖或分化的方法，包括从哺乳动物个体获得含有神经干细胞(NSC)的生物学样品，和使干细胞和包含血管内皮生长因子C(VEGF-C)产物或血管内皮生长因子D(VEGF-D)产物的组合物接触。一方面，所述接触包括在含有VEGF-C产物或VEGF-D产物的培养基中培养干细胞。在此方法中，VEGF-C或VEGF-D的有益效果在人或其它动物个体的身体外被赋予来自该人或动物个体的细胞。对于避免副作用或准备医学方法中使用的细胞样品，此疗法可能是期望的。
还特别考虑与PDGF生长因子家族的任何蛋白质或基因成员的联合疗法。
生物学样品可以是任何从中可以发现干细胞的组织或体液样品。血液和骨髓是该生物学样品的可行来源，脐带血也是。神经干细胞也可以从成年哺乳动物的脑，包括海马、嗅叶或成年脑室区分离。
一方面，可以对生物学样品实施纯化和/或分离步骤以在接触步骤之前纯化或分离干细胞。在一个相关方面，该方法还包括步骤在接触步骤后纯化和分离神经干细胞或神经细胞。同样地，本发明考虑与VEGF-C或VEGF-D一起培养的纯化的或分离的神经干细胞，以选择已经响应VEGF-C或VEGF-D的处理而发生增殖或分化的那些细胞。可以诱导神经干细胞分化为任何神经细胞，包括神经胶质细胞、少突胶质细胞、神经元或星形胶质细胞。基于经多代传代繁殖的能力、nestin和Ki-67的表达、原始神经元形态以及分化成神经元和神经胶质细胞的能力，将细胞表征为多能神经祖先细胞。
在一个实施方案中，考虑人类个体。在另一实施方案中，当所述个体是人时，细胞供体是近亲，或具有基本上相同的人类白细胞抗原(HLA)谱。在一个变化方案中，将细胞离体接种在组织、器官或人工基质中，并将所述组织、器官或人工基质附着到(attached)、植入或移植入哺乳动物个体。
NSC的其它来源包括脊髓、胎儿组织、视网膜和胚胎。可以在本发明中用于分离神经干细胞和分化的细胞的神经元特异性标志包括染色神经元的神经丝蛋白(NFP)和鉴定胶质细胞谱系的细胞的胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)(GFAP)。其它阳性神经干细胞标志选自CD9、CD15、CD95、CD3、MHC1和β2微球蛋白(见美国专利公布20030040023)。
来自神经视网膜的干细胞表达早先针对脑来源的干细胞已显示的标志，GD2神经节苷脂、CD15、和tetraspanin CD9和CD81。GD2和CD15近来被证实是真(true)神经干细胞的标志，而tetraspanin CD9和CD81对真干细胞表现出较低的特异性。
一个变化方案中，该方法还包括步骤在接触步骤后将神经干细胞施用给哺乳动物个体。在另一实施方案中，该方法包括步骤在接触步骤后将神经干细胞移植入不同的哺乳动物个体。在该方法的一个变体中，将细胞离体接种在组织、器官或人工基质中，并将所述组织、器官或人工基质附着到、植入或移植入哺乳动物个体。哺乳动物可以考虑是人。
可以以对所治疗的疾病或病症适宜的方式，例如，系统地或在神经病理学部位局部地(参见详述部分)，将神经干细胞施用给或移植入哺乳动物个体。
本发明另一实施方案是体外诱导神经干细胞增殖的方法，包括使神经干细胞与包含VEGF-C产物或VEGF-D产物的组合物接触，其中所述神经干细胞选自神经干细胞系C17.2、纯化的神经干细胞、HSN-1细胞、胎猪细胞、神经嵴细胞、骨髓来源的神经干细胞、hNT细胞和人神经元祖先细胞系。
在一个变化方案中，接触步骤包括在含有VEGF-C产物的培养基中培养干细胞。例如，使用1-100μg蛋白/ml的生长培养基。在另一变化方案中，所述接触包括用VEGF-C转基因转化或转染干细胞。
任选地，该方法还包括步骤在接触步骤后将干细胞施用给哺乳动物个体。在该方法的一个变体中，将所述细胞离体接种在组织、器官或人工基质中，并将所述组织、器官或人工基质附着到、植入或移植入哺乳动物个体。所述哺乳动物个体可以考虑是人类。
还可以考虑实施本发明方法，其中VEGF-C产物或VEGF-D产物与神经生长因子联合给药。神经生长因子的实例包括，但不限于，干扰素γ、神经生长因子、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、neurogenin、脑衍生神经营养因子(BDNF)、甲状腺激素、骨形态发生蛋白(BMP)、白血病抑制因子(LIF)、sonic hedgehog、和神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素、干扰素、干细胞因子(SCF)、活化素、抑制素、趋化因子、视黄酸和睫状神经营养因子(CNTF)。一方面，本发明考虑在可药用稀释剂或载体中包含VEGF-C和/或VEGF-D产物及神经生长因子的组合物。
本发明方法优选在所述个体患有以异常神经元细胞生长、神经元结疤和损伤或神经变性为特征的疾病或病症时实施。如果神经细胞和/或其轴突突起的存活或功能受到危害，则疾病或医学病症被认为是神经损伤。这样的神经损伤可以由于包括如下在内的状况所引起造成靠近损伤部位的轴突突起和/或神经细胞体变性的物理性损伤；局部缺血，如中风；暴露于神经毒素，例如癌和AIDS化疗剂，分别如顺铂和双脱氧胞苷(ddC)；慢性代谢疾病，例如糖尿病或肾功能障碍；和造成特定神经元群体变性的神经变性病如帕金森病、阿尔茨海默氏病、和肌萎缩性侧索硬化(ALS)。涉及神经损伤的病症包括帕金森病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化、中风、糖尿病性多发性神经病、毒性神经病、神经胶质疤痕、和神经系统的物理性损伤，例如由于脑和脊髓的物理性损伤或手臂和手或身体其它部分的压伤或割伤造成的那些神经系统物理性损伤，包括暂时性或永久性的流向部分的神经系统的血流中止，如在中风中。
在一个实施方案中，所治疗的疾病或病症是神经变性病，其中该神经变性病选自阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿氏病、运动神经元病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、痴呆和大脑麻痹。另一实施方案中，疾病或病症选自神经创伤或神经损伤。也可以实施本发明方法，以治疗或改善神经创伤或损伤，例如与中风相关的损伤、脊髓损伤、手术后损伤、脑缺血和其它创伤的后果。
本发明可以用于治疗因各种病症所引起的中枢神经系统损伤的一种或多种不利后果。血栓、栓子和全身性血压过低是中风最常见的一些原因。其它损伤可以由如下引起高血压、高血压性脑血管疾病、动脉瘤破裂、血管瘤、恶血质(blood dyscrasia)、心力衰竭、心脏停搏、心原性休克、肾衰竭、脓毒性休克、头部创伤、脊髓创伤、癫痫、肿瘤出血、和血液体积或压力的其它丧失。这些损伤导致生理功能的破坏、神经元的后续死亡、和受影响的区域的坏死(梗死)。术语“中风(stroke)”意指所引起的与前述任何损伤有关的突然剧烈神经学缺陷。
术语“局部缺血”或“局部缺血事件”在本文中用于指导致组织的血液供应不足的任何情况。因此，中枢神经系统局部缺血事件由脑的任何部位的血液供应不足和中断所致，其中所述脑部位例如，但不限于大脑、小脑或脑干的部位。作为中枢神经系统的一部分的脊髓同样地易受到由于减少的血流而致的局部缺血的影响。局部缺血事件可以由于血管的狭窄或阻塞所致，同样地也可以在血栓或栓子的情况下发生。或者，如上所述，局部缺血可以由于任何形式的受损心脏功能，包括心脏停搏所致。当所述缺陷足够严重和持久时，可能导致生物功能受到破坏，之后神经元死亡和受影响的区域坏死(梗死)。因该损伤所致的神经学异常的程度和类型取决于梗死或局部缺血病灶的位置和大小。当局部缺血与中风相关时，其范围可以是全身性的或病灶性的。
预期本发明还可以用于治疗机械力(例如头部撞击)对中枢神经系统造成的创造性损伤。创伤可以涉及选自擦伤、割伤、撞伤、刺伤、压伤等的组织损害，例如可能因哺乳动物头、颈或脊柱的任何部分或其附属部分与外物的创伤性接触所致的组织损害。创伤性损伤的其它形式可以因体液的不适当积累(例如，正常脑脊液或玻璃体液的产生、更新或体积调节的阻断或功能紊乱，或硬膜下或颅内血肿或水肿)对哺乳动物CNS组织造成的压迫或挤压而引起。类似地，创伤性压迫或挤压可以因存在异常组织块，例如，转移性肿瘤或原发性肿瘤而发生。
此外可以考虑通过共施用VEGF-C产物或VEGF-D产物和神经治疗剂，实施本发明方法。“神经治疗剂”指用于治疗神经变性病或治疗神经创伤和神经损伤的药剂。示例性神经治疗剂包括tacrine(Cognex)、多奈哌齐(donepezil)(Aricept)、酒石酸卡巴拉汀(Rivastigmine)(Exelon)、galantamine(Reminyl)，以及胆碱脂酶抑制剂和抗炎药，其可以用于治疗阿尔茨海默氏病和其它神经变性病。
其它神经治疗剂包括抗胆碱能药物、多巴胺激动剂、儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)、金刚胺(amantadine)(Symmetrel)、Sinemet_、司来吉兰(selegiline)、卡比多巴(Carbidopa)、罗匹尼罗(Ropinirole)(Requip)、辅酶Q10、普拉克索(Pramipexole)(Mirapex)和左旋多巴(levodopa)(L-dopa)，它们可以用于治疗帕金森病以及其它神经变性病。详述部分列出了更多的治疗剂。
VEGF-C对少突胶质细胞和少突胶质细胞前体的作用的证据支持了本发明的其它变化方案。例如，在另一实施方案中，本发明提供在哺乳动物个体中促进少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞募集、增殖、分化、迁移或存活的方法，包括向所述个体施用包含血管内皮生长因子C(VEGF-C)产物或血管内皮生长因子D(VEGF-D)产物的组合物。用于实施本发明的VEGF-C和VEGF-D产物包括以上定义的产物，包括基于多肽的和基于多核苷酸的产物。本发明被考虑在驯化的动物(例如狗、猫、家畜)和实验室模型(例如，小鼠、大鼠、非人灵长类动物)上实施。优选使用VEGF-C或VEGF-D产物的人类形式在人类上的实施。高度优选VEGF-C产物。
在一个变化方案中，该方法还包括步骤在施用步骤前鉴定或选择需要募集、增殖或分化少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的哺乳动物个体。例如，少突胶质细胞涉及髓鞘形成，可以通过个体患有以脱髓鞘为特征的疾病或病症而鉴定/选择该个体。
在一个相关实施方案中，本发明包括使用VEGF-C或VEGF-D产物刺激少突胶质细胞前体细胞增殖或分化的方法。例如，一个此类方法包括从哺乳动物个体，优选人，获得包含少突胶质细胞前体细胞的生物学样品，和使该少突胶质细胞前体细胞与包含血管内皮生长因子C(VEGF-C)产物或血管内皮生长因子D(VEGF-D)产物的组合物接触。
所述接触涉及可以将VEGF-C或D产物有效地递送给靶细胞的任何过程。在一个变化方案中，所述接触包括在含有VEGF-C产物或VEGF-D产物的培养基中培养少突胶质细胞前体细胞。在另一变化方案中，用VEGF-C或D产物转化或转染所述细胞。
在优选实施方案中，可能期望在用VEGF-C或D产物进行处理之前和/或处理之后纯化靶细胞群，由此获得被富集的或更优选地被高度纯化的目的细胞群。因此，在一个变化方案中，该方法还包括步骤在接触步骤之前从样品中纯化和分离少突胶质细胞前体细胞。在另一变化方案中，该方法还包括步骤在接触步骤后纯化和分离少突胶质细胞前体细胞，以分离已对VEGF-C或D产物处理产生应答的细胞群。在一个高度优选的变化方案中，两个纯化步骤均加以使用。在再一变化方案中，本发明包括根据这些方法培养的、纯化的和分离的少突胶质细胞前体细胞。
根据前述方法培养的细胞可以用于细胞置换疗法以治疗以异常或不足的少突胶质细胞功能为特征的疾病。因此，在另一变化方案中，这些方法任选地还包括步骤在所述接触步骤后将少突胶质细胞前体细胞施用给所述哺乳动物个体。
这些细胞可以用于异种移植以及同种移植。因此，在再一变化方案中，该方法还包括步骤在接触步骤后将所述少突胶质细胞前体细胞移植入不同哺乳动物个体中。
可以使用任何已知方法递送细胞。例如，在一个变化方案中，将细胞离体接种在组织、器官或人工基质中，并将所述组织、器官或人工基质附着到、植入、或移植入哺乳动物个体。在另一变化方案中，考虑直接地注射入中枢或周围神经系统。
在一个相关实施方案中，少突胶质细胞从其它来源获得。例如，本发明包括在体外诱导少突胶质细胞前体细胞增殖的方法，包括使少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞接触包含VEGF-C产物或VEGF-D产物的组合物，其中所述少突胶质细胞前体细胞选自CG-4细胞、SVG p12胎儿神经胶质细胞系、DBTRG-05MG神经胶质细胞系、纯化的少突胶质细胞前体细胞、分离的NG2蛋白聚糖(NG2+细胞)、骨髓来源的神经干细胞和人神经元祖先细胞系。任选地，该方法还包括步骤如本文所述的，在接触步骤后将少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞施用给哺乳动物个体。
正如在本文其它地方更详细描述的，VEGF-C或VEGF-D产物可以任选地在一起共施用和/或与神经生长因子和/或神经治疗剂共施用。
前述方法特别考虑施用于患有以少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的异常生长或功能为特征的疾病或病症的个体。尤其考虑将本发明方法施用于患有以神经系统脱髓鞘为特征的病症的个体。用于治疗的疾病和病症的例子包括多发性硬化、苯丙酮酸尿症、脑室周围白质软化(periventricularleukomalacia，PVL)、HIV-1脑炎(HIVE)、格林-巴利综合征(Guillian-Barresyndrome，GBS)、急性炎性脱髓鞘性多发性神经病(AIDP)、急性运动性轴索型神经病(AMAN)、急性运动感觉性轴索型神经病(AMSAN)、Fisher综合症、急性全自主神经病变(pandysautonomia)和Krabbe氏病。
在另一变化方案中，待治疗的哺乳动物个体患有慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)。CIPD的例子包括MADSAM(多病灶获得性脱髓鞘感觉运动性神经病，也称作Lewis-Sumner综合症)和DADS(远端获得性脱髓鞘对称性神经病)。
罹患神经创伤或神经损伤的个体也预期可以从这些方法获益。例如，可以考虑治疗遭受中风相关损伤、脊髓损伤、手术后损伤和脑局部缺血的个体。
本发明还考虑，抑制VEGF-C活性可以用于治疗以神经元细胞的过度增殖为特征的病状。在神经干细胞发育中抑制VEGF-C可以减少造成成神经细胞瘤(例如，交感神经节)和其它神经来源肿瘤的神经元细胞的增殖，由此减缓癌症进程。最常见的脑肿瘤是神经胶质瘤，其起始于神经胶质组织。从称作星形胶质细胞的星状小细胞产生的星形细胞瘤最常在成年大脑中出现。III级星形细胞瘤有时称作间变型星形细胞瘤(anaplastic astrocytoma)。IV级星形细胞瘤通常称作多形性成胶质细胞瘤。脑干神经胶质瘤出现在脑的最低干状部分。脑干控制着许多重大功能。大多数脑干神经胶质瘤是高级别的星形细胞瘤。室管膜瘤通常发生在脑室衬里中。它们也可以出现在脊髓中。少突胶质细胞瘤出现在产生髓鞘脂(保护神经的脂肪覆盖物)的细胞中。这些肿瘤通常出现在大脑中。它们生长缓慢并且通常不扩散入周围脑组织。成神经管细胞瘤产生自正常不存在于出生后的身体中的原始神经细胞。由于此原因，成神经管细胞瘤有时称作原始神经外胚层肿瘤(PNET)。大多数成神经管细胞瘤出现在小脑中；然而，它们也可以出现在其它区域。脑脊膜瘤产生自脑膜。它们通常是良性的。由于这些肿瘤生长非常缓慢，脑可能能够调整以适应其存在；脑脊膜瘤在引起症状前常常生长得很大。它们最常见于30至50岁的女性。施万细胞瘤是起始于产生保护听神经的髓鞘脂的施万细胞的良性肿瘤。听神经瘤是一类施万细胞瘤。颅咽管瘤发生在靠近下丘脑的脑垂体区域。它们通常是良性的；然而，由于它们可以压迫或损伤下丘脑并影响生命机能，故有时它们被认为是恶性的。生殖细胞肿瘤产生自原始(发育中的)性细胞或生殖细胞。在脑中最常见的生殖细胞肿瘤类型是生殖细胞瘤。松果体区域肿瘤出现在松果体中或周围。该肿瘤可以是缓慢生长的松果体细胞瘤或快速生长的(成松果体细胞瘤)。松果体区域是非常难于到达的，这些肿瘤常常不能被移除。脑肿瘤的治疗方法取决于多种因素。其中包括肿瘤的类型、位置和大小以及患者的年龄和一般健康状况。正常地，脑肿瘤通过手术、放疗和化疗治疗。一方面，本发明提供抑制成神经细胞瘤和神经肿瘤的生长和进程的方法，包括向患有成神经细胞瘤或神经元肿瘤的个体施用包含VEGF-C或VEGF-D抑制剂的组合物。
另一方面，本发明提供抑制成神经细胞瘤和神经肿瘤的生长和进程的方法，包括向患有成神经细胞瘤或神经肿瘤的个体施用包含VEGF-C或VEGF-D抑制剂的组合物以及PDGF拮抗剂或PDGFR拮抗剂。一个实施方案中，PDGFR拮抗剂是甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate)(STI571/gleevec)。近来的证据(Leppanen等，Circulation 1091140-6，2004)显示，在高胆固醇血症兔子中STI571/gleevec提高局部脉管内VEGF-C基因转移在降低新血管内膜生长方面的效率。据推测，gleevec通过降低间质压力(已经证实这对于癌症治疗是重要的并且一般地可以增加任何药物的摄取)增加VEGF-C的基因转移。
VEGF-C抑制剂可以是，例如，通过阻断VEGF-C与其任何一种受体，VEGFR-2、VEGFR-3、NRP-1或NRP-2，的结合，或通过降低VEGF-C的表达，特异地降低VEGF-C的促有丝分裂活性的任何分子。所施用的VEGF-C抑制剂可以是包含与VEGF-C蛋白质结合的可溶性VEGFR-2多肽片段、与VEGF-C蛋白质结合的可溶性VEGFR-3多肽片段、与VEGF-C蛋白质结合的可溶性NRP-1多肽片段、与VEGF-C蛋白质结合的可溶性NRP-2多肽片段的多肽，VEGF-C反义多核苷酸或短干扰RNA(siRNA)、抗VEGF-C抗体、包含抗VEGF-C抗体的抗原结合片段的多肽和VEGF-C的任何小分子抑制剂。本发明也考虑类似于上述VEGF-C抑制剂的VEGF-D抑制剂。
一方面，VEGF-C抑制剂包含含有哺乳动物VEGFR-2胞外域片段、VEGFR-3胞外域片段、NRP-1胞外域片段或NRP-2胞外域片段的可溶性VEGFR-2、VEGFR-3、NRP-1或NRP-2多肽片段，其中所述片段与VEGF-C蛋白质结合。优选地，所述VEGFR-2、VEGFR-3、NRP-1或NRP-2片段是人的。在一个变化方案中，VEGFR-3胞外域片段含有VEGFR-3的免疫球蛋白结构域1至3。在另一实施方案中，本发明所考虑的胞外域片段包含SEQID NO32中给出的人VEGFR-3的第33至324位氨基酸。在备选实施方案中，可溶性VEGFR-2、VEGFR-3、NRP-1或NRP-2片段与免疫球蛋白Fc域连接。
一个实施方案中，VEGF-C抑制剂包含如下多肽，该多肽含有与包含维持了VEGF-C结合活性的人VEGFR-2(SEQ ID NO30)胞外片段的氨基酸至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列、与包含维持了VEGF-C结合活性的人VEGFR-3(SEQ ID NO32)胞外片段的氨基酸至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列、与包含维持了VEGF-C结合活性的人NRP-1(SEQ ID NO2)胞外片段的氨基酸至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列、或者与包含维持了VEGF-C结合活性的人NRP-2(SEQ ID NO4)胞外片段的氨基酸至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。
在另一实施方案中，VEGF-C抑制剂组合物包含由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在中等或高度严紧条件下与编码SEQ ID NO32的33-324位氨基酸的多核苷酸的互补序列杂交。中等严紧杂交条件的例子是在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中于65℃杂交，并在0.2XSSC/0.1％SDS中于42℃洗涤。高度严紧杂交条件的例子是0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中于65℃杂交，并在0.1XSSC/0.1％SDS中于68℃洗涤。本领域技术人员理解，可以按照Ausubel等(编)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(1994)，pp.6.03-6.4.10中所述，通过变化温度和缓冲液或盐浓度获得具有等同严紧性的条件。
在本发明方法中使用的VEGF-C反义核酸分子包含与靶序列中任何整数数目(大约10至500，优选10至50的整数)的核苷酸互补的序列。在示例性实施方案中，VIEGF-C反义分子包含长度至少大约10、25、50、100、250或500个核苷酸的互补序列或者与整个VEGF-C编码链互补的互补序列。更特别考虑长10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸的反义分子。
考虑用于本发明的siRNA同时提供VEGF-C mRNA的有义和反义编码链。siRNA典型地长30个核苷酸或少于30个核苷酸，更优选地21至23个核苷酸，具有特征性的2至3个核苷酸的3’突出端，这些突出端由核糖核酸酶III切割较长的dsRNA而产生。
本发明还提供在可药用稀释剂或载体中包含VEGF-C产物或VEGF-D产物和神经生长因子的组合物。本发明还考虑在可药用稀释剂或载体中包含VEGF-C产物或VEGF-D产物和神经治疗剂的组合物。
在另一实施方案中，本发明考虑，与PDGF-A或PDGF-C组合物或产物的施用相联合来使用上述任何VEGF-C或VEGF-D组合物或产物的方法。所述联合包括在不同于VEGF-C或VEGF-D组合物的组合物中、并且与VEGF-C或VEGF-D产物施用并行地或在VEGF-C或VEGF-D产物施用之前或之后(见本文的详述部分)施用。在一个相关实施方案中，所述与PDGF-A或PDGF-C联合包括施用VEGF-C或VEGF-D组合物，其中该组合物还包含PDGF-A或PDGF-C或PDGF-B或PDGF-D。
“PDGF产物”的定义借鉴VEGF-C或VEGF-D产物的定义，包括例如全长的、成熟的、和片段的蛋白质，蛋白质变体，编码多核苷酸和载体，宿主细胞等。
另一方面，本发明提供筛选VEGF-C对神经干细胞或神经前体细胞生长、迁移、分化或存活的刺激作用的调节剂的方法，包括使包含VEGF-C多肽的组合物和神经细胞或神经前体细胞在有和无被测药剂存在时接触；测量细胞在有和无该药剂存在时的生长、迁移、分化或存活；和基于存在被测药剂时相对于不存在被测药剂时的差异测量结果，将该药剂鉴定为调节VEGF-C对神经细胞或神经前体的作用的调节剂。
在一个相关实施方案中，本发明提供筛选VEGF-D刺激作用的调节剂的方法，该方法基本上同前段描述的涉及VEGF-C的方法。
在进一步的实施方案中，神经前体细胞包括神经元前体细胞。在另一实施方案中，神经前体细胞包括少突胶质细胞前体细胞。
可以考虑，神经干细胞或神经前体细胞包括本文所述的神经干细胞或从个体分离的神经干细胞。在一个实施方案中，所述细胞包括表达VEGFR-3的神经细胞系或神经前体细胞。在另一实施方案中，神经细胞系或神经前体细胞表达神经毡蛋白2。在再一实施方案中，神经细胞系或神经前体细胞表达VEGFR-3和神经毡蛋白-2。
为了本发明的目的，VEGF-C或VEGF-D的调节剂是刺激神经干细胞或神经前体细胞生长、迁移、分化或存活的刺激作用的激动剂，其中通过细胞表面神经细胞标志染色的增加，或所检测到的细胞中增殖性标志的增加来检测激动剂。为了本发明的目的，VEGF-C或VEGF-D的调节剂是刺激神经干细胞或神经前体细胞生长、迁移、分化或存活的刺激作用的拮抗剂，其中通过细胞表面神经细胞标志染色的减少，或所检测到的细胞中增殖性标志的减少来检测拮抗剂。迁移可以使用标准趋化性或化动性试验测量。
神经细胞标志在本文中于详述部分中描述，包括但不限于诸如NG2+、Olig2、O4(用于少突胶质细胞)、GFAP、Glast、(用于神经胶质细胞)Tuj-1和p75 NGF-受体(用于原代神经元)、泛细胞角蛋白(pan-cytokeratin)(上皮结构)和酪氨酸羟化酶(TH)、神经丝抗体(分化的神经元)的分子。考虑用于检测激动剂或拮抗剂的增殖性标志包括但不限于丝裂霉素试验、氚化胸苷或Brdu掺入或Ki-67染色。
对于与治疗方法相关进行描述的本发明每一方面，本发明的另一相关方面包括所述治疗剂或产物在制备用于达到所述生物学效果或用于治疗或改善所述疾病或病症或其症状的药物中的用途。
因此，另一方面，本发明考虑血管内皮生长因子C(VEGF-C)产物或血管内皮生长因子D(VEGF-D)产物在制备用于促进神经细胞或神经前体细胞的募集、增殖、分化、迁移或存活的药物中的用途。一个实施方案中，所述药物促进神经细胞或神经元前体细胞的募集、增殖、分化、迁移或存活。在一个相关实施方案中，所述药物促进少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的募集、增殖或分化。
本发明还考虑使用VEGF-C或VEGF-D产物制备治疗本文所述神经病的药物。所考虑的神经病是神经变性、神经细胞的异常生长、神经创伤、和与脱髓鞘相关的疾病或病症。
本领域技术人员将从本申请的整体上明了本发明的其它特点和变化方案，所有这些特点均旨在构成本发明的方面。
同样地，本文中描述的本发明特点可以重组为其它实施方案，这些实施方案也旨在构成本发明的方面，而不论该特征的结合是否在上面作为本发明的一个方面或实施方案作了特别提及。此外，只有在本文中描述为本发明关键因素的限制条件才应按照所述的方式来看待；缺乏未在本文中被描述为关键性的限制条件的本发明变化方案旨在构成本发明的方面。
本发明的实施方案按照谈及VEGF-C基因或蛋白质或其抑制剂或片段或变体的用途的方式进行描述。对于所有这些实施方案，还特别考虑使用VEGF-D基因或蛋白质或抑制剂或片段或变体的实施方案的实施以及联合疗法，即使该实施方案未就VEGF-D或联合治疗进行过特别的描述(重复)。
除了前述，本发明的其它方面还包括所有在范围上以任何方式小于以上具体提及的变化方案的本发明实施方案。尽管本申请人发明了后附权利要求的整个范围，但是所附权利要求不旨在在其范围内包括他人的现有技术工作。因此，一旦专利局或其它实体或个体使申请人注意到权利要求范围内的法定现有技术，申请人保留在适用的专利法律下实施修改的权利，以重新定义权利要求的主题以便从权利要求的范围中具体排斥该法定现有技术或法定现有技术的显而易见变体。通过这些修改的权利要求定义的本发明的变化方案也旨在成为本发明的部分。
附图简述

图1描述神经毡蛋白-2IgG融合蛋白a17和a22表达载体的构建。
发明详述本发明部分地基于蛋白质之间的新相互作用的发现，其中所述蛋白质先前已经在文献中被表征过，但是其相互作用先前并不明了，而且先前也不明了它的生物学效应。大量的分子可以利用对Genbank数据库或所附序列表的注释清楚地加以陈述，但是可以理解也可以容易地从数据库检索到和/或从天然来源中分离出物种同源物(“直向同源物”)的序列。因此，下面的表和描述应当被认为是示例性的而非限制性的。
A.本发明的目的分子


*所有序列除非另行注明否则是人来源的神经毡蛋白家族神经毡蛋白-1和神经毡蛋白-2基因的全长分别为120和112kb以上，其均由17个外显子组成，其中5个外显子在两个基因中大小相同，说明这两个基因的遗传重复(Rossignol等，Genomics 70211-22，2000)。至今已经分离到神经毡蛋白的几个剪接变体，其功能意义目前尚在研究中。
称作NRP2a和NRP2b的NRP-2的同种型首先从小鼠基因组中分离(Chen等，Neuron 19547-59，1997)。在小鼠中，NRP2a同种型在NRP-2的氨基酸809后含有0、5、17和22(5+17)个氨基酸插入，分别称作NRP2a(0)(Genbank登录号AF022854)(SEQ ID NO7和8)、NRP2a(5)(Genbank登录号AF022861)、NRP2a(17)(Genbank登录号AF022855)和NRP2a(22)(Genbank登录号AF022856)。仅阐明了与小鼠变体NRP2a(17)(Genbank登录号AF022860)(SEQ ID NO3和4)和NRP2a(22)同源的两个人NRP2a同种型。人a(22)同种型在NRP2a(17)的氨基酸808后含有5个氨基酸的插入，序列为GENFK。对脑、心、肺、肾、肝和胎盘的组织分析显示，a(17)同种型在所有这些位点中丰度更高。
人NRP2b同种型看来表达在NRP2a和NRP-1中不存在的额外外显子，该外显子命名为外显子16b。已经鉴定了两个与小鼠NRP2b(0)(Genbank登录号AF022857)和NRP2b(5)(Genbank登录号AF022858)同源的人NRP2b同种型，其在NRP2b(0)的氨基酸808位后含有0个或5个(GENFK)氨基酸插入(Rossignol等，Genomics 70211-22，2000)。组织分布分析显示，人NRP2b(0)(Genbank登录AF280544)与NRP2b(5)(Genbank登录号AF280545)相比在成年脑、心、肺、肾、肝和胎盘中有更高表达。NRP2a和NRP2b同种型在其C末端，即NRP2氨基酸808(氨基酸808位于c结构域和跨膜结构域之间的接头区域中)之后，显示不同。这种差别剪接可能导致了在这两种同种型的组织表达上见到的差异，其中在胎盘、肝和肺中NRP2a的表达丰度更高而NRP2b仅有可检测的水平，但在NRP2a低表达的骨骼肌中发现NRP2b。两种同种型均在心脏和小肠中表达。
除了神经毡蛋白的遗传同种型外，还克隆了这些蛋白质的截短可溶性形式(Gagnon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 972573-78，2000；Rossignol等，Genomics 702 11-22，2000)。NRP-1蛋白质的天然截短形式s11NRP1(Genbank登录号AF280547)和s12NRP1已经获得克隆，它们分别编码704和644个氨基酸的神经毡蛋白-1，并且含有a和b域但无c域。s12NRP1变体通过内含子12中的信使RNA前体(pre-mRNA)加工而产生。s11NRP1截短发生在氨基酸621后，缺少外显子12编码的20个氨基酸，但含有在内含子11中发现的编码序列，该编码序列使该蛋白质在C端具有83个新氨基酸。该内含子来源序列不含有已知蛋白质的任何同源物。
此外还鉴定了天然可溶性形式的NRP-2，其编码含有a域、b1域和部分b2域(缺少该区域的最后48个氨基酸)的555个氨基酸的蛋白质。该截短发生在氨基酸547后内含子9中，由此该蛋白质已被命名为s9NRP2(Genbank登录号AF2805446)，并由于该内含子的断裂得到8个新的氨基酸(VGCSVWRPL)添加至C端。Gagnon等(Proc.Natl.Acad.Sci USA 972573-78，2000)报道，可溶性神经毡蛋白-1同种型s12NRP1与全长蛋白质相同能够结合VEGF165，但是作为VEGF165结合的拮抗剂起作用，从而抑制VEGF165活性并在大鼠前列腺癌模型中显示出抗肿瘤性质。
PDGF/VEGF家族PDGF/VEGF生长因子家族包括至少如下成员PDGF-A(见例如，Genbank Acc.No.X06374)、PDGF-B(见例如，Genbank Acc.No.M12783)、VEGF(见例如，Genbank Acc.No.Q16889，在本文中为了清楚起见称作VEGF-A或通过具体同种型提及)、PIGF(见例如，Genbank Acc.No.X54936，胎盘生长因子)、VEGF-B(见例如，Genbank Acc.No.U48801；也称作VEGF相关因子(VRF))、VEGF-C(见例如，Genbank Acc.No.X94216；也称作VEGF相关蛋白(VRP或VEGF-2))、VEGF-D(也称作c-fos诱导的生长因子(FIGF)；见例如，Genbank Acc.No.AJ000185)、VEGF-E(也称作NZ7 VEGF或OVNZ7；见例如，Genbank Acc.No.S67522)、NZ2 VEGF(也称作OV NZ2；见例如，Genbank Acc.No.S67520)、D1701 VEGF样蛋白(见例如，Genbank Acc.No.AF106020；Meyer等，EMBO J18363-374)和NZ10 VEGF样蛋白(描述在国际专利申请PCT/US99/25869中)[Stacker和Achen，Growth Factors 171-11(1999)；Neufeld等，FASEB J139-22(1999)；Ferrara，J.Mol Med 77527-543(1999)]。PDGF/VEGF家族蛋白质主要是分泌型糖蛋白，形成二硫键连接的或非共价结合的同或异二聚体，二聚体的亚基以反平行方式排列[Stacker和Achen，Growth Factors 171-11(1999)；Muller等，Structure 51325-1338(1997)]。
PDGF-A和PDGF-B可以同二聚体化或异二聚体化，产生三种不同同种型PDGF-AA、PDGF-AB或PDGF-BB。PDGF-A仅能够结合PDGFα-受体(PDGFR-α，包括PDGF-α/α同二聚体)。PDGF-B可以结合PDGFR-α和第二PDGF受体(PDGFR-β)。更具体地，PDGF-B可以结合PDGFR-α/α和PDGFR-β/β同二聚体以及PDGFR-α/β异二聚体。
PDGF-AA和PDGF-BB是间充质来源细胞的主要有丝分裂原和化学引诱物，但是对内皮谱系的细胞不具有或几乎不具有作用，但是PDGFR-α和β均在内皮细胞(E)上表达。PDGF-BB和PDGF-AB已经被证明参与新形成的脉管的稳定化/成熟(Isner等，Nature 415234-9，2002；Vale等，J IntervCardiol 14511-28，2001)；Heldin等，Physiol Rev 791283-1316，1999；Betsholtz等，Bioessays 23494-507，2001)。然而其它数据显示，PDGF-BB和PDGF-AA通过PDGFR-α信号传导在体内抑制bFGF诱导的脉管发生。PDGF-AA是间充质细胞迁移的最有力刺激剂之一，但是其不刺激或极轻微地刺激E迁移。在某些条件下，PDGF-AA甚至抑制EC迁移(Thommen等，J Cell Biochem.64403-13，1997；De Marchis等，Blood 992045-53，2002；Cao等，FASEB J.161575-83，2002)。而且，PDGFR-α已经被证实拮抗PDGFR-β诱导的SM迁移(Yu等，Biochem.Biophys.Res.Commun.282697-700，2001)，针对PDGF-AA的中和抗体增强平滑肌细胞(SMC)迁移(Palumbo，R.等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.22405-11，2002)。因此，PDGF-A和PDGF-B的脉管生成/动脉生成活性，尤其在通过PDGFR-α进行信号转导时，一直是有争议的迷。
已经报道，PDGF-AA和BB在心血管和神经干细胞/祖先细胞的增殖和分化中起重要作用。PDGF-BB诱导Flk1+胚胎干细胞分化成脉管壁细胞(vascular mural cell)(Carmeliet，P.，Nature 40843-45，2000；Yamashita等，Nature 40892-6，2000)，并且有力地增强神经球(neurosphere)来源的神经元的存活(Caldwell等，Nat Biotechnol.19475-479，2001)；而PDGF-AA通过αvβ3整联蛋白刺激少突胶质细胞前体增殖(Baron等，Embo.J.211957-66，2002)。
PDGF-C结合PDGFR-α/α同二聚体，PDGF-D结合PDGFR-β/β同二聚体，据报道两者均结合PDGFR-α/β异二聚体。PDGF-C多肽和多核苷酸由Eriksson等在国际专利申请WO00/18212、美国专利申请公布号2002/0164687A1和美国专利申请号10/303,997[以美国专利公布号2003/0211994公布]中表征。PDGF-D多核苷酸和多肽由Eriksson等在国际专利公布号WO00/27879和美国专利申请公布号2002/0164710A1中表征。
PDGF-C多肽表现出与其它VEGF/PDGF家族成员不同的独特蛋白质结构。PDGF-C在N端区域中具有CUB域，该域在其它家族成员中不存在，此外，PDGF-C在VEGF同源域(VHD)中于保守的半胱氨酸3和4之间具有3个氨基酸插入(NCA)。PDGF-C的VHD最接近VEGF-C和VEGF-D的VHD。PDGF-C mRNA表达在心脏、肝、肾、胰腺和卵巢中最高，在大多数其它组织，包括胎盘、骨骼肌和前列腺中水平较低。含有VHD的PDGF-C的截短形式结合PDGF-α受体。
VEGF亚家族由共享VEGF同源域(VHD)的PDGF/VEGF成员组成，该域由序列C-X(22-24)-P-[PSR]-C-V-X(3)-R-C-[GSTA]-G-C-C-X(6)-C-X-(32-41)-C表征。
VEGF-A最初基于其对内皮细胞的促有丝分裂活性以及其诱导微脉管的通透性的能力从几种来源纯化，因此，其也被称作血管通透性因子(VPF)。随后证实VEGF-A诱导多种生理过程，包括动员细胞内钙、诱导纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制剂-1合成、体外促进单核细胞迁移、在人内皮细胞中诱导抗细胞凋亡蛋白表达、在内皮细胞中诱导穿孔(fenestration)、促进内皮细胞中细胞粘着分子的表达和诱导一氧化氮介导的血管舒张和低血压[Ferrara，J Mol Med 77527-543(1999)；Neufeld等，FASEB J 139-22(1999)；Zachaey，Intl J.Biochem Cell Bio 301169-1174(1998)]。
VEGF-A是分泌型二硫键连接的同二聚体糖蛋白，由23kD亚基组成。已经描述了长121、145、165、189或206个氨基酸的5种人VEGF-A同种型(VEGF121-206)，这些同种型由不同mRNA剪接变体编码，所有均能够在内皮细胞中刺激有丝分裂发生。然而，各同种型在生物学活性、受体特异性以及对与细胞表面和胞外基质结合的硫酸肝素蛋白聚糖的亲和力上存在差异，其中所述蛋白聚糖表现为VEGF-A的低亲和性受体。VEGF121不结合肝素和硫酸肝素；VEGF145和VEGF165(Genbank登录号M32977)两者均能够结合肝素；VEGF189和VEGF206表现出对肝素和硫酸肝素的最强亲和力。VEGF121、VEGF145和VEGF165以可溶性形式分泌，但是VEGF165大部分被局限在细胞表面和胞外基质蛋白聚糖上，而VEGF189和VEGF206保持与胞外基质的结合。VEGF189和VEGF206两者均能够通过用肝素或肝素酶处理而释放，说明这两种同种型通过蛋白聚糖与胞外基质结合。与细胞结合的VEGF189也可以通过蛋白酶，例如纤溶酶的作用而断裂，导致释放出活性可溶性VEGF110。表达VEGF的大多数组织被观察到同时表达几种VEGF同种型，尽管VEGF121和VEGF165是主要形式，而VEGF206很少被检测到[Ferrara，J Mol Med 77527-543(1999)]。VEGF145不同，其主要在生殖器官来源细胞中表达[Neufeld等，FASEB J139-22(1999)]。
VEGF-A的表达模式提示其参与正常脉管系统的发育和维持并参与和肿瘤生长及其它病理性病症例如类风湿性关节炎有关的脉管发生。VEGF-A在与正在发育中的脉管系统相关的胚胎组织中表达，并由许多肿瘤细胞系分泌。对VEGF-A由于定向基因破坏而被敲除的小鼠的分析显示，VEGF-A对于存活是关键的，并且心血管系统的发育对于VEGF-A浓度梯度高度敏感。缺乏单拷贝VEGF-A的小鼠在妊娠第11至12天死亡。这些胚胎表现出受损的生长和严重的发育异常，包括发育中的心血管系统的缺陷。VEGF-A也是出生后生长、器官发育、生长板形态发生(growth platemorphogenesis)的调节和软骨内骨形成所必需的。对VEGF-A的需要随着年龄的增长而降低，尤其在出生后第四周之后。在成熟动物中，主要在诸如伤口愈合和黄体发育等过程的活跃脉管发生上需要VEGF-A。[Neufeld等，FASEB J 139-22(1999)；Ferrara，J Mol Med 77527-543(1999)]。VEGF-A的表达主要受到低氧和多种激素和细胞因子(包括表皮生长因子(EGF)、TGF-β和各种白介素)的影响。调节主要发生在转录水平以及转录后水平，例如通过增加的mRNA稳定性进行调节[Ferrara，同上引文]。
PIGF，VEGF亚家族的第二成员，一般地与VEGF-A相比是很差的脉管发生和内皮细胞增殖刺激剂，PIGF的体内作用尚未得到充分理解。已经描述了通过可变mRNA剪接产生的3种PIGF同种型[Hauser等，GrowthFactors 9259-268(1993)；Maglione等，Oncogene 8925-931(1993)]。PIGF形成二硫键连接的同二聚体和与VEGF-A的异二聚体。PIGF-VEGF-A异二聚体比PIGF同二聚体更为有效地诱导内皮细胞增殖和脉管发生。PIGF主要在胎盘中表达，并且还与VEGF-A在早期胚胎发生期在体壁卵黄囊滋养层巨大细胞中共表达[Stacker和Achen，Growth Factors 171-11(1999)]。
VEGF-B在国际专利公布号WO96/26736和美国专利5,840,693和5,607,918(并入此处作为参考)中有详细描述，其与VEGF-A有大约44％氨基酸同一性。尽管VEGF-B的体内生物学功能仍未完全得以理解，但是已经证实其具有生脉管性质，并且还可能参与细胞粘着和迁移并参与调节胞外基质的降解。VEGF-B表达为167和186个氨基酸残基的两种同种型，这两种同种型由可变剪接产生。VEGF-B167通过肝素结合域与细胞表面或胞外基质结合，而VEGF-B186是分泌型的。VEGF-B167和VEGF-B186均可以形成二硫键连接的同二聚体或与VEGF-A的异二聚体。VEGF165-VEGF-B167异二聚体与细胞表面的结合似乎由VEGF-B成分决定，这提示异二聚体化可能对隔离(sequester)VEGF-A是重要的。VEGF-B主要在胚胎和成年心脏和骨骼肌组织中表达[Joukov等，J Cell Physiol 173211-215(1997)；Stacker和Achen，Growth Factors 171-11(1999)]。缺少VEGF-B的小鼠可以存活但是具有较小心脏及功能异常的冠状脉管系统，而且表现出自心脏局部缺血的恢复受损[Bellomo等，Circ Res 2000；E29-E35]。
VEGF亚家族的第四成员，VEGF-C，包含与VEGF-A在氨基酸水平上大约30％相同的VHD。VEGF-C最初表达为更大的前体蛋白，前VEGF-C原(prepro-VEGF-C)，该前体蛋白在VHD两侧具有延伸的氨基-和羧基-端肽序列，并且C端肽在Balbiani环3蛋白典型的基序中含有串联重复半胱氨酸残基。前VEGF-C原经历大规模的蛋白酶解成熟，涉及信号肽、C端前肽和N端前肽(pro-peptide)的相继切割以产生完全加工的成熟形式(ΔNΔCVEGF-C)。分泌的VEGF-C蛋白质包含非共价结合的同二聚体，在此同二聚体中每个单体都含有VHD。经过部分蛋白酶解加工产生的VEGF-C中间形式显示对VEGFR-3受体的增加亲和力，而且成熟蛋白还能够与VEGFR-2受体结合。[Joukov等，EMB0 J.，16(13)3898-3911(1997)]。也已经证实，突变VEGF-C(VEGF-CΔC156)——其156位的单半胱氨酸缺失或被另一氨基酸替代——丧失结合VEGFR-2的能力但仍能够结合和激活VEGFR-3[美国专利6,130,071和国际专利公布号WO98/33917]。在SEQ ID NO24的氨基酸156位的示例性替代包括在156位以丝氨酸残基替代半胱氨酸(VEGF-CC156S)。在小鼠胚胎中，VEGF-C mRNA主要在尿囊、颈静脉区(jugular area)和后肾中表达。[Joukov等J Cell Physiol 173211-215(1997)]。VEGF-C参与调节淋巴管发生；当VEGF-C在转基因小鼠皮肤中过表达时，观察到增生的淋巴管网络，提示VEGF-C诱导淋巴生长[Jeltsch等，Science，2761423-1425(1997)]。在成体中VEGF-C的持续表达也说明了其在分化的淋巴内皮的维持中的作用[Ferrara，J Mol Med 77527-543(1999)]。VEGF-C也表现出生脉管性质其可以刺激牛毛细管内皮(BCE)细胞在胶原中的迁移和促进人内皮细胞的生长[见例如美国专利6,245,530；美国专利6,221,839；和国际专利公布WO98/33917，并入此处作为参考]。
前VEGF-C原多肽经过多个阶段的加工而产生成熟的最具活性的VEGF-C多肽，该VEGF-C多肽大约21-23kD(通过还原条件下的SDS-PAGE评估)。这些加工包括切割信号肽(SEQ ID NO24，残基1-31)；切割羧基端肽(大约相应于SEQ ID NO24的氨基酸228-419)以产生大约29kD的部分加工形成；和切割(明显地在细胞外)氨基端肽(大约相应于SEQ ID NO24的氨基酸32-102)以产生大约21-23kD的完全加工的成熟形式。实验证据证明，VEGF-C的部分加工形式(例如，29kD形式)能够结合Flt4(VEGFR-3)受体，而与VEGFR-2的高亲和性结合仅出现在完全加工形式的VEGF-C上。VEGF-C多肽看来天然以非二硫键连接的二聚体形式缔合。
此外，已经证实，对于VEGF-C功能的维持，SEQ ID NO24的氨基酸103-227并非所有都是关键的。由SEQ ID NO24的氨基酸112-215(缺少残基103-111和216-227)组成的多肽保持结合和刺激VEGF-C受体的能力，并且预期跨度从大约残基131至大约残基211的多肽将保持VEGF-C生物学活性。156位的半胱氨酸残基已经被证实对VEGFR-2结合能力是重要的。然而，VEGF-C C156多肽(即，由于缺失或替代而缺少该半胱氨酸的类似物)仍是VEGFR-3的有力激活物。SEQ ID NO24的165位半胱氨酸是结合任一受体所必需的，而在83或137位置缺少半胱氨酸的类似物可以与天然VEGF-C竞争地结合和刺激两种受体。此外，可以考虑将如下嵌合的肝素结合型VEGF-C多肽用于本发明，在该嵌合多肽中与受体结合的VEGF-C序列与来自另一来源的肝素结合序列(天然的和合成的)融合。VEGF-C和VEGF-D的肝素结合形式在美国临时专利申请号60/478,390和美国专利申请系列号10/868,577(并入此处作为参考)中有更详细的描述。例如，可以构建编码包含信号序列和VEGF-C的VEGF同源域(VEGF homology domain)(VHD)(SEQ ID NO24)、以及VEGF外显子6-8(CA89)或外显子7-8(CA65)(SEQ ID NO20)-其编码肝素结合域-的嵌合蛋白的质粒。嵌合多肽CA65分泌并释放至上清液中，而CA89除非在培养基中包括肝素否则不释放至上清液中，这说明CA89显然与细胞表面硫酸肝素结合，类似于针对VEGF189已经描述过的情况。
VEGF-D在结构和功能上与VEGF-C最密切相关[见美国专利6,235,713和国际专利公布号WO98/07832，并入此处作为参考]。与VEGF-C相同，VEGF-D最初表达为将经历N端和C端蛋白酶解加工的前肽原，并且其形成非共价连接的二聚体。VEGF-D刺激内皮细胞的体外促有丝分裂反应。在胚胎发生期间，VEGF-D具有复杂的时空表达模式，并且其表达在成体的心脏、肺和骨骼肌中持续。国际专利公布号WO98/07832(并入此处作为参考)中描述命名为VEGF-DΔNAC的VEGF-D生物活性片段的分离。VEGF-DΔNΔC由VEGF-D(SEQ ID NO26)的93-201氨基酸残基组成，任选地与亲和标签肽FLAG_或其它序列连接。
前VEGF-D原多肽具有21个氨基酸的推测信号肽，并且显然地以类似于前VEGF-C原加工的方式接受蛋白酶解加工。缺少SEQ ID NO26的1-92和202-354残基的“重组成熟”VEGF-D保留激活受体VEGFR-2和VEGFR-3的能力，并且看来缔合为非共价连接的二聚体。因此，优选的VEGF-D多核苷酸包括那些含有编码SEQ ID NO26的氨基酸93-201的核苷酸序列的多核苷酸。以上提供的用于向VEGF-C多肽中导入保存功能的修饰的指导也适用于向VEGF-D多肽导入保存功能的修饰。VEGF-D的肝素结合形式也在考虑之列。见美国临时专利申请号60/478,390，并入此处作为参考。
在感染人、绵羊和山羊的痘病毒中还鉴定到VEGF亚家族的4个其它成员。口疮病毒编码的VEGF-E和NZ2 VEGF是有力的有丝分裂原和通透性增强因子。两者均表现出与哺乳动物VEGF-A大约25％的氨基酸同一性，并且表达为二硫键连接的同二聚体。这些病毒的感染的特征在于脓疱性皮炎，其中可能涉及到由这些病毒的VEGF蛋白诱导的内皮细胞增生和脉管透性。[Ferrara，J Mol Med 77527-543(1999)；Stacker和Achen，GrowthFactors171-11(1999)]。此外，从另外的两个口疮病毒株，D1701[GenbankAcc.No.AF106020；描述于Meyer等，EMBO J 18363-374(1999)]和NZ10[描述于国际专利申请PCT/US99/25869，并入此处作为参考]，也鉴定到VEGF样蛋白。这些VEGF样病毒蛋白已经被证实可以结合宿主内皮上存在的VEGFR-2，而且该结合对于感染的发展和病毒对脉管发生的诱导是重要的[Meyer等，同上引文；国际专利申请PCT/US99/25869]。
PDGF/VEGF受体已经鉴定了7种与PDGF/VEGF家族成员相互作用的细胞表面受体。这些受体包括PDGFR-α(见例如，Genbank Acc.No.NM006206)、PDGFR-β(见例如，Genbank Acc.No.NM002609)、VEGFR-1/Flt-1(fms样酪氨酸激酶-1；Genbank Acc.No.X51602；De Vries等，Science255989-991(1992))；VEGFR-2/KDR/Flk-1(含有激酶插入域的受体/胎肝激酶-1；Genbank Acc.No.X59397(Flk-1)和L04947(KDR)；Ternan等，Biochem Biophy Res Comm1871579-1586(1992)；Matthews等，Proc Natl Acad Sci USA 889026-9030(1991))；VEGFR-3/Flt4(fms样酪氨酸激酶4；美国专利号5,776,755和Genbank Acc.No.X68203和S66407；Pajusola等，Oncogene93545-3555(1994))、神经毡蛋白-1(Genbank Acc.No.NM003873)和神经毡蛋白-2(Genbank Acc.No.NM003872)。两种PDGF受体介导上述PDGF的信号传导。VEGF121、VEGF165、VEGF-B、PIGF-1和PIGF-2结合VEGF-R1；VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和NZ2 VEGF结合VEGF-R2；VEGF-C和VEGF-D结合VEGFR-3；VEGF165、VEGF-B、PIGF-2和NZ2VEGF结合神经毡蛋白-1；VEGF165和VEGF145结合神经毡蛋白-2。[Neufeld等，FASEB J 139-22(1999)；Stacker和Achen，Growth Factors 171-11(1999)；Ortega等，Fron Biosci 4141-152(1999)；Zachary，Intl J Biochem Cell Bio 301169-1174(1998)；Petrova等，Exp. Cell Res 253117-130(1999)；Gluzman-Poltorak等，J.Biol.Chem.27518040-45(2000)]。
PDGF受体是蛋白质酪氨酸激酶受体(PTK)，其在胞外域中含有5个免疫球蛋白样环。VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3包含PTK的PDGF亚家族的一个亚组，其区别特征在于胞外域中存在7个Ig域以及胞质域中存在断裂的激酶域。神经毡蛋白-1和神经毡蛋白-2均是非PTK的VEGF受体，具有目前已知不具备下游信号转导能力的短胞质尾。
几种VEGF受体表达为1种以上的同种型。缺少第7个Ig样环、跨膜域和胞质区的VEGFR-1的可溶性形式在人脐静脉内皮细胞中表达。该VEGFR-1同种型以高亲和性结合VEGF-A，并且能够防止VEGF-A诱导的促有丝分裂反应[Ferrara等，J.Mol Med 77527-543(1999)；Zachary，Intl JBiochem Cell Bio 301169-1174(1998)]。VEGFR-2的C端截短形式也已有报道[Zachary，同上引文]。在人类中，有两种VEGFR-3蛋白质同种型，其差异在于C末端的长度。研究提示较长的同种型负责VEGFR-3的大多数生物学性质。
VEGFR-1的表达主要发生在脉管内皮细胞中，但是单核细胞和肾血管系膜细胞[Neufeld等，FASEB J 139-22(1999)]、滋养层细胞(Charnock-Jones，Biol Reprod 51524-30，1994)、造血干细胞(Luttun等，Ann N Y Acad Sci97980-93，2002)、产精细胞和莱迪希细胞(Leydig cell)(Korpelainen等，J Cell Biol1431705-12，1998)及平滑肌细胞(Ishida等，J.Cell Physiol.188359-68，2001)上可能存在一些表达。此外，在成年器官中也检测到高水平VEGFR-1mRNA，说明VEGFR-1在成熟脉管的静止内皮中具有与细胞生长无关的功能。VEGFR-1-/-小鼠在第8.5至9.5天死于子宫中。尽管内皮细胞在这些动物中发育，但是功能性血管的形成严重地受损，提示VEGFR-1可能参与与细胞迁移有关的细胞-细胞或细胞-基质相互作用。近来，已经证实表达仅丧失了酪氨酸激酶域的突变VEGFR-1的小鼠表现出正常的脉管发生并存活，说明VEGFR-1的信号转导能力不是必需的。[Neufeld等，同上引文；Ferrara，J Mol Med 77527-543(1999)]。
VEGFR-2的表达类似于VEGFR-1的表达，VEGFR-2在脉管内皮中广泛地表达，但是其也存在于造血干细胞、巨核细胞和视网膜祖先细胞中[Neufeld等，同上引文]。尽管VEGFR-1和VEGFR-2的表达模式极大重叠，但是证据提示，在大多数细胞类型中，VEGFR-2是主要受体，大多数VEGF通过VEGFR-2实现其生物学活性。对VEGFR-2缺陷的小鼠胚胎的检查进一步指出，该受体是内皮细胞分化和造血细胞发育所必需的[Joukov等，JCell Physiol.173211-215(1997)]。
VEGFR-3在胚胎发生早期在内皮细胞中广泛地表达。在发育后期，VEGFR-3的表达局限于发育中的淋巴管[Kaipainen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，923566-3570(1995)]。成年个体中，淋巴内皮和一些毛细血管后微静脉表达VEGFR-3，并且在转移性淋巴结和淋巴管瘤中于淋巴窦内存在增加的表达。VEGFR-3也在通过过表达研究证实可能介导VEGF-C的髓细胞生成活性[WO98/33917]的CD34+造血细胞亚群中表达。定向破坏小鼠胚胎中的VEGFR-3基因，导致原始脉管网的重塑失败以及第9.5胚胎日后的死亡[Dumont等，Science，282946-949(1998)]。这些研究提示VEGFR-3在胚胎脉管系统发育中以及在淋巴管发生过程中的必要作用。
VEGF受体的结构分析指出，VEGFR-1和VEGFR-2上的VEGF-A结合位点位于第二和第三Ig样环中。类似地，VEGFR-2和VEGFR-3上的VEGF-C和VEGF-D结合位点也包含在第二Ig环中[Taipale等，Curr Top MicrobiolImmunol 23785-96(1999)]。第二Ig样环也赋予配体特异性，这通过结构域交换实验证实[Ferrara，J Mol Med 77527-543(1999)]。受体-配体研究说明，VEGF家族蛋白形成的二聚体能够结合两个VEGF受体分子，由此使VEGF受体二聚体化。VEGFR-1上的、以及可能地VEGFR-2上的第四Ig样环作为受体二聚体化结构域起作用，当受体与配体二聚体结合后该域将两个受体分子连接在一起[Ferrara，J Mol Med 77527-543(1999)]。尽管与VEGFR-1和VEGFR-2结合的VEGF-A的区域有很大程度的重叠，但是研究揭示VEGF-A中与VEGFR-1或VEGFR-2相互作用的是两个分开的结构域，并且揭示了这些结构域中对于配体-受体相互作用具有关键性的特殊氨基酸残基。已经发现在VEGF受体特异性结构域中可以特异地阻止与一种特定VEGF受体结合的突变[Neufeld等，FASEB J139-22(1999)]。
VEGFR-1和VEGFR-2结构类似，具有共同配体(VEGF121和VEGF165)，并且在发育过程中表现出相似的表达模式。然而，通过VEGFR-1和VEGFR-2由相同配体介导的信号表现出稍有不同。已经证实，响应VEGF-A，VEGFR-2将经历自磷酸化，但是在相同条件下几乎不能检测到VEGFR-1的磷酸化。VEGFR-2介导的信号造成重组过表达该受体的猪主动脉内皮细胞在形态学、肌动蛋白再组织和变皱膜运动(membrane ruffling)方面出现惊人改变。在这些细胞中，VEGFR-2也介导配体诱导的趋化性和促有丝分裂性；而VEGFR-1转染的细胞缺乏对VEGFR-A的促有丝分裂应答。在VEGF-A中导致破坏与VEGFR-2的结合的突变不能诱导内皮细胞增生，而与VEGFR-1的结合存在缺陷的VEGF-A突变体仍能够促进内皮增生。类似地，VEGF对仅表达VEGFR-2的细胞的刺激导致促有丝分裂应答，而对仅表达VEGFR-1的细胞施加相当的刺激作用尽管能够导致细胞迁移(例如，在单核细胞中)，但是不能诱导细胞增殖。此外，与VEGFR-1和VEGFR-2发生共沉淀的磷蛋白是不同的，提示不同的信号转导分子与受体特异的胞内序列相互作用。
新兴的假说是，VEGFR-1在脉管发生中的主要功能可能是通过与VEGF-A结合由此阻断VEGF-A与VEGFR-2间的相互作用而负面地调节VEGF-A的活性，而VEGFR-2被认为是内皮细胞中VEGF-A信号的主要转导蛋白。该假说得到如下支持VEGFR-1缺陷型小鼠于胚胎时死亡，而表达能够结合VEGF-A但是缺乏酪氨酸激酶域的VEGFR-1受体的小鼠存活并且不表现异常胚胎发育或脉管生成。此外，对仅结合VEGFR-2的VEGF-A突变体的分析说明，它们保留在内皮细胞中诱导促有丝分裂应答的能力。然而，VEGF介导的单核细胞迁移依赖于VEGFR-1，说明通过该受体的信号转导对于至少一种生物学功能是重要的。此外，VEGF-A阻止树突细胞成熟的能力也与VEGFR-1信号转导相关，提示VEGFR-1可能在内皮细胞以外的细胞类型中发挥作用。[Ferrara，J Mol Med 77527-543(1999)；Zachary，Intl J Biochem Cell Bio 301169-1174(1998)]。
对于用于实施本发明的VEGF-C多肽、神经毡蛋白或其它多肽，可以理解通常天然序列是最优选的。“天然序列”是指由天然存在的多核苷酸编码的序列，包括但不限于前肽原、前肽和部分地和完全地蛋白酶解加工的多肽。如上述，这些多肽中有许多存在由于例如可变RNA加工而产生的剪接变体，这些剪接变体包含在天然序列内。为了本文中描述的目的，前述蛋白的保留目的结合性质的片段也应当被视作天然序列。而且，可以对大多数蛋白质序列进行修饰，尤其是保守氨基酸替代，而不破坏蛋白质的目的活性，因此如此修饰的蛋白质也适用于实施本发明。“保守氨基酸替代”是指一个氨基酸被具有相似化学特征的侧链的氨基酸代替。用于实施保守替代的相似氨基酸包括具有酸性侧链(谷氨酸、天冬氨酸)；碱性侧链(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)；极性酰胺侧链(谷氨酰胺、天冬酰胺)；疏水脂族侧链(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸)；芳族侧链(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)；小侧链(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)；和脂族羟基侧链(丝氨酸、苏氨酸)的那些氨基酸。
而且，在不破坏期望活性的情况下缺失和添加氨基酸也常常是可能的。对于本发明，当尤其关心结合活性并且特别地关心分子激活或抑制受体酪氨酸激酶的能力时，可利用结合试验和酪氨酸磷酸化试验确定特定配体或配体变体是否(a)结合和(b)刺激或抑制RTK活性。
候选VEGF-C类似物多肽可以首先基于它们结合VEGF-C受体和(对于某些受体)刺激VEGF-C受体(VEGFR-2，VEGFR-3)自磷酸化或通过它们的受体(VEGFR-2，VEGFR-3，NRP-1和NRP-2)刺激细胞活化的能力，进行快速的筛选。刺激这些受体的多肽在体外基于它们对培养的毛细管或动脉内皮细胞(例如，见WO98/33917所述)的促有丝分裂活性和/或趋化性，快速地进行重筛选。然后，如本文中所述的，基于在本发明方法中的效力，体内筛选具有促有丝分裂活性和/或趋化性的多肽。以此方式，可以快速地筛选天然VEGF-C蛋白的变体(类似物)，确定这些变体是否具有必备的生物学活性以构成用于本发明中的“VEGF-C多肽”。
定义多肽变体种类的两种方式包括与天然多肽的氨基酸同一性百分数(例如，优选80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98和99％同一性)或编码多核苷酸在规定条件下相互杂交的能力。一套示例性条件如下42℃于50％甲酰胺、5XSSC、20mM NaPO4，pH6.8中杂交；和在1XSSC中55℃洗涤30分钟。计算等价杂交条件和/或选择其它条件以达到期望的严紧水平的公式是熟知的。本领域理解，具有等价严紧性的条件可以按照Ausubel等(编)，Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(1994)，pp.6.03-6.4.10所述，通过变化温度和缓冲液或盐浓度实现。杂交条件的改变可以通过经验确定，或者可以基于探针长度及探针中鸟嘌呤/胞嘧啶(GC)碱基对的百分数精确地计算。可以如Sambrook等(编)，Moleular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory PressCold Spring Harbor，New York(1989)，pp.9.47-9.51所述，计算杂交条件。
B.神经干细胞本发明涉及神经干细胞在血管内皮生长因子C的作用下的活化和增殖以及在神经病治疗中使用VEGF-C刺激神经生长和再生的方法。
干细胞，又称作祖先细胞，包含胚胎干细胞和成年干细胞。成年干细胞包括但不限于神经干细胞、造血干细胞、内皮干细胞和上皮干细胞。见Tepper等，Plastic and Reconstructive Surgery，11846-854(2003)。内皮祖先细胞在血液中循环并迁移至以受损内皮为特征的区域。Kaushal等，Nat.Med.，71035-1040(2001)。来自不同造血来源的人CD34(+)CD133(+)干细胞小亚群共表达VEGFR-3(Salven等，Blood，101(1)168-72(2003))。这些细胞也能够体外分化成淋巴和/或血管内皮细胞。
术语“干细胞募集”是指造成干细胞的动员(例如，从骨髓进入循环)的能力。术语“增殖”指有丝分裂繁殖。术语“分化”指多能干细胞发育成其它细胞类型所经过的过程。分化可能涉及处于多能性和完全分化的细胞类型之间的多个阶段。
本发明还提供刺激神经细胞群生长的方法学。这些神经细胞群，包括神经元和神经胶质来源的细胞，可以治疗性地用于处理表现出神经病的个体。例如，利用本发明治疗神经变性病例如阿尔茨海默氏病或帕金森病，或由于损害诸如在中风、局部缺血或手术期间造成的神经病，或创伤性损伤例如脊髓损伤。
神经干细胞(NSC)是未成熟的未定型细胞，其存在于发育中的，甚至成年的CNS中，并且被假定为可以在CNS中产生一系列的特化细胞。通过神经干细胞自更新及分化成大多数(即使不是全部)为神经元和神经胶质谱系的细胞的能力以及其在发育中的和/或变性的CNS区域形成群体的能力，可以操作性地对它们进行定义[Ciage等，Ann Rev Neurosci 18159-92，1995；Whittemore等，Mol.Neurobiology 1213-39，1996；McKay Science 27666-71，1997；Gage F H，Christen Y(编)，神经科学的研究和前景分离、表征和利用CNS干细胞(Research & Perspectives in NeurosciencesIsolation，Characterization，& Utilization of CNS Stem Cell)，Spring-Verlag，Heidelberg，Berlin，1997；Snyder，The Neuroscientist4，408-25，1998]。
成年哺乳动物中发现的神经干细胞主要从海马、嗅球和成年脑室区以及脊髓分离(Temple，S.Nature 414112-117，2001)。研究证明，从成年大鼠海马(尤其是齿状回的颗粒下层)分离的祖先细胞，当用表皮生长因子或碱性成纤维生长因子刺激时在体外增殖，并且当移植入脑后体内迁移并分化成成熟神经元(Gage等，Proc.Natl.Acad.Sci.9211879-83，1995)。
可以用于本发明的迁移的干细胞的例子包括但不限于C17.2神经元干细胞系(Riess等，Neurosurgery.511043-52，2002)、纯化的神经干细胞、HSN-1细胞(人大脑皮层)、胎猪细胞和神经嵴细胞、骨髓来源的神经干细胞、hNT细胞(人神经元细胞系)、和人神经元祖先细胞系(Clonetics，Walkersville，Md.，Catalog Number CC-2599)。用于本发明的HSN-1细胞按照例如Ronnett等[Science 248，603-605，1990]中所述制备。用于本发明的hNT细胞按照例如Konobu等[Cell Transplant 7，549-558，1998]中所述制备。神经嵴细胞的制备见Stemple和Anderson的描述(美国专利号5,654,183)，该文献并入此处作为参考。简要地，自哺乳动物胚胎从含有最尾部的10个体节的区域分离神经嵴细胞，将其从早期胚胎(在大鼠中等同于妊娠第10.5天)中切出。将这些组织切片在经平衡的盐溶液中，典型地在4℃，转移至冷冻的凹玻片上，并用胶原酶在适当缓冲溶液，例如Howard氏Ringer氏溶液中处理。在神经管脱离体节和脊索后，将它们接种在包被有纤连蛋白(FN)的培养皿上，允许神经嵴细胞从神经管中迁移出来。24小时后，在用磨尖的钨针除去这些管后，通过用胰蛋白酶溶液(典型地0.05％)处理，从包被FN的板子上除下嵴细胞。然后离心收集脱附的细胞的上清液，并以适当密度，一般地225个细胞/100mm培养皿，接种在适当的化学明确的培养基中，所述培养基例如具有4mM L-谷氨酰胺并调整以含有1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖，90％；胎牛血清(10％)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基。此生长培养基在过滤前应当调节至pH7.35。见美国专利号5,196,315。
按需要改变具体生长因子和特定添加剂的浓度，以便使特定的神经干细胞培养物获得最佳生长。此培养基也可以在无血清的情况下使用，并且含有允许神经嵴干细胞生长和自更新的成分。培养皿用适当基质，典型地FN和多聚-D-赖氨酸(PDL)的组合，包被。
上述神经嵴细胞基于其细胞表面表达低亲和性神经生长因子受体(LNGFR)和巢蛋白(nestin)以及缺少神经元或神经胶质谱系的标志(包括神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP))而分离。可以使用这些分子的抗体纯化神经嵴细胞(neural crest cell)群。
根据本发明培养的、分离的神经嵴细胞和从其分化产生的细胞都可以用于本发明中。
本文中“神经干细胞”是神经祖先细胞，即，原始神经元(proto-neuronal)/原始神经胶质(proto-glial)。术语神经干细胞与神经祖先细胞(neuralprogenitor cell)、神经前体细胞(neural precursor cell)和神经球(neurospere)可互换使用。发育过程中，胚胎干细胞-十分原始的全能细胞-在发育成神经细胞时被认为经过神经干细胞阶段。神经干细胞可以被诱导从而分化成任何神经细胞，包括神经胶质、少突胶质细胞、神经元或星形胶质细胞。基于细胞历经许多次传代而繁殖的能力、以及巢蛋白和Ki-67的表达、原始神经元形态和分化成神经元和神经胶质的能力，将细胞表征为多能神经祖先细胞。NSC的来源可以是含有NSC的任何组织，包括但不限于脑、脊髓、胎儿组织、视网膜和胚胎(见美国专利公布号2003/0040023)。哺乳动物神经嵴干细胞和多能神经干细胞及它们的后代可以从来自人和非人灵长类动物、马、犬、猫、牛、猪等的组织分离。
如本文中所用，神经干细胞或神经前体细胞可以产生不同的神经细胞谱系前体，例如神经元前体细胞和少突胶质细胞前体细胞。
本领域已知许多可以使成年干细胞、胚胎干细胞、视网膜干细胞或神经干细胞分化成特殊类型的神经细胞、视网膜细胞或特殊类型的祖先细胞的分化剂或神经营养因子。这些神经营养因子包括调节存活、生长、形态可塑性或用于神经元分化功能的蛋白质合成的内源可溶性蛋白质。因此，可以预见，本文中分离的干细胞如果期望的话可以利用本领域技术人员已知的任何方式进行分化。分化剂的一些例子包括但不限于干扰素γ、胎牛血清、神经生长因子、表皮生长因子(EGF)的移除、碱性成纤维生长因子(bFGF)的移除(或两者)、神经元素(neurogenin)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、甲状腺激素、骨形态发生蛋白(BMP)、LIF、sonic hedgehog、和神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素、干扰素、干细胞因子(SCF)、活化素、抑制素、趋化因子、视黄酸和CNTF。可以使这些细胞永久地或暂时地分化。例如，可以使细胞暂时分化以表达特殊标志，例如以便使用该标志进行鉴定。然后，可以除去分化剂，而该标志可以不再表达。
本发明考虑如果需要也可以使用抗分化剂以抑制祖先细胞分化和维持全能性。这些抗分化剂包括但不限于TGF-β、TGFα、EGF、FGF和delta(notch配体)。
上述神经干细胞可以用于通过向患有需要神经细胞再生的疾病或病症的哺乳动物个体施用和转移这些细胞以治疗神经病。可以向这些个体施用VEGF-C产物或VEGF-D产物以造成神经干细胞的体内再生，并且可以以下述任一种方法实现VEGF-C产物或VEGF-D产物的施用。在一个备选方法中，向培养的细胞施用VEGF-C产物或VEGF-D产物，以刺激干细胞本身增殖，或诱导分化出期望的神经细胞群体，然后将其移植入需要治疗的个体中。
少突胶质细胞前体细胞(OPC)是从神经干细胞产生的一类细胞。以前已经证明OPC的增殖、迁移和存活需要血小板衍生生长因子A(PDGF-A)及其受体PDGFR-α(Noble等，Nature，333560-2，1988；Pringle等，Development115535-51，1992；Spassky等，Development，1284993-5004，2001；Klinghoffer等，Dev Cell 210-13，2002)。然而，几项观察结果提示，体内少突胶质细胞的发育除了需要PDGF-A外还需要其它生长因子，而且PDGFR-αOPC不代表整个的OPC群体。首先，OPC在无PDGF-A或PDGFR-α信号转导时聚积在后脑中(Fruttiger等，同上引文；Klinghoffer等，同上引文)。其次，脑中存在以表达plp/dm-20(Timsit等，J Neurosci.151012-24，1995)为特征、不表达PDGFR-α(Spassky等，J Neurosci.188331-43.1998)且存活及增殖不依赖于PDGFR-α信号转导(Spassky等，Development.1284993-5004，2001)的OPC亚群。在PDGFR-α表达细胞出现之前在胚胎脑的几个区域中检测到这些表达plp/dm-20的、独立于PDGF的OPC(Spassky等，J Neurosci.225992-6004，2002，和同上引文，2002)。
PDGF生长因子家族与VEGF家族密切相关。几项近来的研究证实，VEGF-A干扰端脑室下区中神经组织的活动和发育，尤其是神经发生(Louissaint等，Neuron.34945-60，2002；Jin等，Proc Natl Acad Sci.USA 9911946-50，2002)，并且干扰运动和感觉神经元的发育(Oosthuyse等，Nat Genet28131-8，2001，Mukouyama等，Cell，109693-705，2002)。先前的研究证实，VEGF-C结合神经毡蛋白-1和神经毡蛋白-2(Raper，Curr Opin Neurobiol.1088-94，2000；Fujisawa等，Dev Dyn.2004)。OPC表达最初描述为3型脑信号蛋白的受体的神经毡蛋白(Spassky等，同上引文)。
本发明还考虑直接向需要治疗神经病的个体施用病毒载体，或者将病毒载体转移至体外培养的神经干细胞中然后再移植入个体，其中所述病毒载体携带VEGF-C或VEGF-D转基因并且设计用于感染哺乳动物细胞和造成这些细胞分泌VEGF-C或VEGF-D多肽。可以设计病毒载体以便分泌VEGF-C或VEGF-D和刺激神经干细胞增殖及改善神经病的症状。
C.神经病适应症和VEGF-C/VEGF-D疗法周围神经系统(PNS)包含感觉神经元和运动神经元，它们将中枢神经系统(CNS)和内脏器官例如心脏、肺和腺体连接起来。周围神经系统分为感觉神经系统和自主神经系统，自主神经系统进一步分为交感神经系统和副交感神经系统。交感神经系统受神经递质乙酰胆碱和去甲肾上腺素调节，这些神经递质辅助调节诸如心跳、血压、瞳孔放大、吞咽机制、肝脏活动和血液向肌肉、心脏和脑的移动等基础功能。交感神经系统中神经元或其它支持性神经系统细胞的神经变性会造成巨大的系统麻烦。本文中对VEGF-C刺激交感神经细胞前体体外增殖和生长的公开，指出VEGF-C可以作为一种新兴疗法克服这些有害神经病的影响。
近来在神经学领域的发现指出，神经干细胞可以从哺乳动物成年海马中分离。海马关键性地参与学习和记忆，而且极易受到伤害(例如脑创伤和局部缺血)的攻击。(Nakatomi等，Cell 110429-41，2002)。在神经变性病中该区域常常受到影响。
神经变性病的特征在于特定脑区的进行性变性(即，神经细胞功能异常和死亡)，导致削弱的运动功能，并且可能导致受到压制的认知技能和痴呆。神经变性病的例子包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森病、ALS和运动神经元疾病。
阿尔茨海默氏病被诊断为进行性的遗忘，导致痴呆。AD脑显示出由于神经元丧失所致的弥散性大脑萎缩和扩大的脑室。一般地，AD病理主要涉及海马区的神经元。
帕金森病的特征是振颤和缩减的运动神经元功能、强直及运动不能。这些神经学征候由黑质的主要传出投射纤维(即，黑质纹状体束)功能失常所致。多巴胺能系统中神经元的胞体是参与PD进程的主要细胞。主要的似帕金森病症状的例子包括帕金森病(PD)、进行性核上瘫(PSP)和纹状体黑质变性(striatonigral degeneration，SND)，SND与橄榄脑桥小脑变性(OPCD)和Shy Drager症(SDS)一起被包括在称作多系统萎缩(MSA)的综合症中。
肌萎缩侧索硬化(ALS)，常称作“Lou Gehrig氏病”，是一种进行性神经变性病，其攻击脑和脊髓中的运动神经元。ALS中运动神经元的进行性变性最终导致这些神经元死亡，从而降低脑引发和控制肌肉运动的能力。
亨廷顿病(HD)，尽管是一种遗传疾病，但是在纹状体的中型刺状GABA能神经元中导致神经元变性(Hickey等，Prog Neuropsychopharmacol BiolPsychiatry.27255-65，2003)。该变性造成运动失控、智力丧失和情绪失调。
大脑麻痹(cerebral palsy)(CP)是另一种可以通过本发明方法治疗的病症。CP综合症是一组相关的运动失调，通常源于5岁前发生的发育异常或产前或产后中枢神经系统(CNS)失调损伤。CP的特征是受损的随意运动。
患有上述任一疾病的患者可以使用VEGF-C产物或VEGF-D产物系统性地或优选地在神经病理学位点进行治疗，以刺激神经干细胞体内增殖。或者，可以向患者施用神经干细胞，所述神经干细胞从已经用VEGF-C或VEGF-D产物(包括表达VEGF-C或VEGF-D的病毒载体)体外处理过的生物学样品、商业来源或永生化神经干细胞分离。然后这些神经干细胞被施用给患有神经变性病或神经创伤的患者，由此它们将迁移至神经变性位点并增殖。所述施用可以如下所述系统性地或局部地进行。
患有上述任一疾病的患者可以在出现疾病症状的最早征候(例如，受损的运动功能或受损的认知功能)时治疗，以便阻止神经变性的发展。本发明也考虑将VEGF-C/D或VEGF-C/D培养的神经元前体细胞施用给疾病晚期的个体以减缓神经系统损坏的进程。
本发明也考虑到，VEGF-C产物或VEGF-D产物与常用于治疗神经病的神经治疗剂的联合施用将导致两种治疗的协同作用，由此使接受联合治疗的患者比仅接受一种治疗的个体有明显的改善。
神经变性病可以用几类神经治疗剂治疗。这些治疗剂包括但不限于如下药物促胰液素(secretin)、盐酸金刚胺(amantadine)、利培酮(risperidone)、氟伏沙明(Fluvoxamine)、可乐定(clonidine)、胺磺必利(amisulpride)、溴隐亭(bromocriptine)、氯米帕明(clomipramine)和去甲丙咪嗪(desipramine)。
常用于治疗阿尔茨海默氏病的神经治疗剂包括tacrine(Cognex)、多奈哌齐(donepezil)(Aricept)、酒石酸卡巴拉汀(Rivastigmine)(Exelon)或galantamine(Reminyl)，它们可以帮助防止一些症状在一段有限时间内变得更糟。此外，一些药物可以帮助控制AD的行为症状，例如失眠、激动不安、漫游、焦虑和抑郁。AD的其它治疗剂是抗炎药物，例如非类固醇抗炎药(NSAID)，例如COX-2抑制剂(Celebrex)和甲氧萘丙酸钠(naproxen sodium)。还使用的其它抗炎剂有水杨酸盐类、类固醇类、受体位点阻断剂或补体激活的抑制剂。
普拉克索(Pramipexole)(Mirapex)和左旋多巴(levodopa)是治疗早期帕金森病(PD)的运动症状的有效药物。体外研究和动物研究提示，普拉克索可以保护而左旋多巴可以保护或破坏多巴胺神经元。神经成像提供了在PD患者中客观地生物标志多巴胺神经元变性的可能。辅酶Q10，一种在帕金森患者中低水平表达的神经递质，也用于治疗PD。左旋多巴可以和其它药物例如卡比多巴(Carbidopa)联合以辅助缓解L-多巴的副作用。以单独的药剂形式或以药物联合形式用于治疗帕金森病的其它药物有Sinemet，司来吉兰(Selegiline)(市场上为Eldepryl)，它们可以使早期帕金森症状得到一些缓解。金刚胺(Symmetrel)是一种也可以提供抗帕金森效果的抗病毒药，当与Sinemet联用时其频繁地用于扩大左旋多巴的“治疗窗口”。
苯那君(Benadryl)、安坦(Artane)和Cogentine是可以治疗振颤的抗胆碱能处方药的商品名。抗胆碱能药阻断神经肌肉接头中乙酰胆碱的作用，由此重现平衡其与多巴胺的关系和减少强直和振颤。尽管有效，但是这些药物可能有副作用，例如嘴干、视力模糊、尿潴留和便秘(这限制了这些药物在老年人中的使用)。
罗匹尼罗(Requip)、普拉克索(Mirapex)、溴隐亭(Parlodel)和硫丙麦角林(Pergolide，Permax)是多巴胺激动剂。这些药物直接在多巴胺受体位点进入脑部，并且常常与Sinemet联合处方使用以延长每一剂左旋多巴的作用持续时间。它们还可以减少左旋多巴诱导的非随意运动-称作“异动症”(dyskinesia)。医师可以慢慢地将多巴胺激动剂调整至治疗水平，然后逐渐地减少左旋多巴剂量以使异动症最小化。阿扑吗啡(Apomorphine)是常常以连续皮下输注形式或以皮下注射形式给药的多巴胺激动剂。
Tolcaponc(Tasmar)和恩他卡朋(Entacapone)是COMT(儿茶酚-O-甲基转移酶)抑制剂。当阻断COMT活性时，多巴胺将更长期的留在脑中。这些药物的作用机制与多巴胺激动剂的作用机制完全不同。
Rilutek_、Myotrophin_、辅酶Q、托吡酯(Topiramate)、Xaliproden和氧甲氢龙(Oxandrolone)是用于治疗ALS的示例性药剂。
本发明考虑，在使用上述任何神经治疗剂之前、之后或同时应用VEGF-C进行治疗将增强神经治疗剂的效果，由此减少个体所需的药剂量和减少由多剂量或大剂量神经治疗剂造成的有害副作用。
除了神经变性病外，还考虑使用VEGF-C或VEGF-D治疗自主神经系统疾病。示例性疾病包括特征在于多系统萎缩和严重低血压的Shy Drager症(Shy Drager syndrome)(Lamarre-Cliché等，Can J Clin Pharmacol.6213-5，1999)；特征在于强直性瞳孔和反射消失的Adie氏综合症(Adie’s syndrome)(Mak等，J Clin Neurosci.7452，2000)；影响眼睛的神经支配的Horner氏综合症(Horner’s syndrome)(Patel等，Optometry 74245-56，2003)；影响心血管调节的家族性植物神经功能不全(Bernardi等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.167141-9，2003)；和特征在于疼痛和感觉改变的局部疼痛综合症(regionalpain syndrome)(Turner-Stokes，L.Disabil.Rehabil.24939-47，2002)。
多发性硬化(MS)是一种年轻成人中频繁出现的使人丧失能力的疾病。该病的特征在于炎症反应(可能是自身免疫类型的)和常常与少突胶质细胞(中枢神经系统中的髓鞘脂形成细胞)的丧失相关的脱髓鞘。目前可用的治疗方法致力于解决MS的炎症因素，但是对髓鞘的重新形成几乎没有(即使有的话)功效。因此极为重要的是鉴定存活或缺乏时将干扰MS斑(plaque)中少突神经胶质分化和髓鞘形成的因素。本发明考虑使用VEGF-C或VEGF-D产物治疗MS和其它脱髓鞘疾病。VEGF-C或VEGF-D产物可以单独地或与其它用于脱髓鞘疾病的疗法(包括本文其它地方描述的与MS治疗有关的疗法)联合使用。
还考虑，VEGF-C或VEGF-D产物与其它抗炎剂联合施用。这些药剂包括非类固醇抗炎药(NSAID)、镇痛药、糖皮质激素或其它免疫抑制治疗剂。
NSAID的例子包括布洛芬(ibuprofen)、奈普生(naproxen)、奈普生钠、Cox-2抑制剂如伟克适(Vioxx)和西乐葆(Celebrex)，和水杨酸盐。镇痛药的例子包括乙酰氨基苯(acetaminophen)、羟二氢可待因酮(oxycodone)、曲马朵(tramadol)或盐酸丙氧吩(proporxyphene hygrochloride)。糖皮质激素的例子包括可的松、地塞米松(dexamethosone)、氢化可的松、甲基脱氢皮质醇、脱氢皮质醇或强的松。其它免疫抑制治疗物的例子包括环磷酰胺、环孢素、氨甲蝶呤或青霉胺。本发明的一个方面考虑包含一种或多种本发明VEGF-C或VEGF-D产物和一种或多种前述常规治疗剂的制剂。
如上所述，本发明还考虑VEGF-C和VEGF-D产物用于治疗神经系统的物理性损伤。创伤可以由脑和脊髓的物理性伤害或压伤或割伤，例如擦伤、切口、撞伤、刺伤、挤伤，或由外物与手臂、手或身体其它部分的创伤性接触所致的其它损伤所引起，也包括血液暂时或永久停止流向部分的神经系统。
D.基因治疗本申请的许多内容，包括一些实施例，从蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质施用的角度记述。也特别考虑遗传操作实现蛋白质表达或活性的调节。例如，当考虑施用蛋白质时，可以考虑施用基因治疗载体以引起目的蛋白质在体内产生。当考虑抑制蛋白质(例如，通过使用抗体或小分子抑制剂)时，可以考虑通过遗传技术，例如敲除技术或反义疗法抑制蛋白质的体内表达。
任何适宜的载体均可以用于将目的转基因导入动物体。在文献中已经描述过的载体的例子包括复制缺陷型逆转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体[Kim等，J.Virol.72(1)；811-816(1998)；Kingsman & Johnson，ScripMagazine，1998年10月，pp.43-46]；腺病毒(见例如美国专利号5,824,544；美国专利号5,707,618；美国专利号5,792,453；美国专利号5,693,509；美国专利号5,670,488；美国专利号5,585,362；Quantin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，892581-2584(1992)；Stratford-Perricadet等，J.Clin.Invest.90626-630(1992)；和Rosenfeld等，Cell 68143-155(1992))、逆转录病毒(见例如美国专利号5,888,502；美国专利号5,830,725；美国专利号5,770,414；美国专利号5,686,278；美国专利号4,861,719)、腺相关病毒(见例如美国专利号5,474,935；美国专利号5,139,941；美国专利号5,622,856；美国专利号5,658,776；美国专利号5,773,289；美国专利号5,789,390；美国专利号5,834,441；美国专利号5,863,541；美国专利号5,851,521；美国专利号5,252,479；Gnatenko等，J.Investig.Med.，4587-98(1997))、腺病毒-腺相关病毒杂种(见例如，美国专利号5,856,152)或痘苗病毒或疱疹病毒(见例如美国专利号5,879,934；美国专利号5,849,571；美国专利号5,830,727；美国专利号5,661,033；美国专利号5,328,688)；脂转染试剂介导的基因转移(BRL)；脂质体载体[见例如，美国专利号5,631,237(包含仙台病毒的脂质体)]；和它们的组合。所有前述文献均完整地并入此处作为参考。复制缺陷型腺病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒是优选实施方案。
在使用病毒载体的实施方案中，优选的多核苷酸包括适宜启动子和多腺苷酸化序列以在目的靶组织中启动表达。对于本发明的许多应用，用于哺乳动物细胞表达的适宜启动子/增强子包括例如巨细胞病毒启动子/增强子[Lehner等，J.Clin Microbiol.292494-2502(1991)；Boshart等，Cell，41521-530(1985)]；Rous肉瘤病毒启动子[Davis等，Hum.Gene Ther.，4151(1993)]；猿猴病毒40启动子、逆转录病毒的长末端重复(LTR)、角蛋白14启动子和α肌球蛋白重链启动子。此外，还可以使用神经特异性启动子使生长因子的表达定向于受感染的神经元，包括例如，将β3-微管蛋白、多巴胺脱羧酶或GABA合成酶启动子用于VEGF-C(或D)在神经元中的表达。
其它实施方案考虑非病毒递送。这些包括磷酸钙沉淀(Graham和VanDer Eb，Virology，52456-467(1973)；Chen和Okayama，Mol Cell Biol.，72745-2752，(1987)；Rippe等，Mol.Cell Biol.10689-695(1990))、DEAE-葡聚糖(Gopal，Mol.Cell Biol.51188-1190，(1985))、电穿孔(Tur-Kaspa等，Mol.Cell Biol.，6716-718(1986)；Potter等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，817161-7165，(1984))、直接显微注射(Harland和Weintraub，J.Cell Biol.1011094-1099(1985))、载有DNA的脂质体(Nicolao和Sene，Biochim.Biophys.Acta，721185-190(1982)；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，763348-3352(1979)；Felgner，Sci.Am.，276(6)102-6(1997)；Felgner，Hum.GeneTher.，7(15)1791-3，(1996))、细胞超声(Fechheimer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，848463-8467(1987))、使用高速微粒的基因轰击(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，879568-9572(1990))、和受体介导的转染(Wu和Wu，J.Biol.Chem.，2624429-4432(1987)；Wu和Wu，Biochemistry，27887-892(1988)；Wu和Wu，Adv.Drug Delivery Rev.，12159-167(1993))。
在本发明一个具体实施方案中，可以将表达构建体(或实际上上述肽)截留在脂质体中。脂质体是具有磷脂双层膜和内部水性介质特征的小泡结构。多层脂质体具有被水性介质分隔开的多个脂质层。当将磷脂悬浮在过量水性溶液中时多层脂质体将自动形成。脂质成分在形成闭合结构之间经历自重排并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，“InLiver Disease，Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors andLigands，”Wu，G.，Wu，C.，编，New YorkMarcel Dekker，pp.87-104(1991))。将DNA加入阳离子脂质体造成从脂质体到光学双折射液晶凝聚小球的拓扑学转变(Radler等，Science，275(5301)810-4，(1997))。这些DNA-脂质复合物是可以用于基因治疗和递送的潜在非病毒载体。
本发明还考虑各种涉及“脂转染”技术的商业方法。在本发明某些实施方案中，可以将脂质体与血凝病毒(HVJ)复合。已经证实这有利于与细胞膜的融合并促进脂质体包封的DNA进入细胞(Kaneda等，Science，243375-378(1989))。其它实施方案中，脂质体可以与核非组蛋白的染色体蛋白质(HMG-1)复合或与之联用(Kato等，J.Biol.Chem.，2663361-3364(1991))。在再其它实施方案中，脂质体可以与HVJ和HMG-1两者复合或联用。鉴于这些表达构建体已经成功地用于体外和体内转移和表达核酸，故可以将它们应用于本发明中。
可以用于将编码治疗剂的核酸递送至细胞的其它载体递送系统包括受体介导的递送运载体。这些运载体利用了几乎所有真核细胞中受体介导的内吞对大分子的选择性摄取作用。由于各种受体的细胞类型特异性分布，故该递送可以是高度特异性的(Wu和Wu(1993)，同上引文)。
受体介导的定向基因运载体一般由两个组分组成细胞受体特异性配体和DNA结合剂。几种配体已经用于受体介导的基因转移。被最多表征的配体是脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)(Wu和Wu(1987)，同上引文)和转铁蛋白(Wagner等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 87(9)3410-3414(1990))。近来，一种与ASOR识别相同受体的合成的新糖蛋白用作基因递送运载体(Ferkol等，FASEB J.71081-1091，(1993)；Perales等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914086-4090(1994))，而且表皮生长因子(EGF)也已经用于将基因递送给鳞状癌细胞(Myers，EPO 0273085)。
在其它实施方案中，递送运载体可以包含配体和脂质体。例如，Nicolau等，Methods Enzymol.149157-176(1987)使用掺入脂质体的乳糖基-神经酰胺、末端半乳糖脱唾液酸神经节苷脂，并观察到肝细胞对胰岛素基因的摄取增加。因此，可行的是，还可以将编码治疗基因的核酸通过任何数量的受体-配体系统在有或无脂质体存在下特异地递送至特定细胞类型。
在本发明另一实施方案中，表达构建体可以简单地由裸露的重组DNA或质粒组成。可以通过上述任何以物理或化学方法使细胞膜通透的方法，转移此构建体。这尤其适用于体外转移，然而，也可以将其用于体内。Dubensky等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，817529-7533(1984)成功地将多瘤病毒DNA以CaPO4沉淀物形式注射入成年和新生小鼠肝和脾内，这些小鼠表现出活跃的病毒复制和急性感染。Benvenisty和Neshif，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，839551-9555(1986)还证实，直接腹膜内注射CaPO4沉淀的质粒导致所转染的基因表达。
用于将裸DNA表达构建体转移入细胞的本发明另一实施方案可以涉及微粒轰击。该方法依赖于使包被有DNA的微粒加速至高速度从而允许它们穿透细胞膜并在不杀死细胞的情况下进入细胞的能力(Klein等，Nature，32770-73(1987))。已经开发了几种用于加速小微粒的装置。一种装置依赖于高电压放电产生电流，由该电流提供原动力(Yang等Proc.Natl.Acad.Sci.USA879568-9572(1990))。所用微粒由生物学惰性物质如钨或金珠组成。
本领域技术人员将明了如何在体内和离体情况下应用基因递送。对于病毒载体，一般制备病毒载原液。根据病毒的类型和可得到的滴度，向患者递送1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011或1×1012个感染粒子。通过比较相对的摄取效率，可以外推出用于脂质体或其它非病毒制剂的相似数字。以下讨论可药用组合物形式的制剂。
对于各种细胞类型可以考虑各种途径。对于实践上任何细胞、组织或器官类型，均可以考虑系统递送。在其它实施方案中，可以采取各种直接的、局部的和区域的方法。例如，可以用表达载体或蛋白质直接注射细胞、组织或器官。
在一个不同实施方案中，考虑离体基因治疗。在离体实施方案中，移出患者的细胞，将细胞在身体外维持至少一段时间。在此期间，递送治疗剂，之后将细胞重新导入患者体内。
反义多核苷酸是识别并杂交编码目的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸，因此其可以抑制该蛋白质的转录或翻译。全长的和片段的反义多核苷酸均可以使用。设计和优化反义核苷酸的方法描述在Lima等(J Biol Chem，272626-38，1997)和Kurreck等(Nucleic Acids Res.，301911-8，2002)。此外，可以获得商业软件用于优化反义序列的选择以及比较所选序列和已知基因组序列以帮助确保对选定基因的唯一性/特异性。可以进一步通过杂交分析确认此唯一性。将反义核酸引入细胞(例如，通过病毒载体或胶体分散系统例如脂质体)。本发明考虑，VEGF-C反义核酸分子包含来自靶序列的从大约10至500(优选地从大约10至50)的任何整数数目核苷酸的互补序列。VEGF-C反义分子可以包含长度至少大约10、25、50、100、250或500个核苷酸或与完整VEGF-C编码链互补的互补序列。反义核酸在细胞中与靶核苷酸序列结合并阻止靶序列转录或翻译。特别考虑将硫代磷酸酯和甲基膦酸酯反义寡核苷酸用于本发明的治疗应用中。反义寡核苷酸可以在其5’末端进一步用多聚-L-赖氨酸、转铁蛋白多聚赖氨酸或胆固醇部分进行修饰。
一个实施方案中，可以使用本发明RNA，通过双链(dsRNA)(Fire等Nature391806-811，1998)或短干扰RNA(siRNA)序列(Yu等Proc Natl AcadSic USA 996047-52，2002)，诱导RNA干扰(RNAi)。“RNAi”是dsRNA诱导互补mRNA发生同源同源依赖性降解的过程。在一个实施方案中，本发明核酸分子通过互补碱基配对与本发明的“有义”核糖核酸杂交形成双链RNA。可以提供相应于至少大约20、25、50、100、250或500个核苷酸或完整VEGF-C编码链或仅其一部分的dsRNA反义和有义核酸分子。在一个备选实施方案中，siRNA长30个核苷酸或更短，更优选21至23个核苷酸，具有特征性的2个至3个核苷酸的3’突出端，该突出端由核糖核酸酶III切割更长的dsRNA而产生。见例如Tuschl T.(Nat Biotechnol.20446-48，2002)。
小RNA分子的细胞内转录可以通过将siRNA模板克隆至RNA聚合酶III(Pol III)转录单位中来实现，其中所述转录单位正常编码核内小RNA(snRNA)U6或人RNAse P RNA H1。可以使用两种方法表达siRNA一个实施方案中，组成siRNA双链体的有义和反义链通过各自的启动子转录(Lee等，Nat Biotechnol.20，500-505，2002)；在另一可选实施方案中，将siRNA表达为茎杆发夹RNA结构，该结构在细胞内加工后产生siRNA(Brummelkamp等，Science 296550-553，2002)(在此并入作为参考)。
dsRNA/siRNA的最常见施用方式是先体外退火有义和反义RNA链之后递送至生物体。在一个可选实施方案中，可以通过在相同溶液中施用本发明的有义和反义核酸但在施用前不进行退火的方式实现RNAi，并且甚至可以通过在非常短的时限内在分开的运载体中施用有义和反义核酸来实现RNAi。此外，还提供编码VEGF-C的片段、同源物、衍生物和类似物的核酸分子或与VEGF-C核酸序列互补的反义核酸。
也可以通过设计调节目的基因在天然细胞和动物中的表达的新转录因子，实现遗传控制。例如，已经证明可以容易地改变Cys2-His2锌指蛋白(其通过锌指结构域结合DNA)的结构导致对不同靶序列的识别。这些人工锌指蛋白以高亲和力和低解离常数识别特定的靶位点，并且能够作为基因开关调节基因表达。使用已知方法，例如基于结构的模建和噬菌体展示文库的筛选的联合[Segal等，Proc Natl Acad Sci USA 962758-2763(1999)；Liu等，Proc Natl Acad Sci USA 945525-30(1997)；Greisman和Pabo Science 275657-61(1997)；Choo等J Mol Biol 273525-32(1997)]，本发明的具体靶序列的知识将利于工程化制造对该靶序列具有特异性的锌指蛋白。每一个锌指域通常识别3个或3个以上的碱基对。由于18个碱基对的识别序列的长度一般足以使该序列在任何已知基因组中都具有独特性，因此由6个串联重复的锌指组成的锌指蛋白预期将能保证对特定序列的特异性[Segal等，同上引文]。基于靶序列设计的人工锌指重复可以和激活或阻抑结构域融合以促进或抑制基因表达[Liu等，同上引文]。或者，锌指结构域可以和TATA盒结合因子(TBP)通过位于该锌指蛋白与该TBP之间的变化长度的接头区域融合，以产生转录激活物或阻遏物[Kim等，Proc Natl Acad Sci USA 943616-3620(1997)]。这些蛋白质和编码它们的多核苷酸具有在天然细胞、动物和人中体内调节表达的用途。可以通过转染表达新转录因子的构建体(基因治疗)，或通过引入该蛋白质，将此新的转录因子递送给靶细胞。也可以设计工程锌指蛋白质以便结合RNA序列从而作为反义或催化RNA方法的替代方案用于治疗[McColl等，Proc Natl Acad Sci USA 969521-6(1999)；Wu等，Proc Natl Acad Sci USA 92344-348(1995)]。
E.抗体由于能够容易地产生具有相对特异性的抗体，而且由于在采用抗体进行人类治疗的技术上的持续不断改进，可以使用抗体调节神经毡蛋白-VEGF-C相互作用以及VEGF-C的促有丝分裂活性。因此，本发明考虑使用对本发明目的多肽(尤其是神经毡蛋白、VEGF受体、和VEGF-C及VEGF-D蛋白)具有特异性的抗体(例如单克隆和多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、双功能/双特异性抗体、人源化抗体、人抗体、和互补决定区(CDR)移植抗体，包括含有特异地识别本发明多肽的CDR序列的化合物)。优选抗体是根据WO93/11236(公布于1993年6月20日，并入此处作为参考)中描述的方法制备和鉴定的人抗体。本发明也提供抗体片段，包括Fab，Fab’，F(ab’)2和Fv。术语“对......具有特异性”，当用于描述本发明抗体时，指本发明抗体的可变区专门地识别和结合目的多肽(即，由于结合亲和力上的可测量差异，能够将目的多肽与相同家族的其它已知多肽区分开的能力，尽管家族成员之间可能存在局部的序列同一性、同源性和相似性)。可以理解，特异性抗体也可以通过抗体可变区外的且尤其是该分子恒定区内的序列相互作用而和其它蛋白质(例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus)蛋白A或ELISA技术中的其它抗体)发生相互作用。测定本发明抗体的结合特异性的筛选试验是本领域熟知并常规实践的。对于此类试验的全面讨论，见Harlow等(编)，抗体实验室手册(Antibodies A Laboratory Manual)；Cold Spring HarborLaboratory；Cold Spring Harbor，NY(1988)，第6章。本发明抗体可以使用任何本领域已知并常规实践的方法制备。
双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选人或人源化抗体。在本案中，所述结合特异性之一可以针对NRP-2，另一针对NRP-2结合配偶体，并且优选针对细胞表面蛋白或受体或受体亚基，例如VEGFR-3。
一个实施方案中，使用与NRP-2和VEGFR-3两者结合的双特异性抗体调节由VEGF-C和VEGFR-3的相互作用导致的细胞生长、迁移或增殖。例如，可以将双特异性抗体施用给患有淋巴转移为特征的肿瘤或表达VEGF-C和VEGFR-3及NRP-2的其它肿瘤类型的个体。结合NRP-2和VEGFR-3的双特异性抗体阻断VEGF-C和VEGFR-3的结合，由此干扰VEGF-C介导的淋巴管发生和减缓肿瘤转移进程。另一实施方案中，使用结合NRP-2和VEGF-C的双特异性抗体实施相同操作，其中所述抗体的施用导致对可溶性VEGF-C的隔离以及阻止其结合VEGFR-3，从而有效地充当了VEGF-C介导的通过VEGFR-3的信号转导的抑制剂。
双特异性抗体可以使用文献中已经描述过的标准方法制备、分离和测试。见例如，Pluckthun & Pack，Immunotechnology 383-105(1997)；Carter等，J Hematotherapy，4463-470，(1995)；Renner & Pfreundschuh，ImmunologicalReviews，1995，No.145，pp.179-209；Pfreundschun美国专利申请号5,643,759；Segal等，J.Hematotherapy，4377-382(1995)；Segal等，Immunobiology，185390-402(1992)；和Bolhuis等，Cancer Immunol.Immunother.，341-8(1991)，所有这些均完整地并入此处作为参考。
术语“双特异性抗体”指具有两个不同抗原结合位点(可变区)的单个双价抗体。如下述，双特异性结合剂一般由抗体、含有至少一个来源于抗体可变区的互补决定区的抗体片段或抗体类似物制成。这些双特异性抗体可以是常规双特异性抗体，其可以通过各种方式(Holliger，P.和Winter G.Current Opinion Biotechnol.4，446-449(1993))制备，例如利用化学方法、使用杂种杂交瘤、通过将此类双特异性抗体的编码序列连接入载体中并产生重组肽的方式或通过噬菌体展示来制备。双特异性抗体也可以是任何双特异性抗体片段。
在一个方法中，通过如下方式构建双特异性抗体片段利用蛋白酶解作用将完整抗体转化为(单特异性)F(ab’)2分子，将这些片段分成Fab’分子，将Fab’分子与不同特异性重组为双特异性F(ab’)2分子(见例如，美国专利5,798,229)。
双特异性抗体可以通过如下方式产生将两个不同的单克隆抗体(各包含两个相同的通过一个或多个二硫键连接的L(轻链)-H(重链)半分子)酶学转化成两个F(ab’)2分子，在还原条件下将每个F(ab’)2分子分成Fab’硫醇，将每个抗体的这些Fab’分子之一用巯基活化剂衍生化，使带有NRP-2特异性的活化的Fab’分子与带有NRP-2结合配偶体特异性的未活化的Fab’分子组合或反过来组合以获得期望的双特异性抗体F(ab’)2片段。
可以使用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶作为将抗体转化成其F(ab’)2分子的适宜酶。在一些情况下，胰蛋白酶或菠萝蛋白酶是适宜的。二硫键转化为游离SH基团(Fab’分子)可以通过还原性化合物，例如二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇和巯基乙胺实现。根据本发明防止硫醇半分子重组的巯基活化剂是5’，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、2，2’-二吡啶二硫化物、4，4’-二吡啶二硫化物或连四硫酸盐/亚硫酸钠(也见Raso等，Cancer Res.42457(1982)，以及并入别处的参考文献)。
用巯基活化剂处理一般仅针对两个Fab’片段之一进行。原则上，将两个Fab’分子的哪一个转化成活化的Fab’片段(例如Fab’-TNB)没有差别。但是，一般地，用巯基活化剂修饰较不稳定的Fab’片段。在本情况中，带有抗肿瘤特异性的片段稍较不稳定，因此优选用于此程序中。在0℃至30℃的温度下活化的Fab’衍生物与第二Fab’分子的游离铰链-SH基团自发缀合产生双价F(ab’)2抗体。纯化的F(ab’)2抗体的产率是20-40％(从完整抗体开始)。
制备双特异性抗体的另一方法是将两个杂交瘤融合为一个杂种杂交瘤。本文中术语“杂种杂交瘤”用于描述两个B细胞杂交瘤的生产性融合。使用目前的标准技术，将两个产生抗体的杂交瘤融合产生子代细胞，然后选择维持着两套纯系型(clonotype)免疫球蛋白基因的表达的那些细胞。
为了鉴定双特异性抗体，可以使用诸如ELISA等标准方法，其中用特异地和亲本杂交瘤抗体之一相互作用但缺乏与两种抗体的交叉反应性的试剂包被微量滴定板的孔。此外，还可以将本发明与FACS、免疫荧光染色、独特型特异抗体、抗原结合竞争试验和抗体表征领域的其它常见方法联用，以鉴定优选的杂种杂交瘤。
本发明的双特异性抗体也可以通过将编码NRP-2结合特异性的基因与编码识别NRP-2结合配偶体(例如VEGF-C或VEGFR-3)的抗体链的至少结合区域的基因缀合而制备。将该构建体转染至宿主细胞(例如骨髓瘤)中，该宿主细胞组成性地表达相应的重链或轻链，由此使得能够重构具有对NRP-2以及对NRP-2结合配偶体的结合特异性的双特异性单链抗体、双链抗体(或其单链或双链片段例如Fab)。此基因构建体的构建和克隆可以采用标准操作完成。
双特异性抗体也可以通过噬菌体展示筛选方法，使用WO92/01047中公开的所谓分级双重组合方法(hierarchical dual combinatiorial approach)制备，在该方法中使用含有H或L链克隆的单菌落感染整个编码另一链(L或H)的克隆文库，根据噬菌体展示技术例如其中描述的那些，选择所得的双链特异性结合成员。该技术也公开在Marks等(Bio/Technology，1992，10779-783)中。
本发明双特异性抗体片段可以施用于人类患者用于治疗。因此，一个实施方案中，以包含至少一种上述双特异性抗体片段以及一种或多种可药用载体、赋形剂或稀释剂的药物制剂形式提供双特异性抗体。另一实施方案中，该化合物还包含与双特异性抗体缀合的抗肿瘤剂或细胞毒性剂。
也可以工程改造重组抗体片段，例如scFv，以组装成对不同靶抗原具有高结合亲和力和特异性的稳定多亚基寡聚体。此双链抗体(diabody)(二聚体)、三链抗体(triabody)(三聚体)或四链抗体(tetrabody)(四聚体)是本领域熟知的，并已经在文献中描述，见例如Kortt等，Biomol.Eng.2001年10月15；18(3)95-108和Todorovska等，J Immunol Methods，2001年2月1日；248(1-2)47-66。
除了制备单克隆抗体外，还可以使用开发用于制备“嵌合抗体”的技术，将小鼠抗体基因与人抗体基因拼接获得具有适当抗原特异性和生物学活性的分子(Morrison等，Proc Natl Acad Sci816851-6855，1984；Neuberger等，Nature312604-608，1984；Takeda等，Nature314452-454，1985)。
非人抗体可以通过本领域任何已知方法人源化。优选的“人源化的抗体”具有人恒定区，而该抗体的可变区或至少CDR来源于非人物种。将非人抗体人源化的方法是本领域熟知的(见例如美国专利号5,585,089和5,693,762)。一般地，人源化抗体在其来自非人来源的构架区中引入一个或多个氨基酸残基。可以使用例如Jones等[Nature 321522-525(1986)]、Riechmann等[Nature，332323-327(1988)]和Verhoeyen等[Science 2391534-1536，(1988)]中所述的方法，通过将啮齿动物互补决定区(CDR)的至少一部分替代为人抗体的相应区域，实现人源化。制备工程抗体的许多技术描述在例如Owens和Young，J Immunol.Meth.168149-165(1994)中。然后可以将向抗体构架区中引入进一步的改变以调节亲和性或免疫原性。
E.药物组合物的配制VEGF-C产物优选在含有一种或多种可药用载体的组合物中施用。本发明所用药物载体包括可药用盐、尤其当化合物中存在碱性或酸性基团时。例如，当存在酸性取代基如-COOH时，铵盐、钠盐、钾盐、钙盐等被考虑为用于向生物学宿主给药的优选实施方案。当存在碱性基团(例如氨基或碱性杂芳基基团如吡啶基)时，酸式盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、马来酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、磷酸盐、甲磺酸盐、对苯甲磺酸盐等，被认为是用于向生物学宿主给药的优选形式。
类似地，当存在酸性基团时，化合物的可药用酯(例如，甲基、叔丁基、新戊酰氧甲基、琥珀酰基等)被认为是化合物的优选形式，本领域已知这些酯可以改变可溶性和/或水解特征以用作持续释放制剂或前药制剂。
此外，一些化合物可以与水或普通有机溶剂形成溶质。这些溶质也在考虑之列。
可以直接使用药用VEGF-C产物组合物实践本发明的材料和方法，但在优选实施方案中，用可药用稀释剂、助剂、赋形剂或载体配制这些化合物。术语“药用的或可药用的”是指在例如通过口服、局部、透皮、胃肠外、吸入喷雾方式、经阴道、经直肠或通过颅内注射方式，施用给动物或人后不产生不良反应、过敏反义或其它不适当反应的分子实体和组合物。(本文所用术语胃肠外包括皮下注射、静脉内、肌内、脑池内注射或输注技术。通过静脉内、皮内、肌内、乳腺内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射的施用和在特定位点的手术植入也在考虑之列。)一般地，这还需要制备基本上无致热原以及其它可能有害于人或动物的杂质的组合物。术语“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。本领域熟知这些介质和试剂对于药物活性物质的应用。
上述含有VEGF-C产物的药物组合物可以是适宜口服使用的形式，例如片剂、锭剂、糖淀、水性或油性悬浮剂、分散性散剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。可以根据已知方法制备旨在用于口服使用的组合物，而且该组合物可以含有一种或多种选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的试剂以便提供制药上精制适口的制剂。片剂可以含有与适宜片剂制备的无毒可药用赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙和磷酸钠；粘合剂，例如淀粉，明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未加包衣的或者可以通过已知技术加包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，由此提供较长期的持续作用。例如，可以使用时间延迟物质，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。也可以利用美国专利4,256,108；4,166,452和4,265,874描述的技术加包衣，以形成控释的渗透治疗剂。
口服使用的制剂还可以为硬明胶胶囊形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂，例如硬脂酸钙、磷酸钙或高岭土混合；或者可以为软明胶胶囊形式，其中活性成分与水或油性介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
水性悬浮剂可以含有与适宜制备水性悬浮剂的赋形剂混合的活性化合物。这些赋形剂有悬浮剂，例如羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂可以是天然磷脂，例如卵磷脂，或者环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或者环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如，十七乙烯氧基鲸蜡醇，或者环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或者环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。水性悬浮剂还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙基或正丙基酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，以及一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。
油性悬浮剂可以通过将活性成分悬浮在植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰油中或悬浮在矿物油例如液体石蜡中配制。油性悬浮剂可以含有增稠剂例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。甜味剂例如上述那些甜味剂和调味剂可以加入以提供适口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。
适于通过加入水制备水性悬浮剂的分散性散剂和颗粒剂提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的混合物。适宜的分散剂或润湿剂和悬浮剂的例子如以上已经提及的那些。也可以存在其它的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明药物组合物还可以为水包油乳剂形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或者矿物油，例如液体石蜡，或这些的混合物。适宜的乳化剂可以是天然胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶，天然磷脂，例如大豆卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如失水山梨糖醇单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。乳化剂还可以含有甜味剂和调味剂。
糖浆剂和酏剂可以用甜味剂，例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖配制。这些制剂还可以含有缓和剂、防腐剂和调味剂及着色剂。药物组合物可以是无菌可注射水性或油质悬浮液的形式。该悬浮剂可以根据已知现有技术使用上述已经提及的那些适宜的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的这些可接受的赋形药和溶剂中有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油也常规地用作溶剂或悬浮介质。对此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的单或二甘油酯。此外，脂肪酸例如油酸也可以用于制备注射剂。
组合物还可以是用于直肠施用PTPase调节化合物的栓剂形式。这些组合物可以通过将所述药物与适宜的无刺激性赋形剂混合，其中所述赋形剂在平常温度下为固体但在直肠温度下为液体，由此将在直肠中熔化以释放药物。此类物质是例如可可脂和聚乙二醇。
适于注射使用的药物形式包括无菌水性溶液剂或分散剂和用于现用现制无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。在所有情况下，该形式都必须是无菌的，并且必须在一定程度上是液体以致存在可以易于注射的性质。该形式在制备和贮存条件下必须稳定，并且必须具有抗微生物例如细菌和真菌的污染作用的防腐性质。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、它们的适宜混合物、和植物油的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散剂的情扩下通过维持所需的颗粒大小、以及通过使用表面活性剂，保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等，防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，延长注射剂组合物的吸收。
G.施用和剂量本发明一些方法包括向人或动物施用多肽的步骤。可以使用适当的可药用赋形药，例如可药用稀释剂、助剂、赋形剂或载体，以任何适宜的方式施用多肽。待根据本发明施用的组合物优选包含(除了多肽或载体之外)可药用载体溶液，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖或常规用于递送治疗剂或成像剂的其它载体。
根据本发明进行的“施用”可以使用任何医学上接受的用于直接或间接地将治疗剂导入哺乳动物个体中的手段完成，所述手段包括但不限于注射(例如，静脉内、肌内、皮下、颅内或导管)；口服；鼻内或局部施用等等。对于向患有神经疾病的个体给药，可以考虑将细胞注射至特定哺乳动物的含有已知受影响的各种周围神经的区域中，或者注射至表现出累及脊髓或脑神经系统的哺乳动物的脊髓或脑中(Craig等，J Neurosci.1996，162649-58；Frisen等，CMLS Cell Mol.Life Sci.54935-45，1998)。一个实施方案中，在需要治疗的损伤或染病组织部位，通过向该损伤部位直接注射或通过可以在内部递送制剂的持续递送或持续释放机制，施用组合物。例如，可以在植入损伤附近的本发明制剂中包括能够持续递送组合物(例如可溶性多肽、抗体或小分子)的生物可降解微球或囊或其它生物可降解聚合物结构。
可以将治疗组合物递送给患者的多个位点。此多重施用可以同时实施或者可以历经几个小时实施。在某些情况下，提供持续的治疗组合物流可能是有利的。其它治疗可以以周期为基础，例如每天、每周或每月施用。
用于给药的多肽可以和摄取或吸收增强剂配制在一起以增强效力。这些增强剂包括例如，水杨酸盐、甘氨胆酸盐/亚油酸盐、glycholate、抑酶肽、杆菌肽、SDS癸酸盐等。见例如Fix(J.Pham.Sci.851282-1285，1996)和Oliyai和Stella(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32521-544，1993)。
本发明考虑多种药剂的施用，例如VEGF-C或-D产物与第二药剂例如本文中描述的神经生长因子和/或神经治疗剂联合。本发明考虑，可以将这些药剂同时在相同制剂中给予。还考虑在分开的制剂中并行地施用这些药剂，其中所述并行指药物相互之间在30分钟内给予。
另一方面，在VEGF-C或VEGF-D产物施用前施用第二药剂。施用前指在用VEGF-C/D产物治疗前一周至不超过VEGF-C/D产物施用前30分钟的范围内施用第二药剂。还考虑在VEGF-C/D产物施用后施用第二药剂。随后施用用于描述在VEGF-C/D产物给药后30分钟至VEGF-C/D产物给药后不超过一周给药。
在给定剂量中肽的量将根据治疗待施用的个体的体积以及所治疗的疾病的特征而变化。在示例性治疗中，可能必须施用大约50mg/天、75mg/天、100mg/天、150mg/天、200mg/天、250mg/天、500mg/天或1000mg/天。这些浓度可以以单剂量形式或多个剂量形式给予。首先在动物模型然后在临床试验中的标准剂量-反应研究将揭示对于特定疾病状况和患者群体的最佳剂量。
也可以理解，如果传统治疗剂与本发明治疗剂联合施用，应改变给药方案。例如，可以考虑将传统神经治疗剂或神经生长因子的施用与本发明方法相联合的神经病治疗方法。
H.药盒再一方面，本发明包括包含本发明一种或多种化合物或组合物的药物，在该药盒中本发明的组合物或组合物以利于它们用于实践本发明方法的方式包装。在一个最简单的实施方案中，药盒包括包装在容器例如密封瓶或器皿中的用于实施本发明方法的本文所述化合物或组合物(例如，用于施用给个体或用于在筛选试验中使用的多核苷酸或多肽)，以及附着于容器上或包括在包装内的用于描述所述化合物或组合物在实施本发明方法中的应用的标签。优选地，以单位剂量形式包装化合物或组合物。药盒还可以包括适用于根据优选给药路径施用组合物或适用于实施筛选试验的装置。
本发明的其它方面和细节将从如下旨在举例说明性而非限制性的实施例中得以彰显。
实施例1VEGF-C同种型与神经毡蛋白-2和神经毡蛋白-1结合以下实验证明VEGF-C同种型与神经毡蛋白家族成员，神经毡蛋白-2和神经毡蛋白-1，相互作用。
A.材料为了研究神经毡蛋白-2与VEGF-C的结合，制备或从商业来源购买了如下构建体a)NRP-2/IgG表达载体的克隆。将hNRP-2的胞外域与人IgG1 Fc尾按如下方式按符合阅读框的方式克隆在pIgplus载体中。从几个IMAGEConsortium cDNA克隆(Incyte Genomics)组装全长NRP-2cDNA(SEQ ID NO3)(图1)。所用的IMAGE克隆的标号是2A(GenBank Acc.No AA621145；Clone ID 1046499)、3(AA931763；1564852)、4(AA127681；490311)和5(AW296186；2728688)；这些克隆通过测序验证。Image克隆4和5由于可变剪接而不同，分别编码a17和a22同种型。首先将来自Image克隆3的BamHI-NotI片段克隆至pcDNA3.1z+载体(Invitrogen)中，然后加入来自克隆2A的KpnI-BglII片段和来自克隆3的BglII-BamHI片段，得到5’区(bp1-2188)。分开将来自克隆4和5的NotI-BamHI片段转移至pIgplus载体中，然后将来自pcDNA3.1z+载体的KpnI-NotI片段插入以得到编码hNRP-2胞外域/IgG融合蛋白(SEQ ID NO3，位置1-2577)的表达载体。对所得载体中的NRP-2插入物测序。Image克隆3编码的序列与GenBank序列相差一个氨基酸(AAA 1804-1806 GAG|K602E)。然而，Image克隆3中的氨基酸序列与Chen等(Chen等，Neuron，19547，1997)公布的最初序列相同。
b)VEGFR-3-Fc构建体，其中包含头3个免疫球蛋白样结构域的VEGFR-3胞外域部分(SEQ ID NO32，氨基酸1-329)与人IgG1的Fc部分融合[见Makinen等，Nat Med.，7199-205(2001)]。全长VEGFR-3 cDNA和氨基酸序列显示在SEQ ID NO31和32中。
c)NRP-1-Fc构建体，其中鼠源NRP-1的胞外域部分(SEQ ID NO5的碱基对248-2914)与人IgG1的Fc部分融合(Markinen等，J.Biol.Chem 27421217-222，1999)；和d)在pREP7骨架中编码VEGF165(GenBank登录号M32997)或全长VEGF-C(SEQ ID NO24)的表达载体近来已有描述(Olofsson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 932576-81，1996；和Joukov等，EMBO J15290-298，1996)。
B.VEGF-C与NRP-2共免疫沉淀使用FUGENETM6转染试剂(Roche Molecular Biochemicals)，将NRP-2、NPR-1和VEGFR-3pIgplus融合构建体转染至293T细胞。在补加了10％胎牛血清(Gibco BRL)、谷氨酰胺和抗生素的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基中培养细胞。培养基在转染后48小时用含有0.2％BSA的DMEM更换，并在20小时后收集。
为了产生生长因子，用编码VEGF165、前VEGF-C原的表达载体或空载体(模拟品)转染293EBNA细胞。转染后36小时，首先细胞在无甲硫氨酸和半胱氨酸的MEM(Gibco BRL)中孵育45分钟，在含有放射性标记的甲硫氨酸和半胱氨酸的补加100毫居[mCi]/ml Pro-mix[35S](Amersham)的相同培养基中代谢标记6-7小时(1mCi＝37kBq)。
对于免疫沉淀对照，1ml标记的培养基与MAB 293单克隆抗VEGF-Ab(R&D systems)或抗VEGF-C的兔抗血清882(Joukov等，EMBO J 163898-3911，1997)旋转下+4℃孵育2小时。用冰冷PBS-0.5％Tween 20洗涤免疫沉淀物2次，在Laemmli样品缓冲液中加热，15％SDS PAGE中电泳。干燥凝胶，曝光柯达Biomax MR胶片。
对于结合实验，首先来自模拟品或VEGF-C转染的细胞的标记上清液与VEGF抗体(R & D Systems)免疫沉淀以耗竭内源性VEGF。4ml含有hNRP-2a17-IgG或1ml含有VEGFR-3-IgG或NRP-1-IgG融合蛋白的培养基与1ml含有生长因子的培养基(模拟品、VEGF或VEGF-C)在结合缓冲液(0.5％BSA，0.02％Tween 20)中孵育2小时，加入蛋白A-Sepharose，孵育过夜。然后用冰冷结合缓冲液洗涤样品一次，用PBS洗涤三次，进行15％SDSPAGE。通过化学发光(ECL)检测到放射性标记的VEGF-C多肽。
结果显示，29kD同种型和21-23kD VEGF-C同种型(作为异二聚体)均结合NRP-2，而仅29kD形式结合NRP-1。VEGFR-3与VEGF-C的结合用作本试验中VEGF-C结合的阳性对照。先前已经证明，肝素有力地增加VEGF与NRP-2的结合(Gluzman-Poltorak等，J.Biol.Chem.27518040-045，2000)。将肝素加入试验混合物中显示出，VEGF165与NRP-2的结合是肝素依赖性的，而VEGF165与NRP-1的结合则独立于肝素结合，并且肝素的存在对VEGF-C与其任何受体的结合无影响。
C.使用天然表达神经毡蛋白受体的细胞的基于细胞的试验可以通过用天然表达神经毡蛋白受体(尤其是NRP-2)的细胞替代转染的293EBNA细胞，修饰前面的实验。尤其考虑使用表达神经毡蛋白受体的神经细胞的原代培养物，例如，来源于胚胎的培养的小脑颗粒细胞。此外，可以使用NRP受体特异性抗体鉴定表达NRP受体的其它细胞(例如，参与脉管系统的细胞)，例如人微脉管内皮细胞(HMVEC)、人皮下脂肪垫微脉管细胞(human cutaneous fat pad microvascular cell)(HUCEC)。
实施例2神经毡蛋白-2与VEGFR-3相互作用近来的结果指出，NRP-1是VEGF165结合的一个共受体，与VEGFR-2形成复合物，该复合物导致与VEGF165与单独VEGFR-2的结合相比，VEGF165通过VEGFR-2的信号转导增强，由此增强对该配体的生物学反应(Soker等，Cell92735-45，1998)。相似的现象可以应用于VEGFC通过可能的VEGFR-3/NRP-2受体复合物的信号转导。
A.结合试验如实施例1中所述克隆NRP-2(a22)表达载体，并在3’端添加可检测标签。对于3’端的构建，通过PCR构建Not I-BamHI片段(克隆5)，从而向3’端引入V5标签(GKPIPNPLLGLDST)(SEQ ID NO33)和终止密码子。为了获得编码全长hNRP-2(a22)蛋白质的表达载体，将此3’端转移至含有5’片段的载体中。所得克隆称作V5 NRP-2。
为了确定VEGFR-3和NRP-2的相互作用，使用6μl FUGENE TM6(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，Indiana)和2μg DNA，用V5NRP-2构建体或VEGFR-3转染人胚胎肾细胞(293T或293EBNA)的10cm板。在补加了10％胎牛血清(Gibro BRL)、谷氨酰胺和抗生素的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基中培养细胞。对于模拟转染，使用2μg空载体。对于单受体转染，以1比1的比率，使用VEGFR3-myc/pcDNA3.1(Karkkainen等，Nat.Genet.25153-59，2000)或NRP-2(a22)/pcDNA3.1z+和空载体。也以1比1的比率进行VEGFR-3/NRP-2共转染。24小时后，使293EBNA细胞饥饿过夜，并使用300ng/ml ANACVEGF-C(在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中表达；(Joukov等EMBO J 163898-3911，1997))刺激10分钟。然后用含有钒酸盐(100μM)和PMSF(100μM)的冰冷PBS洗涤细胞2次，在含有2mM钒酸盐、1mM PMSF、0.07U/ml抑酶肽和4μg/ml亮抑酶肽的二聚体化裂解缓冲液(20mM HEPES pH7.5，150mM NaCl，10％甘油，1％Triton X-100，2mM MgCl2，2mM CaCl2，10μg/ml牛血清白蛋白(BSA))中裂解。19,000g离心10分钟以澄清裂解物，在4℃与VEGFR-3的抗体(9d9F；(Jussila等，Cancer Res.581599-1604，1998))或V5抗体(Invitrogen)孵育5小时。然后免疫复合物与蛋白A-Sepharose(Pharmacia)在+4℃温育过夜，用无BSA的二聚体化裂解缓冲液洗涤免疫沉淀4次，样品在还原条件进行7.5％SDS-PAGE。使用半干转移装置，将蛋白转移至Protran硝化纤维素滤膜(Schleicher & Schuell)。用5％脱脂奶粉在TBS-T缓冲液(10mM Tris pH7.5，150mM NaCl，0.1％Tween 20)封闭后，滤膜与V5抗体一起孵育，之后与HRP缀合的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako)孵育，使用增强化学发光(ECL)观察。
转染至293T细胞中的VEGFR-3和NRP-2构建体的共沉淀说明，NRP-2与VEGFR-3当在相同细胞中共表达时将发生相互作用。向细胞培养基中加入VEGF-C后的免疫沉淀显示，NRP-2/VEGFR-3相互作用不依赖于VEGF-C配体的存在，提示这些受体在体内可能天然地在无VEGF-C的情况下缔合。此发现对脉管发生过程中VEGF-C的结合和活性可能有着巨大的意义。VEGF-C，一种促进淋巴脉管系统(lymphatic vasculature)生长和发育的必需分子，也高度参与癌细胞通过淋巴系统的转移以及显然地至少一些肿瘤的新脉管化(见国际专利申请WO00/21560)。神经毡蛋白与VEGF-C的此新相互作用提供了通过VEGF-C与VEGFR-3结合造成的对淋巴细胞迁移的抑制、特异地阻断此淋巴管向实体肿瘤中生长的方法。
实施例3神经毡蛋白抑制VEGF-C与VEGFR-3结合VEGF-C和神经毡蛋白受体分子间的结合亲和性提示VEGF-C诱导的VEGFR-3受体信号转导的调节剂可以作为治疗剂，以调节，即刺激或抑制VEGF-C受体介导的生物学过程。以下实施例设计用于提供有关此治疗概念的证据。
A.体外无细胞试验为了证实神经毡蛋白-1-Fc和神经毡蛋白-2-Fc对VEGF-C刺激作用的抑制效应，将VEGF-C蛋白质与标记物例如生物素分子融合，首先与神经毡蛋白-1-Fc、神经毡蛋白-2-Fc、VEGFR-2-Fc和VEGFR-3-Fc以各种摩尔比一起孵育，然后加至预先用1μg/ml VEGFR-3和VEGFR-2包被的微量滴定板中。用1％BSA/PBS-T封闭后，将新鲜的标记的VEGF-C蛋白或VEGF-C/受体-Fc混合物加至该微量滴定板，4℃过夜。之后，用PBS-T洗涤板子，加入1∶1000亲和素-HPR。通过加入ABTS底物(KPL)检测结合的VEGF-C蛋白。在有和无可溶性神经毡蛋白或可溶性VEGFR存在时分析结合的标记的VEGF-C，并评价结合抑制百分数，以及神经毡蛋白对VEGFR-2或VEGFR-3包被的微量板的结合的影响。在一个相关变化方案中，用VEGF-D替代VEGF-C实施该试验。
B.体外基于细胞的试验如上所述使用VEGF-C接触在细胞表面天然或重组表达NRP-2和VEGFR-3受体的细胞。例如，可以使用如上列出的通过重组方式改变而瞬时或稳定地表达神经毡蛋白和VEGFR-3的293EBNA或293T细胞。几种天然的内皮细胞表达这两种受体，因此也可以使用，这些细胞包括但不限于人微脉管内皮细胞(HMEC)和人皮下脂肪垫微脉管细胞(HUCEC)。
为了评价VEGFR-3的自身磷酸化，用FUGENE TM6转染试剂(RocheMolecular Biochemicals)和编码受体构建体(VEGFR-3或VEGFR-3-myc标签和/或神经毡蛋白-V5标签)的质粒DNA或者空pcDNA3.1z+载体(Invitrogen)，转染培养在补加了10％胎牛血清(GIBCO BRL)、谷氨酰胺和抗生素的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)中的293T或293EBNA人胚胎肾细胞。对于刺激试验，在含有0.2％BSA的无血清培养基中使293EBNA细胞单层饥饿过夜(转染后36小时)。然后，为了测定对VEGF-C/VEGFR-3结合的抑制，在有或无神经毡蛋白-Fc存在下，在+37℃用300ng/ml重组DNDC VEGF-C(Joukov等，EMBO J.163898-3911，1997)刺激293EBNA细胞10分钟。然后用含有2mM钒酸盐和2mM苯基甲磺酰氟(PMSF)的冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次，在含有2mM钒酸盐、2mM PMSF、0.07％U/ml抑酶肽和4mg/ml亮抑酶肽的PLCLB缓冲液(150mMNaCl，5％甘油，1％Triton X-100，1.5M MgCl2和50mM Hepes，pH7.5)中裂解。裂解物以19000g离心10分钟，上清液与2μg/ml单克隆抗VEGFR-3抗体(9D9f9)(Jussila等，Cancer Res，581599-1604，1998)或与抗特异标签表位抗体(1.1mg/ml抗V5抗体(Invitrogen)或5μg/ml抗Myc抗体(BabCO))在冰上孵育2小时。免疫复合物与蛋白A-Sepharose(Pharmacia)一起在+4℃旋转孵育45分钟，用冷PLCLB缓冲液(2mM钒酸盐，2mM PMSF)洗涤Sepharose珠3次。通过7.5％SDS-PAGE分离结合的多肽，使用半干转移装置将其转移至Protran硝化纤维素滤膜(Schleicher & Schuell)。用5％BSA在TBS-T缓冲液(10mM Tris pH7.5，150mM NaCl，0.1％Tween 20)中封闭后，用磷酸酪氨酸特异性一抗(Upstate Biotechnology)，然后用生物素化的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Dako)及生物素-链霉亲和素HRP复合体(Amersham)染色。通过增强化学发光(ECL)观察磷酸酪氨酸特异性条带。为了分析样品中是否存在VEGFR-3，在100mM 2-巯基乙醇、2％SDS、62.5mM Tris-HCl pH6.7中不时搅拌下+55℃剥离滤膜上的探针30分钟，用9D9f9抗体和HRP缀合的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako)染色以检测抗原。VEGFR-3自磷酸化的减少说明神经毡蛋白-Fc成功地介导了对VEGF-C/VEGFR-3结合的抑制。
在无血清Ham氏F-12营养混合物(GIBCO)(含有7％胎牛血清(FCS))中天然分泌至PC-3前列腺腺癌细胞系(ATCC CRL 1435)的条件培养基中的VEGF-C蛋白(美国专利6,221,839)可以用于体外激活VEGFR3表达细胞。对于体外试验目的，可以将细胞重新接种并培养在该培养基中，随后将该培养基改变为无血清培养基。如先前实验所显示的，用50微升与CNBr-活化的Sephorase CL-4B(Pharmacia；大约1mg VEGFR-3EC域/ml Sepharose树脂)偶联的VEGFR-3胞外域预先处理此浓缩的PC-3条件培养基，完全地消除VEGFR-3的酪氨酸磷酸化(美国专利6,221,839)。在一个相关实验中，可以用与Sepharose偶联的神经毡蛋白组合物或对照Fc预先处理该PC-3条件培养基。可以裂解细胞，使用抗VEGFR-3抗血清进行免疫沉淀，并使用先前描述的抗磷酸酪氨酸抗体通过Western印迹分析。由于神经毡蛋白对VEGF-C的隔离导致的对VEGF-C结合和下游VEGFR-3自磷酸化的抑制百分数可以在此更具有生物学相关性的情况下测定。
以上实验也可以使用相关的脑信号蛋白蛋白联合本发明的神经毡蛋白组合物进行，以确定神经毡蛋白受体的另一天然配体在封闭VEGF-C/神经毡蛋白受体相互作用上的效果。如果VEGF-C和脑信号蛋白通过神经毡蛋白受体上的相同位点与神经毡蛋白受体结合，则VEGF-C与VEGFR-3的结合以及VEGFR-3的自磷酸化将由于未结合至神经毡蛋白-Fc上的VEGF-C的增加而随后增加。然而，如果脑信号蛋白与VEGF-C结合神经毡蛋白受体上的不同位点并且相互不抑制对方的结合，则VEGF-C与VEGFR-3的结合量将与没有脑信号蛋白(即，单独使用神经毡蛋白-Fc)时的结合量相当。该试验还可以进一步阐释VEGF-C/神经毡蛋白的相互作用。
上述体外无细胞试验和基于细胞的试验也可以使用推测的调节剂化合物，例如影响VEGF-C分泌的细胞因子(TNFa，TGFb，PDGF，TGFa，FGF-4，EGF，IL-1a，IL-1b，IL-6)来实施，以确定神经毡蛋白组合物在VEGF-C调节剂——在炎症和肿瘤生长状况下具有生物学活性的调节剂——存在时封闭VEGF-C活性的效力，从而对神经毡蛋白组合物和目前的实验癌症治疗剂进行比较。
实施例4神经毡蛋白-2/VEGF-C结合对VEGF-C相关生物学功能的影响VEGF-C与许多有关淋巴管发生和内皮细胞生长的功能密切相关。可以使用如下试验研究体内NRP-2对这些VEGF-C功能的影响A.细胞迁移试验例如，人微脉管内皮细胞(HMVEC)表达VEGFR-3和NRP-2，可以使用这些细胞研究可溶性和膜结合型神经毡蛋白受体对这些细胞的影响。由于神经毡蛋白和VEGF/VEGFR的相互作用被认为在细胞迁移中起作用，故可以通过利用HMVEC或其它适宜细胞的细胞迁移试验，阐明神经毡蛋白分子的刺激或抑制作用。
使用改良的Boyden室试验，用50μg/ml纤连蛋白(Sigma)、0.1％明胶在PBS中室温包被聚碳酸酯滤膜孔(Transwell，Costar，8微米孔)30分钟，之后在DMEM/0.1％BSA中37℃平衡1小时。将天然表达VEGFR-3和神经毡蛋白受体的HMVEC(第4-9代传代细胞，1×105个细胞)或重组表达VEGFR-3和/或NRP-2的内皮细胞系接种在滤膜孔的上方室中，在存在变化浓度的神经毡蛋白-1-Fc、神经毡蛋白-2-Fc和VEGFR-3-Fc蛋白下，允许细胞向滤膜的下侧、朝着含有补加了前VEGF-C原或酶学加工的VEGF-C的无血清培养基的孔的底部室迁移。5小时后，用棉拭子除去贴在transwell顶部的细胞，固定并染色向滤膜下侧迁移的细胞。为了定量细胞数量，每个滤膜计数6个随机选择的400X显微镜视野。
在另一变化方案中，使用稳定转染了构建体(例如先前描述的那些构建体)以表达NRP-2、VEGFR-3或NRP-2和VEGFR-3两者(即，PAE/NRP-2、PAE/VEGFR-3、或PAE/NRP-2/VEGFR-3)的猪主动脉内皮细胞(PACE)实施上述迁移试验。PACE使用Soker等(Cell92735-745，1998)描述的方法进行转染。将转染的PAEC(1.5×104个细胞，在补加了0.1％BSA的无血清F12培养基中)接种在如上述用纤连蛋白准备的Boyden室的上方孔中。向下方室的孔中加入递增浓度的VEGF-C或VEGF-D，以诱导内皮细胞迁移。4小时后，通过相差显微镜定量迁移通过滤膜的细胞数量。
NRP-2/VEGFR-3双转染子比NRP-2或VEGFR-3单转染子在迁移和趋化性上的增加说明，神经毡蛋白-2的存在增强VEGF-C或VEGF-D通过VEGFR-3传递信号并刺激下游生物学效应(尤其是，细胞迁移，以及可能地，血管发生(angiogenesis)或淋巴管发生(lymphangiogenesis))的能力。
此外，还可以使用猪主动脉内皮细胞迁移试验鉴定NRP-2/VEGFR-3/VEGF-C在内皮细胞上介导的刺激作用的调节剂。在向Boyden室的下方孔添加组合物，例如可溶性受体肽、蛋白质或其它小分子(例如，单克隆和双特异性抗体或化学化合物)以及VEGF-C配体后，评价PAE/NRP-2/VEGFR-3表达细胞的迁移。由于任何肽、蛋白质或小分子的加入导致的迁移减少，将该化合物鉴定为NRP-2/VEGFR-3介导的趋化性的抑制剂。
B.有丝分裂原试验在存在或不存在VEGFR-C多肽和该相互作用的潜在调节剂，例如脑信号蛋白，更尤其是Sema3F，以及已知上调VEGF-C活性的细胞因子(可以包括但不限于TGF-β，TNF-α，IL-1α和IL-1β、IL-6和PDGF)的情况下，培养单独表达VEGFR-3、单独表达NRP-2或表达VEGFR-3和NRP-2两者的胚胎内皮细胞，以便使用任何细胞生长或迁移试验，例如测量细胞数量增加的试验或测量氚化胸苷掺入的试验分析对细胞生长的影响。见例如，Thompson等，Am J.Physiol.Heart Cir.Physiol.281H396-403(2001)。
实施例5脉管发生试验持续地长期感到需要可以刺激脉管发生，例如促进伤口愈合、或促进成功的组织移植和移植术的其它药剂，以及抑制脉管发生(例如，以抑制肿瘤生长)的药剂。而且，不同的脉管发生刺激剂和抑制剂可以协同地通过相同或不同受体以及对循环系统的不同部分(例如动脉或静脉或毛细血管；血管的或淋巴的)起作用。脉管发生试验可以用于测量神经毡蛋白/VEGF-C相互作用单独地或与其它生脉管因子和抗脉管发生因子联合对脉管发生过程的影响，以确定涉及神经毡蛋白和其它调节剂的优选联合疗法。示例性操作程序包括如下程序A.体外脉管发生试验1.出芽试验(sprouting assay)在胶原包被的珠子(Pharmacia)上培养HMVEC细胞(第5-9代传代细胞)5-7天至汇合。在含有5.5mg/ml纤连蛋白(Sigma)、2单位/ml凝血酶(Sigma)、DMEM/2％胎牛血清(FBS)以及如下待测蛋白和对照蛋白的凝胶基质中接种这些珠子20ng/ml VEGF，20ng/ml VEGF-C，或生长因子加10μg/ml神经毡蛋白-2-Fc，以及生脉管因子和Fc融合蛋白的几种组合。每隔2天向明胶基质加入补加了待测蛋白和对照蛋白的无血清培养基，计数并评价超过珠子长度的内皮细胞芽的数量。
2.迁移试验还可以使用前述transwell迁移试验，联合此出芽试验以确定本发明神经毡蛋白组合物对VEGF-C激活剂和细胞功能的相互作用的影响。分析在应答本发明神经毡蛋白组合物或者该组合物与已知生脉管剂或抗脉管发生剂的联合的情况下VEGF-C对细胞迁移的影响。在VEGF-C刺激作用后由于存在神经毡蛋白所导致的细胞迁移减少，说明本发明提供了抑制脉管发生的方法。
该试验也可以使用天然表达VEGFR-3或VEGFR-2的细胞，例如优先地表达VEGFR-2的牛内皮细胞来完成。可以使用展示出特定受体的天然或瞬时表达细胞确定本发明神经毡蛋白组合物可以用于优选治疗涉及VEGFR-3或VEGFR-2异常活性的疾病。
B.体内脉管发生试验1.尿囊绒膜(CAM)试验打开三日龄受精的白色Leghorn鸡蛋，将带有完整卵黄的鸡胚细心地放入20×100mm塑料培养皿。37℃在3％CO2中孵育6天后，在各胚胎的CAM上移植一个甲基纤维素园片——其中该园片含有VEGF-C以及神经毡蛋白组合物、VEGFR-3和神经毡蛋白-2及VEGFR-3复合物的各种组合并在尼龙网(3×3mm)上干燥——以确定神经毡蛋白对脉管发育的影响及其在促进或抑制脉管形成方面的潜在用途。通过使10微升0.45％甲基纤维素(在H2O中)脱水，制备所述的尼龙网片。4-5天孵育后，通过实体镜检查胚胎和CAM在植入片的区域中新血管和淋巴管的形成。含有PBS的甲基纤维素片用作阴性对照。识别血管和淋巴管细胞表面分子的抗体用于进一步表征这些脉管。
2.角膜试验用改良的vor Graefe白内障刀在雄性5至6周龄C57BL6/J小鼠的双眼中产生角膜微袋。向每个微袋中植入NCC型Hydron聚合物(IFN Science，New Brunswick，NJ)包被的蔗糖硫酸铝(Bukh Meditec，Copenhagen，Denmark)微球(0.35×0.35mm)，该微球含有单独的或与如下物质联合的各种浓度的VEGF分子(尤其是VEGF-C或VEGF-D)i)已知调节脉管生长的因子(例如，160ng VEGF或80ng FGF-2)；ii)上述神经毡蛋白多肽；或iii)神经毡蛋白多肽与天然神经毡蛋白配体例如脑信号蛋白，例如Sema-3C和Sema3F的联合。将微球放置在距离角膜缘0.6-0.8mm处。植入后，给眼睛施用红霉素/眼药膏。利用裂隙灯生物显微镜检查眼3-12天。测量脉管长度和周围新脉管化和淋巴管发生的时刻。此外，将眼切片并免疫染色血管和/或淋巴标志(LYVE-1[Prevo等，J.Biol.Chem.，27619420-19430(2001)]，podoplanin[Breiteneder-Geleff等，Am.J.Pathol.154385-94(1999)]和VEGFR-3)以进一步表征受到影响的脉管。
实施例6体内肿瘤模型有越来越多的证据证明神经毡蛋白受体可能在肿瘤进程中起重要作用。在几种肿瘤细胞系中发现了神经毡蛋白-1受体，而且将NRP-1转染至AT2.1细胞中可以促进肿瘤生长和脉管化(Miao等，FASEB J.142532-39，2000)。此外，对类癌瘤——消化道中衍生自神经内分泌细胞的缓慢发育肿瘤——中神经毡蛋白-2表达的研究指出，神经毡蛋白-2实际上在肿瘤周围的正常组织中表达，但不在肿瘤中心本身表达(Cohen等，Biochem.Biophys.Res.Comm.284395-403，2001)，而且已经确立神经内分泌细胞分泌VEGF-C、VEGF-D并在其细胞表面表达VEGFR-3(Partanen等，FASEB J 142087-96，2000)。肿瘤中和肿瘤周围与VEGF分子(常常与脉管密度和肿瘤进展有关)结合的这些神经毡蛋白的差异表达水平可能指示肿瘤进展或消退。
A.异位肿瘤植入(ectopic tumor implantation)在6至8周龄裸鼠(nu/nu)(SLC，Shizuoka，日本)的右肋腹上皮下移植0.1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的C6大鼠成胶质细胞瘤细胞或PC-3前列腺癌细胞。将前面列出的神经毡蛋白多肽以各种浓度和剂量方案施用给这些动物。测量肿瘤的2维大小，并使用公式——宽2×长/2——计算肿瘤体积。14天后，人为处死小鼠并尸检，以评价响应神经毡蛋白多肽对VEGF-C的抑制作用而致的肿瘤脉管化数量和生理。
明显地，该试验也可以使用其它肿瘤细胞系植入裸鼠或其它小鼠株系中进行。特别考虑使用植入LLC肺癌细胞和B16黑素瘤的野生型小鼠。
B.同位肿瘤植入(orthotopic tumor implantation)将PBS中大约1×107MCF-7乳房癌细胞接种在切除卵巢的SCID小鼠或裸鼠的第二(腋下)乳腺的脂肪垫中，所述小鼠皮下带有含0.72mg 17β-雌二醇的60天缓释小球(Innovative Research of America)。卵巢切除术和小球的植入在肿瘤细胞接种前4-8天进行。将前述神经毡蛋白多肽和VEGF-C多肽以及脑信号蛋白(尤其是Sema3C和Sema3F)以不同浓度和剂量方案施用给这些动物。测量肿瘤的2维大小，并使用公式——宽2×长/2——计算肿瘤体积。14天后，人为处死小鼠并尸检，以评价肿瘤脉管化的数量和生理。
实施相似操作方案，其中将PC-3细胞植入雄性小鼠前列腺。
C.淋巴转移瘤模型VEGF-C/VEGFR3相互作用常常与成年组织中淋巴管的组构(organization)和生长相关，因此，神经毡蛋白受体在这些部位的存在可能涉及一些癌症的转移性质。以下方案用于说明神经毡蛋白多肽，尤其是神经毡蛋白-2多肽，或其片段抑制淋巴转移的能力。
将MDA-MB-435乳房癌细胞注射至无胸腺雌性8周龄裸鼠的第二乳腺脂肪垫两侧。这些细胞常常经12周转移至淋巴结。开始，可以使用之前确定的神经毡蛋白-VEGF-C结合的调节剂(尤其考虑脑信号蛋白)，评价神经毡蛋白-2与VEGF-C和VEGFR3结合在肿瘤转移中的作用。与NRP-2阻断相关的肿瘤转移减少说明NRP-2在肿瘤转移中具有关键作用。然后，将之前(通过本发明)确定的神经毡蛋白-VEGF-C结合的调节剂以各种浓度和剂量方案施用给这些动物。而且，可以联合施用神经毡蛋白-2多肽与其它物质以减少肿瘤转移。见，例如，国际专利公布号WO00/21560，完整并入此处作为参考。12周后处死小鼠，组织学分析淋巴结。由于施用神经毡蛋白组合物导致的淋巴管和肿瘤扩散的减少说明本发明可以作为治疗化合物抑制肿瘤转移。
实施例7利用胶原排斥试验(Collagen repulsion assay)在生长锥萎陷方面评价VEGF-C已经提出，中枢神经系统中脑信号蛋白的组成性表达是该区域中缺乏神经再生的主要因素。神经损伤，例如坐骨神经压伤后周围神经的再生可以通过损伤后脑信号蛋白-3A表达的立即下调来实现。损伤后大约36天Sema3A表达返回基线水平，但是该持续期的降低脑信号蛋白表达使得可以在脑信号蛋白活性造成再生停止前周围神经生长并再生进入损伤区域(综述见Pasterkamp和Verhaagen，Brain Res.Rev.3536-54，2000)。尽管许多脑信号蛋白在CNS和PNS中广泛表达，但脑信号蛋白-3F，神经毡蛋白-2的主要配体，显示出在人脑中广泛分布，并且甚至已经发现其在阿尔茨海默氏病患者的某些脑区中过表达(Hirsch等，Brain Res.82367-79，1999)。新发现的VEGF-C结合NRP-2的相互作用可以提供用于在许多神经变性病例如阿尔茨海默氏病或黄斑变性中特异抑制sema-3F活性在终止神经再生方面的作用的因子。而且，VEGF-C的明显神经营养作用(例如，见实施例8中的描述)可以协同地与sema-3F抑制活性联合以产生有益结果。
根据Chen等(Neuron，2543-56，2000)和Giger等(Neuron，2529-41，2000)的方法从E13.5或E15.5-17.5大鼠或小鼠胚胎中解剖出颈上神经节(SCG)，用于胶原排斥试验中。解剖后，在培养基[70∶25的OPTI-MEM和F12，补加1％P/S，Glutamax(Gibco)，5％FCS和40mM葡萄糖]中将后脑-中脑汇合处外植块与经重组修饰以表达碱性磷酸酶缀合的Sema3F的COS细胞或模拟转染的COS细胞在胶原基质中共同培养48小时。使用Giger等(Neuron，2529-41，2000)给出的方案定量神经突的延伸，其中该方案可以简要地描述为测定在培养基质中超过规定点的神经突延伸的百分数。可以在存在变化浓度的VEGF-C组合物时测量神经突的延伸并与不存在VEGF-C组合物时比较，可以评价由于VEGF-C加入培养基和封闭Sema3F与神经毡蛋白-2的相互作用所导致的神经突延伸的随后增加。
从本发明所致的Sema3F抑制作用的效果可以外延至几种由于脑信号蛋白的存在抑制了神经元再生的疾病，例如颅神经损伤后，以及可能地阿尔茨海默氏病患者脑中的结疤。
以上以及之后的实施例的变化方案将是明显的，并且被认为是权利要求中发明的方面。例如，前述实施例中描述的材料和方法可以用于和容易地作适应性修改以用于筛选本文所述多肽相互作用的新调节剂，以及用于阐明这些新调节剂在基于细胞的系统中和体内的效果。换言之，实施例的材料和方法中的操作程序可以用于鉴定调节剂并根据体外和体内活性筛选调节剂。
例如，实施例1描述研究VEGF-C与神经毡蛋白结合的实验方案。可以实施相似的结合实验，其中向结合实验中添加一或多个浓度的被测药剂，以确定该被测药剂是否调节(增加或减少)VEGF-C和神经毡蛋白之间的可测量结合。实施例2描述研究VEGFR3与神经毡蛋白结合的实验方案。可以实施类似的结合实验，其中在反应物中包括被测药剂，以确定该被测药剂是否调节(增加或减少)VEGFR-3和神经毡蛋白之间的可测量结合。在最初结合试验中鉴定为调节剂的被测药剂可以包括在随后实施例提供的基于细胞的和体内的试验中，以测量该被测药剂对表达目的受体的细胞(例如VEGFR-3或神经毡蛋白表达细胞)或对生物学系统和生物体的生物学作用。
类似地，多个实施例描述在实验中使用可溶性形式的神经毡蛋白受体或其它蛋白质进一步证实本文首次描述的分子间结合关系。这些实验也说明，可以将与配体/受体对或受体/共受体对之一或两个成员结合的分子加入系统以调节(尤其是抑制)该结合对相互作用的能力。例如，在实施例3中使用可溶性NRP分子调节(抑制)VEGF-C或VEGF-D与VEGFR-3或VEGFR-2的结合。破坏VEGF-C或VEGF-D与其各自VEGFR受体的结合，在治疗多种以不期望的配体介导的VEGFR-3或VEGFR-2刺激作用为特征的疾病方面具有实际用途。可以实施相似的结合实验，其中用被怀疑调节相同结合相互作用的被测药剂替代可溶性NRP分子。以此方式，可以使用实施例的材料和方法鉴定和验证被测药剂的治疗价值。
实施例8VEGF-C-/-动物的表型为了分析VEGF-C在淋巴管发生和神经元生长中的作用，通过用LacZ基因置换VEGF-C第一编码外显子，制备VEGF-C基因缺陷小鼠。
A.产生VEGF-C敲除小鼠从129Sv小鼠基因组文库以5’和3’区段形式分离VEGF-C基因。将2.9kbBamHI-PstI片段平末端克隆至pNTPloxP靶向载体的BamHI位点，以制备3’臂。利用HindIII和(部分)BsmBI消化切下3.3kb5’臂，将其插入pSDKlacZ质粒的LacZ/NeoR区上游。随后，将此构建体的SalI盒克隆至含有3’臂的pNTPloxP质粒的XhoI位点，产生最终靶向载体。5’臂经设计缺失了第一外显子，包括翻译起始位点上游125bp片段、编码区的头147bp(49个密码子)和第一内含子的143bp(包括信号肽)。这就将LacZ报道基因置于VEGF-C基因的调节区控制下。
电穿孔将此靶向构建体导入R1(129/Sv×129/SvJ)小鼠ES细胞中。使用NcoI消化物和5’外部探针，通过Southern印迹分析，筛选所述定向突变。阳性克隆与WT桑椹胚聚合以获得嵌合小鼠，该小鼠与ICR小鼠交配。通过Southern印迹或通过PCR使用引物5’-TCC GGT TTC CTG TGAGGC-3’(正向)(SEQ ID NO34)、5’-AAG TTG GGT AAC GCC AGG-3’(反向，用于所靶向的等位基因)(SEQ ID NO35)和5’-TGA CCT CGC CCC CGTC-3’(反向，用于VEGF-C第一外显子)(SEQ ID NO36)，分析幼崽的基因型。
B.VEGF-C-/-基因型的致死性在VEGF-C+/-小鼠的243只子代中仅发现少数VEGF-C-/-幼崽，提示VEGF-C缺陷导致胚胎致死性。发现了预期频率的VEGF-C-/-胚胎，但是大多数从E12.5起水肿，并且在E18.5时严重肿胀并生长停滞。所有VEGF-C-/-胚胎在晚期死亡。
在含有LacZ-VEGF-C标志基因的胚胎中整装片染色β-半乳糖苷酶活性，指示VEGF-C自E8.5起在第一淋巴囊形成的颈区中强烈地表达(Kukk等，Development 122，3829，1996)。因此，在E10.5 VEGF-C+/-胚胎切片中对β-半乳糖苷酶和VEGFR-3的双重染色显示，在VEGFR-3阳性颈静脉(其产生淋巴内皮)的背外侧间充质中存在丰富的VEGF-C。
VEGF-C表达的位置和时间提示，VEGF-C在淋巴脉管系统的发育中起作用。因此，在来自颈静脉区的切片上对淋巴标志VEGFR-3、LYVE-1或podoplanin的染色显示，VEGF-C-/-胚胎中没有形成淋巴囊，而在其VEGF-C+/-和VEGF-C+/+同窝出生仔中淋巴囊清晰可见。有趣的是，VEGFR-3也在VEGF-C-/-胚胎的一些含有红细胞的毛细管中继续表达，而在其同窝出生仔中下调。在PECAM-1和平滑肌肌动蛋白染色切片上静脉和动脉表现正常。E17.5的VEGF-C-/-胚胎的VEGFR-3整装片染色显示，在后期也不存在包括胸导管的淋巴管。
C.VEGF-C-/-胚胎的Prox-1表达Prox-1是淋巴内皮细胞中表达的转录因子，其可以用于测量淋巴网络形成的程度。与VEGF-C-/-胚胎相似，Prox-1缺陷胚胎也不能形成原始淋巴囊(Wigle和Oliver，Cell 98，769(1999)Wigle等，EMBO J.21，1505(2002))。为了测量VEGF-C表达对Prox-1的影响，通过整装片免疫荧光，在VEGF-C-/-胚胎中研究Prox-1表达。
为了产生Prox-1抗体，将编码Prox-1(SEQ ID NO37)同源异型框域(homeobox domain)和prospero域(人Prox-1的氨基酸578-750，SEQ ID NO38)的cDNA亚克隆至pGEX2t载体中，产生GST-Prox-1融合构建体，使用谷胱甘肽Sepharose根据厂商说明书(Amersham，Piscataway，NJ)从大肠杆菌纯化该GST-Prox-1融合蛋白。使用融合蛋白根据标准方案免疫兔子，使用具有偶联GST-和GST-Prox-1的乙烯砜琼脂糖树脂(Sigma)的连续柱子，从兔血清分离Prox-1特异性抗体。此纯化的抗体识别来自转染了Prox-1的293细胞的裂解物中的85kD蛋白质，但不识别来自转染了空载体的细胞的裂解物。在小鼠皮肤的冰冻切片中，该抗体也特异地染色淋巴内皮细胞但不染色血管内皮细胞。
对于整装片外植块(whole mount explant)，分离来自E10-E13胚胎的轴向脉管系统(axial vascular system)、部分内胚层衍生物和所有中段中胚层衍生物。在E10.5，在所有胚胎的颈静脉中双侧检测到强烈的内皮Prox-1染色。这些表达Prox-1的淋巴内皮细胞在VEGF-C+/+和VEGF-C+/-胚胎中已经开始萌芽，而在VEGF-C-/-胚胎中表达Prox-1的内皮细胞局限在主静脉的壁上。随后，在VEGF-C+/+和VEGF-C+/-胚胎中表达Prox-1的内皮细胞形成颈静脉淋巴囊，在E13时清楚地见到该颈静脉淋巴囊。然而，在VEGF-C-/-胚胎中，在此阶段仅有少数表达Prox-1的内皮细胞留在主静脉(cardinal vein)中，而且未发现淋巴囊样结构。在分析的所有阶段，VEGF-C-/-胚胎的心肌细胞和肝细胞中的Prox-1表达显示正常。这提示，VEGF-C不是细胞向淋巴内皮细胞谱系定型(cell commitment)所必需的，但是旁分泌VEGF-C信号是表达Prox-1的内皮细胞自主静脉迁移所需的，并且是随后的淋巴囊形成所需的。在缺失VEGF-C时，表达Prox-1的内皮细胞的数量到E13时也减少，说明VEGF-C是这些细胞存活所必需的。
D.神经系统中的VEGF-C表达在VEGF-C-/-除了淋巴发育之外的胚胎发育区域中对VEGF-C表达的分析显示，胚胎形成过程中VEGF-C的表达也定位在神经系统。对VEGF-C-/-小鼠中Prox-1表达的分析也说明，Prox-1与VEGF-C共同定位在中-后脑区中，而且，Prox-1还在发育中的眼和发育中的前肢区域中表达。在VEGF-C-/-胚胎的中-后脑区中未检测到Prox-1表达，而在VEGF-C-/-动物的其它位点水平保持相同。
VEGF-C在胚胎发生的各个阶段于中-后脑区中以及于小脑壁中强表达。通过VEGF-C+/-动物的原位杂交，检测VEGF-C在成年脑中的表达。在成年动物中大多数脑区，包括小脑(颗粒细胞和浦肯野细胞)，脑中的平滑肌细胞、脑室下区(SVZ)、嗅球神经胶质细胞、下丘脑、海马、脑干、视区、大脑皮质区域和脑神经节，检测到VEGF-C。
VEGF-C在脑中的广泛表达说明其在CNS中具有作用。VEGF-C可能作为神经保护剂或神经营养剂在CNS中起作用。此外，其在脉管周围平滑肌细胞中的表达提示，VEGF-C可能在脑中对内皮细胞发挥作用(例如，存活或通透性功能)。视区中的表达提示VEGF-C可能在视觉系统的发育和维持中有极其重要的作用。而且，已知SVZ含有神经祖先细胞(Picard-Riera等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 9913211-13216，2002)。这些祖先细胞从该区通过喙状迁移流迁移至嗅球，在此处它们置换球周和颗粒神经元细胞。然而，响应损伤，SVZ细胞可以被触发而更大量地增殖和分化为星形胶质细胞(Picard-Riera等，同上引文)。因此，VEGF-C可能在神经祖先细胞的存活和增殖和/或迁移中起作用。
D.1 VEGF-C诱导Prox-1阳性细胞增殖在来自胚胎日(E)11.5的VEGF-C-/-和VEGF-C+/+胚胎的组织外植块中，通过VEGF-C自琼脂糖珠的释放，分析外源VEGF-C的影响。在含有100ng/μlVEGF-C(巴斯德毕赤酵母产生的hVEGF-CΔNΔC-6×His，描述在(Joukov等，1997))的PBS中孵育Affi-Gel Blue珠(筛目尺寸100-200；Bio-Rad，Hercules，CA)。对照样品中，使用含有100ng/μl人血清白蛋白(HAS)或1％BSA的琼脂糖珠。将珠子按如下方式加入组织外植块两个珠子于紧靠后肾区的背主动脉的侧面，两个珠子于紧靠颅侧中肾区的背主动侧面，两个珠子于紧靠颈筋脉区的主动脉弓侧面。在Trowell型器官培养系统(Sainio，2003)中，在放置在金属栅格顶上的Tracktech Nucleopore滤膜(孔径0.1μm；Whatmann)上培养外植块48小时。
48小时培养后，固定胚胎并利用免疫组织化学分析Prox-1和PECAM-1表达。对于免疫组织化学染色，在-20℃甲醇中固定组织10分钟，用PBS洗涤3次，用1％BSA在4℃封闭1小时。然后组织与稀释在封闭溶液中的一抗一起孵育过夜。所用一抗是大鼠抗小鼠PECAM-1(PharMingen，SanDiego，CA)和亲和纯化的兔抗Prox-1。用Cy2、FITC或TRITC-1标记的二抗(Jackson Laboratories)染色。用Immu-mountTM(Thermo Shandon，Pittsburgh，PA)或用Vectashield(Vector Laboratories)进行组织封固，并通过Zeiss Axioplan 2荧光显微镜分析。
一般，所用的高浓度VEGF-C破坏了脉管的正常动脉/静脉分级(hierarchy)。在所有胚胎中，表达Prox-1/PECAM-1的淋巴内皮细胞向表达VEGF-C的珠子迁移。然而，在所有基因型中，VEGF-C也诱导Prox-1阳性和PECAM-1阳性细胞的大量增殖。由于所有其它表达Prox-1的细胞/组织(例如，肝原基、心脏、背神经节；见(Oliver等，Mech.Dev.443-16，1993)均是从组织制备物中解剖出来的，这些细胞必定来源于发育中的交感神经系统(交感神经节)，已经证明Prox-1在该交感神经系统中表达(Wigle等，EMBO J 211505-1513，2002)。
实施例9VEGF-C和交感神经节的分化A.VEGF-C或VEGF-D对神经元扩展的影响为了更详细地分析神经细胞群体，分离并培养来自胚胎外植块的交感神经节。解剖E11野生型(NMRI小鼠)胚胎，使用VEGF-CΔNΔC如上实施VEGF-C珠实验。含有BSA的珠子用作对照。
如下解剖来自VEGF-C敲除小鼠的E11.5胚胎或E11小鼠(NMRI)野生型胚胎从腹膜后区域，解剖尿殖组织和生殖腺、中肾和后肾肾原基(Sainio，2003)。除去小肠、肝原基、心脏和肺原基。保持其腹外侧中背主动脉和交感神经节链的完整。在颈静脉区，也保持主动脉弓和交感神经链的完整。
48小时后，野生型小鼠的交感神经节围绕VEGF-C珠形成一个清楚透明的扩大区域，将其移出并机械解剖。将两个含有VEGF-C珠的NMRI外植块从滤膜移到标准新鲜制备的培养基(D-MEM∶F12(3∶1)，补加B27)中，所述培养基含有EGF(20ng/ml)和FGF(40ng/ml)以支持未分化的神经元的存活和分化。向培养基加入VEGF-C(100ng/ml)，在37℃孵育这些块。72小时和，培养物中有清澈的神经球。然后收集并在含有VEGF-C(100ng/ml)的神经干细胞培养基(上述DMEM/F12)中培养这些神经球，或者在无EGF和FGF的情况下将神经球接种在培养基上，由此允许这些神经元分化。
对于分化试验，48小时培养后用冰冷甲醇固定4个含有VEGF-C珠的NMRI外植块和对照(含有BSA珠)外植块，并进行整装片免疫组织化学处理。或者，为了检测细胞分化，可以分离神经球，并以单细胞形式将其接种在24孔板孔中的聚赖氨酸包被的盖玻片上于补加了100ng/ml神经生长因子(NGF)的无EGF-FGF培养基中4天。使用检测原代神经元(Tuj-1和p75NGF-受体)、上皮结构(泛细胞角蛋白)和分化的神经元(酪氨酸羟化酶(TH)、神经丝抗体)的抗体，验证这些培养物中正是交感神经细胞在增殖并确定VEGF-C对神经分化的影响。
B.VEGF-C或VEGF-D对神经突和轴突向外生长的影响以上实验说明VEGF-C作为神经营养因子起作用。为了确定VEGF-C或VEGF-D产物对成年轴突的增殖或再生的影响，在存在和不存在VEGF-C和VEGF-D产物的情况下在有或无利用其它神经营养因子的培养下实施轴突向外生长试验(axonal outgrowth assays)。
例如，如Sondell等(J.Neurosci.195731-40，1999)所述，从成年大鼠解剖出颈上神经节(SCG)并在MATRIGEL_中封固。每35mm培养皿封固2至3个神经节，在无血清RPMI1640培养基中在5％CO2的潮湿室中维持外植块培养物48小时或72小时。在封固后不同的时间点，包括移植后0时、4时、6时、8时、12时或24时，向培养物中加入VEGF-C产物或VEGF-D产物。VEGF-C或VEGF-D的添加剂量范围从ng/ml至μg/ml，例如，1，10，25，50，100或200ng/ml。使用神经生长因子作为阳性对照，而使用未处理的神经节或用无关蛋白处理的神经节作为阴性对照。
为了测量VEGF-C或VEGF-D产物诱导的轴突生长程度，测量培养中轴突生长的长度和密度。在VEGF-C或VEGF-D处理的神经节中增加的轴突长度和轴突密度说明，VEGF-C或VEGF-D诱导成年轴突生长，并且可能是在要求轴突再生的人类神经病中用于轴突生长的有用治疗剂。
实施其它实验测量用VEGF-C或VEGF-D联合其它神经营养因子或PDGF-A、B、C和/或D生长因子处理轴突外植块的协同效应。
可以进一步在胚胎轴突上评价VEGF-C和VEGF-D的作用。从E10-12大鼠胚胎解剖出三叉神经节，并埋入根据Ebendal(1989)制备的三维胶原基质中。典型地，在24孔组织培养板中，将3-5个神经节培养在0.5ml基质中。用0.5ml含有1％热失活的马血清的Eagle氏基础培养基(GIBCO BRL)覆盖该凝胶。所述胶原凝胶配制在相同培养中。向培养基加入重组VEGF-C或VEGF-D产物，对照培养物中无任何因子，NGF培养物可以充当阳性对照。典型地，以ng/ml或μg/ml浓度，例如1，10，25，50，100或200ng/ml，施加这些神经营养因子。在有或无VEGF-C产物或VEGF-D产物下在含有5％CO2的潮湿空气中37℃孵育外植块培养物，24和48小时后检查神经突的向外生长，以及任选地用抗神经丝抗体染色以更好地观察神经突。
C.VEGF-C或VEGF-D在脊髓损伤模型中的神经营养作用治疗神经创伤或损伤的一个主要要求是损伤部位轴突的再生。为了评价VEGF-C和VEGF-D产物在刺激轴突再生方面的神经营养作用，使用脊髓损伤大鼠模型。例如，根据Facchiano等(J.Neurosurg，97161-68，2002)在成年大鼠脊髓T8水平进行横切，在损伤部位施用悬浮在matrigel中的VEGF-C或VEGF-D产物，其中matrigel允许所示治疗剂缓慢释放。还可以通过其它成熟建立的治疗途径，例如腹膜内、静脉内或眼眶后注射，给动物施用VEGF-C或VEGF-D产物。系统施用是一种选择方案，但是优选在损伤部位的局部施用。以预先确定对所治疗动物的大小和类型有效的剂量施用VEGF-C或VEGF-D产物，并且可以在一次治疗中或经过一个疗程，例如，每2天，每周1次或对所治疗的动物有效的任何其它方案，施用VEGF-C或VEGF-D产物。对照动物无接受治疗或者接受无关蛋白，例如牛血清白蛋白的处理。
为了评价VEGF-C或VEGF-D处理的动物中轴突再生的程度，于处理后不同时间点，例如最初的脊髓横断后第14天、21天或28天，解剖出脊髓，并根据Facchiano等(同上引文)测量轴突生长，其中测量横断位点和新轴突末梢间的距离，从而说明轴突是否响应生长因子而出现生长或者轴突是否不能应答并简单地死亡。
与对照动物相比，VEGF-C或VEGF-D处理的动物中轴突再生的增加说明，VEGF-C或VEGF-D是有效的神经营养因子，并促进对于修复运动神经元损伤至关重要的轴突再生。
为了在上述实验中表征交感或运动神经元中的VEGF-C或VEGF-D受体表达，可以用针对VEGFR-2、VEGFR-3、NRP-1和NRP-2的抗体染色分离的神经元细胞(在VEGF-C或VEGF-D刺激之前和之后)。
实施例10神经元祖先细胞在VEGF-C或VEGF-D存在时的增殖为了定量VEGF-C或VEGF-D产物在交感神经元培养物中的促有丝分裂潜力，实行增殖(MTT)试验。
在饥饿培养基(无血清)中用VEGF-C、VEGF-D、VEGF-CΔC156或VEGF-C或VEGF-D产物的其它形式、VEGF(或其它生长因子)或用对照蛋白刺激在神经元细胞培养基中培养的神经球48小时。37℃细胞与MTT底物，溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑嗡，(5mg/ml)孵育4小时，裂解细胞并测量540nm光密度。
此外，使用溴脱氧尿苷(BrdU)掺入和/或氚化胸苷掺入作为标记指数以及细胞增殖测量结果，测定VEGF-C或VEGF-D产物刺激细胞增殖的能力[Vicario-Abejon等，Neuron 15105-114(1995)]。例如，接种神经元细胞，然后在固定细胞之前在有或无VEGF-C或对照蛋白下用BrdU脉冲一段规定的时间(例如，18个小时)。固定并中和细胞，与BrdU单克隆抗体一起孵育。然后用标记的二抗检测BrdU抗体。为了检测BrdU阳性细胞是否属于特定的神经元亚群，可以将BrdU标记与针对上述神经元特异性标志的染色结合起来。
也可以通过非侵入式方法利用NMR显微镜测量神经元密度，体内测定神经元的增殖(见美国专利号6,245,965)。此外，可以在施用VEGF-C之前、期间和/或之后，向动物模型和对照施用BrdU或氚化胸苷。最后的注射之后，麻醉和/或处死动物，取出目的组织。使用抗BrdU抗体通过BrdU掺入分析这些组织，或者通过测量细胞提取物中的[3H]计数量分析这些组织。
在以上增殖试验中可以使用VEGF-C和VEGF-D多肽的片段和类似物确定可用于介导神经干细胞生长和分化的最小VEGF-C片段。通过描绘能够刺激神经干细胞生长的最小VEGF-C或VEGF-D多肽片段，可以提供足够小以致能够横穿血脑屏障的VEGF-C或VEGF-D多肽。
通过开发能够流过血脑屏障的治疗剂，可以消除侵入式施用VEGF-C或VEGF-D多肽的方法，并导致更温和的治疗形式，例如静脉内或皮下注射。
实施例11神经病治疗中表达VEGF-C或VEGF-D的腺病毒基因治疗载体例如，腺病毒、腺相关病毒和慢病毒载体是有效的、外源施用的、用于诱导体内产生蛋白质的药剂，并且经过设计其可以在体内特定位点提供持久的、稳态蛋白质水平。
为了确定外源VEGF-C或VEGF-D对神经干细胞的体内影响，使用病毒基因治疗载体。例如，如Enholm等，Circ.Res.88623-629(2001)；和Puumalainen等(同时引文)所述，构建含有VEGF-C(AdVEGF-C)或靶向核的LacZ(Ad-LacZ)转基因的腺病毒表达载体。简要地，对于Ad-VEGF-C，将全长人VEGF-C cDNA克隆在pcDNA3载体(Invitrogen)的巨细胞病毒启动子下面。然后，将载体的SV40来源的多腺苷酸化信号换成人生长激素基因的多腺苷酸化信号，并将此转录单位以BamHI片段形式插入pAdBglII载体。按以前的描述(Puumalainen等，Hum.Gene Ther.，91769-1774，1998)，在人胚胎肾293细胞中产生复制缺陷型重组E1-E3缺失腺病毒，并通过超离心浓缩。分析腺病毒制备物中无辅助病毒、脂多糖、和细菌学污染物(Laitinen等，Hum.Gene Ther.91481-1486m 1998)。
可以用于在神经病中评价VEGF-C的啮齿类动物模型包括但不限于帕金森病的N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)小鼠模型(Crocker等，J.Neurosci.234081-91，2003)、甲基苯异丙胺诱导的PD小鼠模型(Brown等，Genome Res.12868-84，2002)、6-OHDA诱导的PD(Bjorklund等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.992344-2349，2002)、转基因Tg2567小鼠阿尔茨海默氏病模型(Quinn等，J Neuroimmunol 13732-41，2003)和PDAPP小鼠AD模型(Hartman等，J.Neurosci.2210083-7，2002)。使用大鼠横断模型(例如，Krassioukov等(Am.J.Physiol.268H2077-H2083，1995)中所述的横断第4胸椎，和脊髓压伤模型(Gorio等，Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.999450-5，20002)，评价VEGF-C在神经创伤中的作用。
以不同浓度(从5×106至5×109噬斑形成单位(pfu))将VEGF-C腺病毒载体(Ad-VEGF-C)或LacZ对照(Laitinen等，同上引文)注射至易感小鼠中。静脉内、腹膜内、皮下、颅内或在神经系统创伤位点局部地施用此腺病毒载体。在阿尔茨海默氏病或帕金森病神经变性样症状发作前施用Ad-VEGF-C。
对于帕金森病，如上述监测处理的和对照的动物的疾病进程，并在疾病发作后不同时间处死动物(疾病发作后第3天、7天、10天、14天或21天)，以便如上述组织学评价神经增殖、VEGF-C表达和神经细胞分化。在另一实施方案中，在病程中不同时间，包括诱导后第0、1、3、7、14和21天或于疾病发作后的时间，施用腺病毒载体，以在神经疾病的进展和改良方面研究VEGF-C的施用。进一步考虑，在疾病症状发作后任何的一天多次施用腺病毒载体，以维持神经病位点VEGF-C蛋白的恒定水平。
一般在动物模型中阿尔茨海默氏病模型需要更长的发展时间。在转基因动物出生后或在实验诱导的疾病模型中诱导疾病后几周至几月，针对AD进程评价VEGF-C施用。VEGF-C处理在AD症状发作前不同时间进行。当对照动物开始显示出疾病迹象时，处死VEGF-C处理的动物，分析脑切片中神经变性和斑块形成的程度。也考虑一直不施与VEGF-C处理直到出现AD的第一临床征兆，然后以预定剂量在不同时间点施用。考虑每天、每周、每两周、或以其它确定对减缓AD进程有效的时间间隔，施用VEGF-C或VEGF-D。
在任何动物模型VEGF-C处理后疾病症状的改善或疾病进程的延迟均指示VEGF-C抑制或逆转神经变性疾病进程的治疗益处。
实施例12施用离体经VEGF-C或VEGF-D处理的神经干细胞离体用VEGF-C产物或VEGF-D处理神经干细胞，诱导细胞增殖。然后将这些细胞植入需要产生神经元和使神经元增殖的个体中。
神经干细胞作为移植材料的用途已经通过神经祖先细胞克隆C17.2[见美国专利公布号2002/0045261；Snyder等，Cell 6833-51，1992；Snyder等，Nature 374367-370，1995；Park，J.Neurotrauma 16675-87，1999；Aboody-Guterman等，NeuroReport 83801-08，1997]作了举例说明。C17.2是来自出生后第0天小脑的小鼠细胞系，该细胞系通过含有禽myc基因的逆转录病毒构建体的感染而无限增殖。该细胞系已经经过转导而组成性表达lacZ和neoR基因。移植至整个脑的胚区的C17.2细胞可以沿着小鼠轴索迁移，停止分裂，和参与多个区域在多个阶段(胎儿至成年)的正常发育，从而按预期地分化成各种神经元细胞和神经胶质细胞类型。已经证明此神经干细胞克隆是用于向CNS转移基因的有效运载体[Snyder等，Nature 374367-70，1995；Lacorraza等，Nature Med 4424-29，1996]。
在一个例子中，用上述VEGF-C珠体外培养神经干细胞，其中所述珠子具有有效地刺激神经干细胞生长和增殖的最佳浓度的可溶性VEGF-C。可以使用本领域常用的技术，例如经过给定时期细胞的增殖速率、形态学的改变、或细胞分化的状态，优化VEGF-C的浓度。一旦优化后，将VEGF-C与神经干细胞一起体外培养此段最佳时间，例如在珠子实验中48小时。
然后，将与VEGF-C一起培养的神经干细胞植入nu/nu小鼠(见美国专利公开号2002/0045261)。按如下实施神经干细胞向大脑内的注射施用有效剂量的麻醉剂，例如腹膜内(i.p.)注射70μl由2份抑菌0.9％NaCl(AbbottLabs，Abbott，Ill.)和20mg/ml xylazine(Rompun，Miles，Kans.)和100mg/mlketamine(KetalarTM，Parke-Davis，N.J.)各一份组成的溶液，麻醉雄性6-8周龄nu/nu裸鼠。将动物放置在立体定位仪(Kopf，Tujunga，Calif.)中，作一个中线皮肤伤口，于前囟点的吻侧2mm和右侧2mm钻一个洞。使用Hamilton注射器，经过至少2分钟，将细胞注射至距离硬脑膜2.5mm深的地方。经2分钟逐渐退回针头，用骨蜡(Ethicon，Somerville，NJ)闭合该洞，用Betadine(Purdue Frederick，Norwalk，Conn.)洗涤伤口。对于第二次注射，重复相同程序。
经过一个时程，例如，在第2天、第4天、第5天、第6天、第7天、第10天、第14天或第21天，处死动物，评价VEGF-C处理的干细胞的迁移。给予动物过量麻醉剂，随后用PBS之后用4％低聚甲醛和2mM MgCl2(pH7.4)实施心脏内灌注。取出脑，4℃后固定过夜，然后转移至PBS和2mMMgCl2(pH7.4)中的30％的蔗糖中3-7天以对样品实施低温保护。-80℃贮存脑，然后使用低温恒温器(Leica CM 3000，Wetzlar，德国)切10-15微米冠状面系列切片。也考虑按本领域常用的方式用标志蛋白例如lacZ转染神经干细胞。用VEGF-C按如上所述在培养中处理这些细胞，或者用无关对照蛋白，例如牛血清白蛋白处理这些细胞，之后将细胞注射入动物体内，随后由于lacZ基因的存在可以基于β-gal染色容易地体内跟踪这些细胞。
染色脑切片以确定VEGF-C处理后的神经干细胞的增殖、迁移和分化程度。与对照组相比VEGF-C处理的群体中神经干细胞体内数量的增加或者神经来源细胞的整体增加，以及对增殖后这些细胞迁移至适当位置的评价结果，说明VEGF-C是神经元生长的有利刺激剂，而且为治疗需要神经元再生的患者提供了有用的治疗方法。经VEGF-C处理的细胞的组织分布的改变指示了VEGF-C对细胞的迁移和分化影响。
上述神经干细胞移植可以用于帕金森病、阿尔茨海默氏病或其它神经变性病动物模型中，以评价VEGF-C或VEGF-D处理的神经干细胞在慢性神经变性病中改善神经病的能力。
例如，将VEGF-C处理的神经干细胞移植入帕金森病(MPTP)小鼠模型(Crocker等，同上引文)。在疾病病程中于不同时间，例如疾病发作前或后，包括诱导疾病后第0、1、3、7、14或21天，施用所述神经干细胞，以研究VEGF-C处理的神经干细胞对神经元疾病的进程和改善的作用。在神经干细胞移植后经过一个时程，例如，第2天、第4天、第5天、第6天、第7天、第10天、第14天或第21天，处死动物，评价VEGF-C处理的神经干细胞的迁移和测量与对照处理小鼠相比脑损伤中改善的程度。在接受经过VEGF-C处理的神经干细胞的PD动物中脑损伤尺寸的减小或运动技能的改善指示，VEGF-C是有力的神经干细胞增殖激活剂，是用于改善神经变性病效果的有用治疗剂。
可以重复这些程序评价本文所述的药剂组合。
实施例13VEGF-C或VEGF-D处理患有神经变性病的患者A.用外源VEGF-C或VEGF-D处理患者用VEGF-C或VEGF-D产物处理表现出神经变性病症状或有持久神经创伤或损伤的患者，以促进神经干细胞或神经祖先细胞再生、分化和迁移。
在表现出神经变性病征兆的患者中，将如前所述VEGF-C或VEGF-D产物直接施用至患者的脑中，例如，通过脑室内或壳核内注射，或者使用导管和输注泵(Olson，L.，Exp.Neurol.1245-15(1993))。以预先确定对患者无毒的治疗有效量施用VEGF-C或VEGF-D。可以在单一一剂中或在多剂中施用VEGF-C或VEGF-D，并且可以在一天或一个由治疗医师确定为最有效的时程内多剂施用。
也考虑，将VEGF-C或VEGF-D产物施用至神经变性病患者或神经创伤或损伤患者的脑脊液(CSF)中。
对于有神经创伤或损伤的患者，还可以通过静脉内或皮下注射系统地施用治疗有效量的VEGF-C/D产物，或者可以在神经损伤或创伤位点局部地施用VEGF-C或VEGF-D。给药方式(即，治疗剂浓度和施用方案)由执行医师确定，并且可以配合所治疗的患者作修改。
B.向神经变性病患者移植VEGF-C或VEGF-D处理的干细胞具有CNS的多能神经干细胞、神经元祖先细胞或神经胶质祖先细胞的特征的细胞(通过体外试验鉴定)，用VEGF-C或VEGF-D产物处理，或者用表达VEGF-C或VEGF-D产物的病毒载体(例如，腺病毒、腺相关病毒或慢病毒载体)感染，将细胞施用给表现出神经病症的哺乳动物以测定这些细胞的疗效。
这些细胞优选从具有相似MHC基因型的哺乳动物分离。一个方法中，分离并培养胚胎干细胞系以诱导向神经细胞方向的分化。这使用如上所述神经元生长因子实现。可以基于对神经元或神经胶质细胞谱系的细胞表面染色，评价细胞的分化状况。随后所述细胞与VEGF-C一起培养，并转移至神经变性病患者体内。
神经干细胞的分离可以如美国专利5,196,315中所述进行。在一个实例中，从可能正在经历针对其神经病理或移除神经元肿瘤的治疗的患者，分离大脑皮层组织。将皮层组织解剖成灰质和白质，灰质立即放入含有D-缬氨酸的极限必需培养基(MDV)(Gibco，Grand Island，N.Y.)和通过在有12,000至14,000道尔顿截断值的管中透析制备的15％透析后的胎牛血清(dFBS)(Gibco)中。然后，将组织细细切碎，并挤压通过150μm网目的金属丝网筛。将细胞悬浮液以每平方厘米大约1×104细胞的密度分配至35-mm培养孔中，并置于37℃的7％CO2潮湿孵育器中。在含有15％dFBS的MDV中维持细胞系，并通过胰蛋白酶消化
传代。用不同浓度的VEGF-C或VEGF-D体外处理细胞，或者用表达VEGF-C或VEGF-D的病毒载体转染细胞。
将培养的细胞注射至脊髓或脑或神经创伤或变性的其它位点。注射一系列浓度的细胞以确定注射入期望位点的最佳浓度，并将细胞显微注射至动物个体的脑和神经元中。
或者，将细胞引入血浆凝块、胶原凝胶或其它缓释系统，从而防止细胞自注射位点的快速消散。随后将缓释系统植入个体的神经病位置或该位置附近。例如，为了治疗帕金森病患者，从来自手术样本或死后捐赠物的胎儿/胚胎或成年脑组织(对该组织进行匀浆并用神经干细胞标志作标记)分离足够用于移植的细胞(假定20％成活力)。然后，使用荧光激活细胞分选(FACS)，分选细胞。收集神经标志阳性细胞并进一步在组织培养中培养并进行处理。然后将细胞植入帕金森患者的纹状体或黑质。监测移植物的成活力和细胞分化。
考虑联合常用的治疗剂使用VEGF-C或VEGF-D疗法以治疗神经变性病。例如，在一个用于治疗帕金森患者的方案中，与VEGF-C治疗联合，或者在施用VEGF-C培养的神经干细胞后，患者接受神经治疗剂，例如普拉克索或左旋多巴(剂量0.5mg，每天3次)。或者，在VEGF-C治疗之前、并行地或之后，或者在移植VEGF-C处理的神经干细胞后，患者接受卡比多巴/左旋多巴，25/100mg，每天3次。如果患者表现出持续的能力丧失，在头10周期间逐步升高剂量。本领域熟知，治疗方案常常由治疗医师进行修改和优化并且是患者特异的。因而，可以进一步改变任何化疗剂的剂量，并可以以能够有效地改善神经变性病的效果的任何组合方式给予。例如，如果使用辅酶Q10作为治疗剂，则可以以300或600或1200mg/天的剂量范围与VEGF-C产物联合给予。
这些技术和方法可以用于治疗神经变性病如阿尔茨海默氏病或帕金森病，或者用于治疗损伤了神经元细胞的创造性损伤，例如中风期间。监测治疗在患者个体的神经学状况上产生的效果。例如，可以通过MRI检测神经元干细胞在体内的增殖。在个体中期望的治疗效果包括受到神经病影响的个体中改善的运动神经元功能和减少的神经元结疤或神经元损伤。
上述任何实施例都可以使用VEGF-D产物代替VEGF-C产物来实施。考虑到VEGF-D产生与VEGF-C相似的神经细胞生长刺激活性，可以以与VEGF-C十分相同的方式施用于患有神经病的个体或者用于刺激体外神经细胞生长以便向表现神经病症状的患者进行移植。此外，可以如上述用于VEGF-C的方式，将表达VEGF-D的病毒载体用作基因治疗法。
实施例14在少突胶质细胞前体细胞中检测到VEGF-C和VEGFR-3除了调节神经元发育外，神经前体细胞还发育成神经胶质，例如星形胶质细胞和少突胶质细胞。VEGF-C对交感神经节的增殖和存活作用暗示，VEGF-C也可能在这些其它神经细胞类型中起作用。
少突胶质细胞祖先细胞(OPC)自E12起在胚胎CNS的受限制的发源点中产生(Spassky等，Glia 29，136-142，2000；Rowitch等，Trends in Neurosci.，25417-422，2002)。OPC亚群的特征在于plp基因的早期表达，该plp基因编码主要蛋白质髓鞘脂，蛋白脂质蛋白(Spassky等，Development2184993-5004，2001)。证据显示，plp+OPC在E41.5开始向胚胎视神经(ON)集群，并表达脑信号蛋白受体神经毡蛋白-1和-2。然而，在此视神经中未检测到神经毡蛋白配体Sema3F的转录物。
为了确定所选配体和受体分子在发育中胚胎的少突胶质细胞前体细胞中的表达，通过免疫标记，评价前脑，尤其是视神经中VEGF-C、VEGF-D、VEGF-A、VEGFR-2、VEGFR-3和神经毡蛋白-2的表达。用抗VEGF-C或VEGFR-3的抗体(R&D Systems)染色E15和E16脑的石蜡切片，或者用抗VEGF-C抗体之后用抗胶质原纤维酸性蛋白Ab(Dako)处理由此进行双标记以鉴定星形细胞。
在神经细胞中于E15鉴定到VEGF-C蛋白的强烈表达，主要定位在视束中，包括视神经、视神经交叉区域和腹侧间脑中的视神经带(optic strip)。在视交叉上域(suprachiasmatic domain)——已知产生向视神经集群的部分少突胶质细胞(Ono等，Neuron 19283-292，1997)，可以在脑室层和下方实质中检测到VEGF-C+细胞。在E16，VEGF-C表达减少并更为局限于视神经的中间区域直到视网膜的乳头，并且表达VEGF-C的细胞是GFAP阴性的。VEGF-C+细胞部进入视网膜。在E18，该表达仍然强烈但是局限于视神经远端部分。在P4，VEGF-C表达变低并弥散。
VEGF-D蛋白质以低水平表达，显示出弥散的染色(E15，E16和P4)。在ON发育的任何阶段，在神经内均未检测到VEGF-A+细胞。在E15和E16，在视神经中检测低水平的VEGFR-3表达，而且该表达局限于该神经的中间区域。
除了视神经外，在视网膜神经节细胞中以及在脑的有效神经元群体，包括嗅球、大脑皮层、海马和视皮层、腹侧下丘脑、后连合及腹侧脑桥中也检测到VEGF-C表达。在人脑中也发现相似的VEGF-C mRNA表达模式。在周围神经系统中，脑神经节和背根神经节的细胞也强烈地表达VEGF-C。与VEGF-C相反，在所检测的任何发育阶段中在视神经中均未检测到VEGF-A和VEGF-D。在视神经附近的动脉的血管壁中观察到VEGF-A表达，在牙乳头中检测到VEGF-D。
为了表征VEGF-C表达细胞的表型，我们使用杂合Vegf-c基因敲入(knock-in)小鼠，在该小鼠中lacZ报道分子置换了一个Vegf-c等位基因(Karkkainen等，Nat Immunol 574-80，2004)。用抗β-gal Ab标记E15.5和E17.5 Vegf-c+/-脑的冰冻切片。β-gal表达的空间时间模式酷似内源VEGF-C的空间时间表达模式，这说明视神经细胞产生VEGF-C。用对放射状神经胶质和星形胶质细胞(抗Glast27)、成熟星形胶质细胞(抗GFAP)、神经元和轴突(TuJ1)、内皮细胞(抗PECAM)或OPC(抗Olig2)具有特异性的标志，双标记切片。进行免疫组织化学分析。
在E15.5，纵向延伸至该神经内的Glast+纤维表达β-gal。相反，在E17.5于该神经的外围中检测到GFAP+星形胶质细胞是β-gal阴性的。在自视网膜神经节细胞延伸的Tuj1+轴突中未观察到β-gal表达，该神经的罕见PECAM+脉管也不表达β-gal。在该神经或腹侧间脑的Olig2+OPC中未检测到β-gal表达。在后一区域中，VEGF-C在下丘脑的腹内侧核中局部表达。总之，这些结果说明，在血管内皮生长因子中，仅VEGF-C由发育中的视神经的放射状神经胶质和星形神经胶质前体细胞产生和合成。
使用针对VEGFR-1、VEGFR-2或VEGFR-3的抗体标记E15.5和E17.5头部系列冰冻切片，分析胚胎视神经中VEGF受体的表达。在所检测的所有发育阶段，在头部间充质内的脉管内皮和神经上皮中检测到VEGFR-1和VEGFR-2表达，而VEGFR-3在头部间充质中由淋巴内皮细胞表达。在E15.5，在视神经中观察到VEGFR-3表达，但无VEGFR-1和VEGFR-2的表达。在E17.5，在视神经中检测到许多VEGFR-3+细胞。为了确立VEGFR-3表达细胞的表型，用抗VEGFR-3和抗Olig2 Ab标记冰冻切片。在视神经中共同定位了VEGFR-3标记的点状链样模式和OPC的Olig2+核染色。除了视神经外，在视前区(在此发育阶段含有密集的OPC群体(Prestoz等，NeuronGlia Biol.173-83，2004)中，以及其它前脑区域如嗅球和杏仁核中也检测到VEGFR-3表达。在这些区域中检测到许多双标记的VEGFR-3+/Olig2+OPC。在来自E17.5的杂合Vegfr-3/lacZ-基因敲入小鼠(Dumont等，Science 282946-9，1998)的脑中对β-gal和Olig2的双染色，也显示出双阳性细胞。
此外，利用目的基因杂合的LacZ报道小鼠，通过在成年中枢神经系统(CNS)中免疫染色VEGFR-2和VEGFR-3，还评价了成年脑中VEGF-C受体的表达。这些实验显示，在大脑的清楚确定区域，包括缰内侧核(medicalhabenular nuclei)、丘脑的前核和中央旁核，以及穹窿下器(subfornical organ)中，检测到VEGFR-3表达。VEGFR-2由脑血管以及室管膜细胞层表达。
这些观察结果说明，在视神经和成年CNS中辅助神经胶质细胞群体选择性地表达VEGF-C以及其高亲和受体VEGFR-3。该神经所固有的放射状神经胶质和/或未成熟的星形胶质细胞表达VEGF-C，而来源于脑并向该神经集群的OPC表达VEGFR-3。这些结果提示，来自视神经的放射状神经胶质细胞(radial glial)/星形胶质前体细胞衍生的VEGF-C可能对表达其受体VEGFR-3的OPC产生作用。
实施例15VEGF-C诱导少突胶质细胞增殖为了确定VEGF-C对少突胶质细胞前体细胞的增殖作用，用生长因子培养分散的E16视神经的细胞培养物，并测量存活和增殖效应。
从E16.5野生型或神经毡蛋白-2-/-lacZ基因敲入(NPN2ki)小鼠分离视神经。使细胞分散并在对照培养基(含有50％的未转染的COS细胞的上清液)中培养或在存在50％的分泌Sema3F、VEGF-C或VEGF165的COS细胞的上清液下培养。体外第1天(1DIV)，掺入BrdU 48小时。在3DIV，在4％低聚甲醛中固体培养物，然后用抗A2B5少突胶质细胞Ab和抗BrdU染色。计数A2B5+细胞和A2B5+/BrdU+细胞的数量。VEGF-C诱导了超过对照细胞2倍的BrdU掺入，而VEGF165处理的细胞的增殖与对照细胞类似。Sema3F也显示出对OPC的营养作用。VEGF-C和Sema3F的联合未显著地增加OPC的增殖。该结果提示，两种配体使用相同的受体，可能为神经毡蛋白-2，以诱导它们对OPC的营养作用。Sema3F的作用在OPC表面上缺少神经毡蛋白-2表达时消失。
VEGF-C存在时，少突胶质细胞前体细胞与其它神经细胞类型相比表现出存活增加。
实施例16鉴定促进少突胶质细胞生长的VEGF-C分泌细胞不仅在视神经和视神经交叉中而且在脑的大部分Olig2+少突胶质细胞前体细胞中，VEGFR-3看来似乎特异地由少突胶质细胞祖先表达。为了确定VEGFR-3表达在OPC中的作用，有用的是鉴定通过VEGFR-3或神经毡蛋白受体刺激OPC生长的VEGF-C分泌细胞的表型。
使用表达plp-GFP构建体的小鼠评价CNS中的VEGF-C表达(Jiang等，JNeurobiol.447-19，2000)。当绿色荧光蛋白(GFP)构建体与含有PLP启动子的PLP表达构建体连接后，GFP特异地在来自原代混合的神经胶质培养物的少突胶质细胞中表达。从plp-GFP+和plp-GFP阴性细胞分离E16.5视神经和腹侧间脑的细胞，分离每种细胞类型的mRNA以评价VEGF-C转录物的存在。此外，如以前描述的固定这些分离的细胞，并用针对VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3、GFAP和nkx2.1(一种由内源视神经细胞于E12.5开始表达的转录因子)和上述其它神经细胞标志的抗体免疫标记以检测VEGF-C蛋白。
VEGF-C在神经细胞中的表达也通过分析VEGF-C“基因敲入”小鼠中的lacZ标记进行评价，在所述小鼠中VEGF-C通过与角蛋白K14启动子(Veikkola等，EMBO J.201223-1231，2001)连接而过表达，该小鼠也被设计表达lacZ基因。在E15.5-16.5进行WT、+/-和-/-视神经的整装片X-Gal和Blue-O-Gal染色。对于视神经的整装片染色，通过在每只眼的壶腹帽(cupula)的刚好后面切断神经并移出脑和附着的视神经，从胚胎分离脑。一旦分离了脑，除去脑膜，尤其是腹侧间脑和视神经周围的脑膜。在4％PFA中固定神经1小时，将其切成300微米厚的切片，注意至少其中一个切片包括视神经交叉和两个视神经。洗涤这些组织切片，浸泡在X-Gal或BOG中以显示染色和VEGF-C的表达。
由于少突胶质细胞自E14.5开始进入视神经，预期如果少突胶质细胞分泌VEGF-C则在该发育阶段在WT和无效突变体之间X-Gal染色将发生改变。WT和突变细胞之间在X-Gal方面缺少任何变化，说明VEGF-C不由少突胶质细胞分泌而由内源神经细胞分泌。
使用如上和本领域中描述的外植块(explant)和细胞染色实验(Wang等，JNeurosci.144446-57，1994；Bansal等，Dev Neurosci.2583-95，2003)，实现所述的VEGF-C和VEGF-D对少突胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞的迁移和分化的影响。此外，有用的是分析VEGF-CK14或VEGFR-3K14转基因动物中的少突胶质细胞增殖和迁移，以确定VEGF-C/VEGFR-3信号转导对少突胶质细胞功能的影响。
实施例17A
VEGF-C特异地促进少突胶质细胞前体细胞而非神经胶质细胞的增殖和存活为了分析VEGF-C/VEGFR-3信号转导在OPC中的生物学意义，体外检查OPC对VEGF-C的增殖反应。从E16.5视神经获得分散的细胞，在BrdU和递增浓度的重组大鼠VEGF-C(10-150ng/ml)存在下培养24小时和48小时。这些培养物由星形胶质细胞前体和OPC组成(Shi等，J.Neurosci.184627-36，1998；Small等，Nature 328155-7，1987；Mi等，J Neurosci 191049-61，1999)。OPC通过用A2B5 mAb染色来鉴定(Shi等，同上引文；Eisenbarth等，Proc Natl Acad Sci USA 764913-7，1979；Raff等，J Neurosci 31289-1300，1983)；以培养物中BrdU+/A2B5+双极细胞的百分数定量OPC的增殖。
对于免疫组织化学分析，在0.1M硼酸盐缓冲液中微波处理冰冻切片6分钟。所有一抗和二抗(Ab)分别于4℃孵育过夜和于室温孵育2小时。使用200ng/ml的山羊抗VEGF-A、-C、-D、-R1、-R2和-R3 Ab(R&D Systems)。用Tyramide信号放大试剂盒(TBS Biotin Systems，Perkin Elmer，Life Sciences)扩增反应。在Vegf-c/lacZ和Vegfr-3/lacZ基因敲入小鼠中，用山羊抗β-半乳糖苷酶Ab(Biotrend(1∶500)，之后用抗山羊生物素化的Ab(Amersham)(1∶200)和链霉亲和素-Alexafluor-594(Molecular Probes)(1∶2000)，检测lacZ+细胞。用豚鼠多克隆Ab抗-Glast(Shibata等，J Neurosci179212-9，1997)和抗豚鼠Ab缀合的Alexafluor-488(Molecular Probes)(两者均1∶1000稀释)标记放射状神经胶质前体细胞/星形胶质前体细胞。用兔多克隆Ab抗胶质原纤维酸性蛋白(抗GFAP，Dako)(1∶200)和抗兔Ab缀合的Alexafluor-488(Molecular Probes)(1∶1000)检测成熟星形细胞。用1∶500稀释的小鼠单克隆Ab TuJ1(IgG2a；Virginia大学的A.Frankfurter惠赠)和1∶400稀释的cy3-缀合的抗小鼠IgG2a(Jackson)鉴定神经元和轴突。使用小鼠单克隆A2B5 Ab(IgM；美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)，或者兔多克隆抗Olig2 Ab(Sun等，J Neurosci 239547-56，2003)或小鼠单克隆O4 Ab(IgM)(Sommer等，DevBiol 83311-27，1981)检测OPC。抗Olig2 Ab被1∶800稀释，而A2B5和O4Ab被1∶10稀释。用1∶50稀释的单克隆大鼠抗小鼠Ki-67 Ab(Dakocytomation，Denmark)标记增殖的细胞。通过切片和5mM Hoechst 33258(Sigma，St-Louis，MO)一起孵育，观察细胞核。
37℃用极限培养基(MM)或BS(补加1％胎牛血清和9.3μg/ml胰岛素的MM)，在多聚-L-赖氨酸包被的96孔板中培养来自E16.5视神经(OF1小鼠)的离散细胞(2.5×104个细胞/孔)。对于增殖试验，在含有BrdU(1∶1000)和不同浓度的大鼠重组VEGF-C(10-150ng/ml，Reliatech)、人VEGF-C156S(100ng/ml；R&D Systems)或VEGF-A(100ng/ml；R&D Systems)的BS中培养离散的E16.5视神经48小时。对于VEGFR-3阻断实验，细胞与VEGFR-3-Fc(6μg/ml；R&D Systems)预孵育，然后与BrdU、VEGFR-3-Fc和VEGF-C一起培养。
仅在用BrdU处理48小时的培养物中观察到分裂的细胞，说明视神经细胞在该发育阶段有相当长的细胞周期。VEGF-C的存在诱导了OPC的剂量依赖性有丝分裂反应，在150ng/ml VEGF-C存在时BrdU+/A2B5+细胞的数量加倍。相反地，VEGF-A不诱导统计学显著的OPC增殖。VEGF-A和VEGF-C均与VEGFR-2结合，但仅VEGF-C结合VEGFR-3。响应VEGF-C出现的选择性增殖提示，该信号转导由VEGFR-3介导。在用VEGF-C处理前用可溶性VEGFR-3-Fc预先孵育培养物，阻断了VEGF-C对OPC的增殖作用，细胞增殖仅比对照水平稍高。而且，人VEGF-C的重组突变形式(VEGF-C156S)不结合VEGFR-2(Joukov等，J.Biol.Chem 2736599-602，1998)，其也显著地增加OPC增殖，显示出超过对照细胞大约50％的增加，证实VEGF-C的增殖作用通过VEGFR-3的活化来介导。
为了检查放射状神经胶质前体细胞/星形胶质前体细胞(radialglial/astroglial precursor cells)和星形胶质细胞是否可以在VEGF-C存在下被诱导而增殖，使用抗Glast标记放射状神经胶质前体细胞/星形胶质前体细胞并用抗GFAP标记成熟星形胶质细胞，重复了这些增殖试验。VEGF-C不诱导Glast+前体细胞和GFAP+星形胶质细胞的增殖增加，神经胶质细胞的增殖大约与对照细胞相同。这些数据提示，VEGF-C对OPC但不对星形胶质细胞具有促有丝分裂作用，该作用似乎由VEGFR-3介导。
OPC的存活直接依赖于VEGF-CVEGF-C对OPC的营养作用进一步通过检测其促进细胞存活的能力进行了探究。
对于存活试验，在极限培养基(MM)或BS中在存在大鼠重组VEGF-A(100ng/ml)、大鼠VEGF-C(100ng/ml)、PDGF-A(10ng/ml；Pepro Tech.Inc.，Rocky Hill，NJ)或bFGF(20ng/ml；Roche)、大鼠VEGF-C(100ng/ml)+VEGFR-3-Fc(6μg/ml)、VEGF-C156S(100ng/ml)下，培养E16.5离散的视神经20小时，104个细胞/孔。将无细胞核浓缩和断裂的Hoechst+细胞鉴定为存活细胞。对于每孔，计数存活的Hoechst+和Hoechst+A2B5+细胞的总数，用Student t检验比较数据。
离散E16.5视神经细胞，并在单独的或补加了VEGF-C或其它生长因子的极限培养基(MM)存在下低密度(104细胞/孔)培养。20小时的培养后，通过计数A2B5+细胞的数量，定量OPC的存活。在此短培养期中，OPC不复制，存活的OCP的数量反映培养基中的存活性质。比较对VEGF-A(100ng/ml)和VEGF-C(100ng/ml)产生的增殖应答，结果显示VEGF-A对OPC不具有存活作用，而VEGF-C诱导存活的OPC的数量增加5倍(对照37±7A2B5+细胞/孔；VEGF-C183±38 A2B5+细胞/孔)。然后，将VEGF-C的存活作用与其它已知促进神经胶质细胞存活的因子例如胰岛素(9.3μg/ml)、bFGF(20ng/ml)或PDGF-A(10ng/ml)(其是表达PDGFR-α的OPC的营养因子(Barres等，Cell 7031-46，1992；Richardson等，Cell 53309-19，1988)进行比较。与VEGF-C不同，胰岛素、bFGF、PDGF-A均不能提高A2B5+OPC在该发育阶段的存活。总之，这些数据说明，VEGF-C对PDGF-A非依赖性的OPC具有特异的促生存作用。
VEGF-C诱导OPC迁移由于视神经是自腹侧间脑吸引OPC的分泌因子的来源，故检查VEGF-C是否能够作为视神经交叉OPC的化学引诱物。
使用多聚-L-赖氨酸包被的Transwell Permeable支持物(Corning)，实施趋化性试验。从E18.5 OF1(Iffa-Credo，法国)分离视神经交叉区域，并将离散的视神经交叉细胞(7.5×104)加入transwell室的上方孔，细胞在含有N2补充物(Gibco)的DMEM(Gibco)和F12培养基(Promocell)的50/50混合物中。向下方孔加入补加了VEGF-C(10，50或100ng/ml，Reliatech)或VEGF-C156S(100ng/ml；R&D Systems)的相同培养基。37℃温育16小时后，在PBS中的4％低聚甲醛(PFA)中固定膜15分钟，滤膜底面上的OPC用抗Olig2和抗O4免疫标记。为了定量OPC/mm2的数量，每孔拍摄(×20物镜)10-14个视野，使用Metamorph软件(University Imaging Corporation，US，6.1.r4版本)分析。使用Mann-Whitney试验比较6个独立实验的数据。
将来源于E18.5视神经交叉区域的OPC用于显微趋化室试验(microchemotaxis chamber assays)，其中在下方孔中存在单独的对照培养基或补加了递增浓度的VEGF-C(10-100ng/ml)的培养基。用抗Olig2抗体染色后定量迁移的OPC，并通过用O4抗体(OPC的一个标志，Sommer等，Dev Biol83311-27，1981)双染色，验证Olig2+细胞的少突胶质表型。大多数的Olig2+细胞是O4+OPC(Olig2+O4+/Olig2+92±6)。与对照相比，50ng/ml和100ng/mlVEGF-C显著地增加了通过滤膜的迁移的Olig2+细胞的数量，显示出迁移细胞增加2倍以上。较低VEGF-C浓度(10ng/ml)对OPC的迁移无显著作用。将VEGF-C加入上方和下方室两室都显示出对OPC迁移的显著刺激(大约2倍)，提示VEGF-C对视神经交叉OPC具有化学动力学作用(chemokinetic role)而非化学吸引作用(chemoattractive effect)。在用VEGF-C156S处理的细胞中观察到OPC迁移的增加，但是其比VEGF-C诱导较少的迁移，说明VEGFR-3介导VEGF-C的此刺激作用。因此，视神经分泌的VEGF-C可能募集视神经交叉OPC进入该神经并移生该神经(colonize the nerve)。
实施例17B在VEGF-C缺陷小鼠的胚胎和新生视神经中OPC严重耗竭VEGF-C影响视神经的胚胎发育。Vegf-c-/-小鼠展示出淋巴脉管系统发育不全和组织水肿，导致纯合动物在E18.5之前死亡(Karkkainen等，NatImmunol 574-80，2004)。基于上述体外发现，在VEGF-C缺陷小鼠中评价VEGF-C调节少突胶质细胞发育的能力。为了确定VEGF-C对胚胎发育的影响，检查了处于胚胎期E15.5和E17.5的vegf-c+/-和vegf-c-/-突变体的视神经。
在E15.5，检查了视网膜神经节细胞(RGC)和视神经的固有细胞群(基本上由放射状神经胶质前体细胞/星形胶质前体细胞组成)。在视网膜中，表达VEGF-C的β-gal+RGC正常存在于+/-和-/-胚胎中。使用TuJl mAb标记轴突，观察到RGC轴突的数量和成束现象在野生型(WT)和Vegf-c-/-动物之间是相似的。通过在系列切片上计数Hoechst+细胞核评价的视神经总数在WT和Vegf-c-/-(+/+2317；-/-1821，各组n＝1只动物)中是相似的。因此，在E15.5，在缺乏Vegf-c时，视神经的放射状神经胶质前体细胞/星形胶质前体细胞和RGC的神经元群体似乎均未受到影响。
此外，分析E17.5的vegf-c突变体的少突胶质表型。在WT、Vegf-c+/-和Vegf-c-/-胚胎的视神经交叉和视神经的水平冰冻切片上定量Olig2+OPC数量。在杂合和纯合Vegf-c胚胎的视神经交叉中，与对照相比Olig2+细胞数量减少50％以上(+/+912±55，+/-275±39；-/-398±175，各组n＝2只动物)。在Vegf-c+/-和-/-动物的视神经中，观察到与对照相比Olig2+细胞损失大约85％(+/+576±63，+/-83±35；-/-112±37，各组n＝3只动物)。因此，在E17.5，杂合和纯合Vegf-c突变体的视神经中OPC群体均被严重地耗竭。
到E18.5时Vegf-c-/-胚胎的致死性使得不可能分析其少突胶质表型的演化。相反地，Vegf-c+/-小鼠存活至出生后，尽管有皮肤淋巴发育不全和淋巴水肿。在P1，与WT同窝出生仔相比，Vegf-c+/-的视神经中Olig2+OPC的数量仍然减少50％，相当于每神经损失大约1000个OPC(+/+2030±30，+/-1038±144，n＝1)。通过计数每神经的Hoechs+细胞核总数，显示出细胞数量的相应减少(+/+10648±264，+/-9286±198)，说明OPC的选择性耗竭。在E17.5和P1之间比较Vegf-c+/-小鼠，显示OPC群体在P1部分恢复。
为了确定此部分回复是否由P1时细胞增殖的增加所致，用Ki-67和抗Olig2抗体标记已经进入此细胞周期的细胞。视神经中Ki-67+分裂细胞的数量(Vegf-c+/+72±7个细胞/神经，Vegf-c+/-61±17个细胞/神经，n＝2)以及增殖的OPC的百分数(Ki-67+Olig2+/Olig2+细胞Vegf-c+/+8.44±1，Vegf-c+/-7.7±0.8)在WT和Vegf-c+/-小鼠之间无显著区别。因此，Vegf-c+/-幼崽中由OPC引起的视神经的部分群体恢复不是由该神经中已经存在的OPC的增殖所致，而更可能是由于新一波的来自腹侧间脑的OPC的移生(colonization)所致。
VEGF-C在CNS中的作用以前从未有过报道，这些结果说明VEGF-C引发该神经的移生和先驱(pioneer)OPC的扩充。VEGF-C/VEGFR-3信号转导系统由此似乎是少突胶质细胞发育所必需的。这些结果暗示VEGF-C在少突胶质细胞病理，例如多发性硬化中的作用，在这些疾病中VEGF-C和VEGFR-3可能是恢复少突胶质细胞的潜在治疗靶标。
实施例17C
VEGF-C和PDGF在少突胶质细胞前体细胞生长中的作用在PDGF-A缺陷动物中对少突胶质发生的先前研究(Fruttiger等，Development 126457-67，1999)指出，尽管在PDGF-A缺陷动物中少突胶质细胞已经从脊髓和视神经中消失，但是它们在脑干中仍正常发育并且仍然存在于皮层中。这说明，存在其它的生长因子刺激少突胶质细胞生长、存活和分化。
为了研究PDGF和VEGF-C在少突胶质细胞发育中的作用，通过plp-GFP转基因小鼠(Spassky等，Development，1284993-5004，2001)和杂合vegf-c缺陷动物(Karkkainen等，同上引文)杂交，制备plp-GFP×vegf-c+/-小鼠。使用针对Olig2+细胞的免疫染色，自E9.5开始进入成年阶段，按上述检查plp细胞的体内发育。
预期plp细胞的发育将在VEGF-C不存在时受损，至少在PLP、VEGF-C和VEGFR-3表达的区域，例如视神经和嗅球中将如此。此外，使用plp-GFP×vegf-c+/-系确定VEGF-C在OPC发育的哪一步起作用。在发育早期(E9.5-14.5)脑室层中plp细胞的不足和不存在说明，VEGF-C是plp细胞特化所必需的。在胚胎发育后期观察到的plp细胞群体的异常提示，VEGF-C对plp前体细胞的存活、增殖或迁移起作用。而且，出生后小鼠中的可检测表型说明，VEGF-C影响plp少突胶质细胞的分化和髓鞘脂成熟。
为了进一步研究PDGF和VEGF-C对少突胶质细胞发育的双重作用，通过杂合pdgf-a敲除小鼠(Bostrom等，Cell，85863-73，1996)和杂合vegf-c缺陷小鼠(Kakkainen等，同上引文)的杂交，产生pdgf-a+/-×vegf-c+/-小鼠。在E12.5天开始检查少突胶质细胞的发育。
预期pdgf-a+/-×vegf-c+/-动物将比仅仅pdgf-a缺陷的动物显示出更严重的少突胶质表型。此观察结果可以证实不同少突胶质细胞谱系的存在和说明少突胶质发育的区域特异性。pdgf-a+/-×vegf-c+/-双敲除动物中OPC的存在说明，存在不对PDGF-A或VEGF-C产生应答的其它OPC来源。
实施例18在脱髓鞘疾病动物模型中进行VEGF-C或VEGF-D处理少突胶质细胞是蛋白脂质性蛋白质和髓鞘碱性蛋白(MBP)——髓鞘的首要组分——的主要生产者。髓鞘在中枢和周围神经系统中造成神经的绝缘(insultation)并辅助神经信号传导。以中枢或周围神经的脱髓鞘为特征的疾病或病症导致神经学功能和神经信号传递受损。
可以使用脱髓鞘疾病的动物模型研究治疗人类脱髓鞘疾病的潜在治疗剂和治疗方案。例如，使用啮齿类动物脊髓损伤模型(Bambakidis等，J.Neurosurg.9970-5，2003)，研究体内VEGF-C对脱髓鞘的影响。此外，存在许多脱髓鞘疾病的动物模型，包括用于Guilane-Barre综合症(Zou等，J.Neuroimmunol.98168-75，1999)、多发性硬化(Begolka等，J Immunol.1614437-46，1998)、急性炎性脱髓鞘性多发性神经病(Jander等，J Neuroimmunol.114253-8，2001)、遗传性周围神经病(Schmid等，J.Neurosci.20729-35，2000)和化学诱导的脱髓鞘的模型(Matsushima等Brain Pathol.11107-16，2001)。人类脱髓鞘疾病，如Pelizaeus-Merzbacher(PM)病(Boulloche等，JChild Neurol.1233-9，1986)，也有动物模型，例如啮齿类动物中突变的plp(蛋白脂质蛋白)基因，包括Jimpy(jp)小鼠(Gencic等，J Neurosci.10117-24，1990)或髓鞘脂缺陷大鼠(Boison等，EMBO J.83295-302，1989)。所有这些均并入此处作为参考。
具有显著临床重要性的一种脱髓鞘疾病是自身免疫病多发性硬化(MS)。MS患者表现出受损的运动神经元功能，在疾病晚期显示出受损的精神功能(mental function)。MS患者在病理学上表现出称作斑块的神经脱髓鞘区域。存在MS的几种实验动物模型，例如，在小鼠(Begolka等，J Immunol.1614437-46，1998；Liblau等，Trends Neurosci.3134-5，2001)或大鼠(Penkowa等，J Neurosci Res.2003 72574-86，2003)中的实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)。患有EAE的动物表现为以受损的运动能力为特征的复发-缓解型脱髓鞘病形式，可以用于体内研究VEGF-C或VEGF-D处理对少突胶质细胞损伤的进程和神经轴突脱髓鞘的影响。
为了检查VEGF-C和VEGFR-3在MS样斑中的表达，在一个实例中，用抗原性蛋白脂质蛋白(proteolipid protein)在佐剂中或用髓鞘脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)在佐剂中(Begolka等，同上引文；Liblau等，同上引文)免疫SJL/J小鼠，允许小鼠出现复发-缓解型脱髓鞘病。在不同时间点，例如，疾病症状(尾软弱无力和行走能力受损)发作之前或之后第5天、第7天、第10天、第12天、第14天、第16天、第18天或第21天，用预先确定可以有效地诱导少突胶质细胞增殖和损伤轴突重新形成髓鞘的VEGF-C或VEGF-D量，处理动物。经历该病程后处死动物，如Dal Canto等(Mult Scler.195-103，1995)所述，评价脑和脊髓的轴突脱髓鞘和重新形成髓鞘的程度。
此外，VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3、VEGFR-2、NRP-1或NRP-2在少突胶质细胞中的表达通过用上述相应抗体免疫染色脑和脊髓组织，以及通过使用针对VEGF-C/-D受体的反义核酸探针原位杂交，进行评价。
在VEGF-C或VEGF-D处理的复发-缓解型脱髓鞘病动物中受损轴突重新髓鞘化的增加说明，VEGF-C诱导少突胶质细胞增殖以及随后的髓鞘脂增加，或者诱导已经存在的少突胶质细胞上调表达髓鞘脂产物。此外，在用VEGF-C或VEGF-D处理的患病小鼠中临床症状严重性的降低也说明，VEGF-C/-D处理是MS实验室模型中降低脱髓鞘的严重性的有效疗法，并可能有效地用于人类MS患者。
此外，可以使用多发性硬化的动物模型评价移植的神经干细胞改善疾病症状的效力(Pluchio等，Nature 422688-94，2003；Totoiu等，Exp.Neurol.187254-65，2004)。来自动物或者衍生自上述神经干细胞克隆的神经干细胞首先用可检测标志进行标记，例如，通过用LacZ基因或绿色荧光蛋白转染进行标记，之后体外与单独的或与其它上述神经生长因子联合的VEGF-C一起培养，以刺激神经干细胞增殖。培养后，通过静脉内、脑室内或其它适当途径，在EAE疾病诱导(Pluchino等，同上引文)之前、并行地或之后的不同时间，将细胞施用至EAE患病动物或对照动物体内。然后通过免疫标记跟踪移植的细胞，以确定迁移模式和增殖状况。
还考虑，在移植神经干细胞后，将VEGF-C组合物施用给接受了离体刺激的细胞的小鼠以继续促进神经干细胞增殖。进一步地，可以用VEGF-C基因转染少突胶质细胞前体细胞(见Magy等，Ex.Neurol.184912-22，2003)，然后将细胞植入患有脱髓鞘疾病的动物体内。
在接受了VEGF-C/D刺激的细胞和/或接受了补充的VEGF-C/D处理的动物中，脊髓中髓鞘重新形成的增加，或者通过Ki-67染色检测到的少突胶质细胞前体增殖的增加，说明VEGF-C和/或VEGF-D是刺激少突胶质细胞前体的有效刺激物，并且其在患有脱髓鞘介导的疾病或病症的个体中提供了有用的治疗方法。
可以使用本文所述的联合疗法重复这些程序。
实施例19用VEGF-C或VEGF-D产物治疗人类脱髓鞘疾病类似于实施例12和13中描述的用于神经病治疗的方案，用于VEGF-C和VEGF-D治疗人类患者，或者向人类患者施用少突胶质细胞前体细胞，以改善由脱髓鞘疾病导致的状况。中枢神经系统的炎性脱髓鞘性疾病包括多发性硬化和脑白质营养不良。此外，由中枢神经系统中一定程度的脱髓鞘所致的疾病或病症包括苯丙酮酸尿症、脑室周围白质软化(PVL)、HIV-1脑炎(HIVE)、格林-巴利综合征(Guillian-Barre′syndrome，GBS)、急性炎性脱髓鞘性多发性神经病(AIDP)、急性运动性轴索型神经病(AMAN)、急性运动感觉性轴索型神经病(AMSAN)、Fisher综合症、急性全自主神经病变(pandysautonomia)和Krabbe氏病。基于VEGF-C和-D在周围神经系统中的高表达，也可以在周围脱髓鞘疾病的治疗中测试VEGF-C或VEGF-D产物，其中所述周围脱髓鞘疾病包括慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)，包括MADSAM(多病灶获得性脱髓鞘感觉运动性神经病，也称作Lewis-Sumner综合症)和DADS(远端获得性脱髓鞘对称性神经病)。
例如，可以将VEGF-C或VEGF-D产物的施用与多种治疗联合以改善多发性硬化患者的症状。目前用于MS的许多疗法包括免疫调节性治疗，例如干扰素β1-a(Avonex_)、干扰素β1-b(Betaseron_)、Glatiramer acetate(Copaxone_)、干扰素β-1a(Rebif_)、Natalizumab(Antegren)——一种抗α4整联蛋白的抗体、daclizumab——一种抗CD25分子的抗体、或者抗肿瘤药物米托蒽醌(Novantrone_)(在非常具有攻击性的情况下)。此外考虑，本发明也包括将VEGF-C或VEGF-D产物与旨在缓解炎症的药物，包括非类固醇抗炎药(NSAID)，镇痛药、糖皮质激素、缓和疾病的抗风湿药(DMARD)或生物学反应调节物联合施用的制剂。
将任一种上述免疫调节性治疗以推荐剂量施用给MS患者，例如，Rebif以44mcg的剂量每周3次施用，并且给予患者治疗剂量的VEGF-C或VEGF-D产物。每种产物的剂量可以针对联合疗法进行优化，例如，由于VEGF-C/D治疗的加入，可以减少MS治疗的量。然后评价患者疾病症状的变化，例如伤残进展的危险性的减少、疾病严重性的恶化更弱、脑中活动性损伤的数量和尺寸的减小(在MRI中显示)、以及第二次病势加重在时间上的任何延迟。考虑将VEGF-C和VEGF-D产物与上述治疗剂放在相同的组合物中给药和/或使用与上述治疗剂相同的方法给药，例如，肌内注射Avonex_，而皮下注射Betaseron_、Glatiramer_和Rebif_。或者，以不同的治疗性组合物通过静脉注射给予VEGF-C/D产物。
此外，在表现由于中枢神经系统中脱髓鞘所致的病症迹象的患者中，可以将VEGF-C或VEGF-D产物直接施用至患者脑或脊髓中，例如通过脑室内或壳核内注射，或者通过使用导管和输注泵(Olson，L. Exp.Neurol.1245-15(1993))。VEGF-C或VEGF-D以预先确定对患者无毒的治疗有效量施用。可以在单一一剂中或在多剂中施用VEGF-C或VEGF-D，并且可以在一天或一个由治疗医师确定为最有效的时程内多剂施用。也考虑，将VEGF-C或VEGF-D产物施用至患有由中枢神经系统脱髓鞘所致的病症的患者的脑脊液(CSF)中。
还考虑向患有因脱髓鞘所致的病症的患者移植经VEGF-C或VEGF-D处理的干细胞或经处理的少突胶质细胞前体细胞。
具有CNS的多能神经干细胞、神经元祖先细胞或少突胶质细胞/神经胶质细胞祖先细胞的特征的细胞(通过体外试验鉴定)，用VEGF-C或VEGF-D产物处理，或者用表达VEGF-C或VEGF-D产物的病毒载体(例如，腺病毒、腺相关病毒或慢病毒载体)感染，将细胞施用给表现出神经病症的哺乳动物以测定这些细胞的疗效。
这些细胞优选从具有相似MHC基因型的哺乳动物分离。一个方法中，分离并培养胚胎干细胞系以诱导向少突胶质细胞方向的分化。这使用如上所述的少突胶质细胞生长因子实现。可以基于对少突胶质细胞或神经胶质细胞谱系的细胞表面染色，评价细胞的分化状况。随后细胞与VEGF-C一起培养，并转移至患有因中枢神经系统脱髓鞘所致的疾病或病症的患者体内。评价接受少突胶质细胞移植的个体的疾病症状改善，例如使用MRI扫描技术评价损伤大小/髓鞘形成，或者测试患者的运动性和强度，ExpandedDisability Status Scale(EDSS)(O’Connor等，Neurology 622038-43，2004)。
由于作为MS治疗剂的生长因子，例如FGF-2、PDGF-A、IGF-2常常具有生血管性质(angiogenic)和/或致癌性，因此，使用这些生长因子的尝试通常都不成功，考虑到VEGF-C具有生淋巴管性质(lymphangiogenic)以及CNS中几乎没有至完全没有淋巴，这提示当用VEGF-C产物治疗时可能最小化有害的生脉管副作用，这使得该因子(包括VEGF-CΔC156)成为神经病治疗的治疗剂开发中的良好候选者。此外，研究提示，VEGFR-3阳性和PDGFR-α阳性OPC是两个不同的细胞群体。因此，通过使用VEGF-C/D和PDGF-A，可以在治疗脱髓鞘疾病患者时获得更宽疗效。
尤其可以考虑，使用通过筛选肽文库或化学化合物文库鉴定的小有机或无机分子代替神经毡蛋白或VEGF-C和VEGF-D多肽来实施这些实施例。鉴定为神经毡蛋白/VEGF-C、VEGFR-3/VEGF-C、VEGF-D/VEGFR-3和/或神经毡蛋白/VEGFR-3相互作用的调节剂的小分子和化学化合物将可以以治疗组合物形式用于治疗需要神经元细胞生长和再生的情况，以及用于制备药物从而治疗以VEGF-C或VEGF-D活性介导的神经元细胞或少突胶质细胞前体细胞生长、迁移或增殖的异常为特征的疾病。
之前描述和举例说明了本发明，但不旨在限制由后随权利要求定义的本发明。
序列表<110>路德维格癌症研究院(Alitalo et al)<120>VEGF-C或VEGF-D物质及刺激神经干细胞的方法<130>28967/39670A<160>38<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>2772<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(2772)<400>1atg gag agg ggg ctg ccg ctc ctc tgc gcc gtg ctc gcc ctc gtc ctc48Met Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Cys Ala Val Leu Ala Leu Val Leu1 5 10 15gcc ccg gcc ggc gct ttt cgc aac gat gaa tgt ggc gat act ata aaa96Ala Pro Ala Gly Ala Phe Arg Asn Asp Glu Cys Gly Asp Thr Ile Lys20 25 30att gaa agc ccc ggg tac ctt aca tct cct ggt tat cct cat tct tat144Ile Glu Ser Pro Gly Tyr Leu Thr Ser Pro Gly Tyr Pro His Ser Tyr35 40 45cac cca agt gaa aaa tgc gaa tgg ctg att cag gct ccg gac cca tac192His Pro Ser Glu Lys Cys Glu Trp Leu Ile Gln Ala Pro Asp Pro Tyr50 55 60cag aga att atg atc aac ttc aac cct cac ttc gat ttg gag gac aga240Gln Arg Ile Met Ile Asn Phe Asn Pro His Phe Asp Leu Glu Asp Arg65 70 75 80gac tgc aag tat gac tac gtg gaa gtc ttc gat gga gaa aat gaa aat288Asp Cys Lys Tyr Asp Tyr Val Glu Val Phe Asp Gly Glu Asn Glu Asn85 90 95gga cat ttt agg gga aag ttc tgt gga aag ata gcc cct cct cct gtt336Gly His Phe Arg Gly Lys Phe Cys Gly Lys Ile Ala Pro Pro Pro Val100 105 110gtg tct tca ggg cca ttt ctt ttt atc aaa ttt gtc tct gac tac gaa384Val Ser Ser Gly Pro Phe Leu Phe Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Glu115 120 125aca cat ggt gca gga ttt tcc ata cgt tat gaa att ttc aag aga ggt432Thr His Gly Ala Gly Phe Ser Ile Arg Tyr Glu Ile Phe Lys Arg Gly130 135 140cct gaa tgt tcc cag aac tac aca aca cct agt gga gtg ata aag tcc480Pro Glu Cys Ser Gln Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser145 150 155 160ccc gga ttc cct gaa aaa tat ccc aac agc ctt gaa tgc act tat att528Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile165 170 175gtc ttt gcg cca aag atg tca gag att atc ctg gaa ttt gaa agc ttt576Val Phe Ala Pro Lys Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe180 185 190gac ctg gag cct gac tca aat cct cca ggg ggg atg ttc tgt cgc tac624Asp Leu Glu Pro Asp Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr195 200 205
gac cgg cta gaa atc tgg gat gga ttc cct gat gtt ggc cct cac att672Asp Arg Leu Glu Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile210 215 220ggg cgt tac tgt gga cag aaa aca cca ggt cga atc cga tcc tca tcg720Gly Arg Tyr Cys Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser225 230 235 240ggc att ctc tcc atg gtt ttt tac acc gac agc gcg ata gca aaa gaa768Gly lle Leu Ser Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu245 250 255ggt ttc tca gca aac tac agt gtc ttg cag agc agt gtc tca gaa gat816Gly Phe Ser Ala Asn Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp260 265 270ttc aaa tgt atg gaa gct ctg ggc atg gaa tca gga gaa att cat tct864Phe Lys Cys Met Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser275 280 285gac cag atc aca gct tct tcc cag tat agc acc aac tgg tct gca g8g912Asp Gln Ile Thr Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu290 295 300cgc tcc cgc ctg aac tac cct gag aat ggg tgg act ccc gga gag gat960Arg Ser Arg Leu Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp305 310 315 320tcc tac cga gag tgg ata cag gta gac ttg ggc ctt ctg cgc ttt gtc1008Ser Tyr Arg Glu Trp Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val325 330 335acg gct gtc ggg aca cag ggc gcc att tca aaa gaa acc aag aag aaa1056Thr Ala Val Gly Thr Gln Gly Ala Ile Ser Lys Glu Thr Lys Lys Lys340 345 350tat tat gtc aag act tac aag atc gac gtt agc tcc aac ggg gaa gac1104Tyr Tyr Val Lys Thr Tyr Lys Ile Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp355 360 365tgg atc acc ata aaa gaa gga aac aaa cct gtt ctc ttt cag gga aac1152Trp Ile Thr Ile Lys Glu Gly Asn Lys Pro Val Leu Phe Gln Gly Asn370 375 380acc aac ccc aca gat gtt gtg gtt gca gta ttc ccc aaa cca ctg ata1200Thr Asn Pro Thr Asp Val Val Val Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu Ile385 390 395 400act cga ttt gtc cga atc aag cct gca act tgg gaa act ggc ata tct1248Thr Arg Phe Val Arg Ile Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly Ile Ser405 410 415atg aga ttt gaa gta tac ggt tgc aag ata aca gat tat cct tgc tct1296Met Arg Phe Glu Val Tyr Gly Cys Lys Ile Thr Asp Tyr Pro Cys Ser420 425 430gga atg ttg ggt atg gtg tct gga ctt att tct gac tcc cag atc aca1344Gly Met Leu Gly Met Val Ser Gly Leu Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr435 440 445tca tcc aac caa gga gac aga aac tgg atg cct gaa aac atc cgc ctg1392Ser Ser Asn Gln Gly Asp Arg Asn Trp Met Pro Glu Asn Ile Arg Leu450 455 460gta acc agt cgc tct ggc tgg gca ctt cca ccc gca cct cat tcc tac1440Val Thr Ser Arg Ser Gly Trp Ala Leu Pro Pro Ala Pro His Ser Tyr465 470 475 480atc aat gag tgg ctc caa ata gac ctg ggg gag gag aag atc gtg agg1488Ile Asn Glu Trp Leu Gln Ile Asp Leu Gly Glu Glu Lys Ile Val Arg485 490 495
ggc atc atc att cag ggt ggg aag cac cga gag aac aag gtg ttc atg1536Gly Ile Ile Ile Gln Gly Gly Lys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met500 505 510agg aag ttc aag atc ggg tac agc aac aac ggc tcg gac tgg aag atg1584Arg Lys Phe Lys Ile Gly Tyr Ser Asn Asn Gly Ser Asp Trp Lys Met515 520 525atc atg gat gac agc aaa cgc aag gcg aag tct ttt gag ggc aac aac1632Ile Met Asp Asp Ser Lys Arg Lys Ala Lys Ser Phe Glu Gly Asn Asn530 535 540aac tat gat aca cct gag ctg cgg act ttt cca gct ctc tcc acg cga1680Asn Tyr Asp Thr Pro Glu Leu Arg Thr Phe Pro Ala Leu Ser Thr Arg545 550 555 560ttc atc agg atc tac ccc gag aga gcc act cat ggc gga ctg ggg ctc1728Phe Ile Arg Ile Tyr Pro Glu Arg Ala Thr His Gly Gly Leu Gly Leu565 570 575aga atg gag ctg ctg ggc tgt gaa gtg gaa gcc cct aca gct gga ccg1776Arg Met Glu Leu Leu Gly Cys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ala Gly Pro580 585 590acc act ccc aac ggg aac ttg gtg gat gaa tgt gat gac gac cag gcc1824Thr Thr Pro Asn Gly Asn Leu Val Asp Glu Cys Asp Asp Asp Gln Ala595 600 605aac tgc cac agt gga aca ggt gat gac ttc cag ctc aca ggt ggc acc1872Asn Cys His Ser Gly Thr Gly Asp Asp Phe Gln Leu Thr Gly Gly Thr610 6l5 620act gtg ctg gcc aca gaa aag ccc acg gtc ata gac agc acc ata caa1920Thr Val Leu Ala Thr Glu Lys Pro Thr Val Ile Asp Ser Thr Ile Gln625 630 635 640tca gag ttt cca aca tat ggt ttt aac tgt gaa ttt ggc tgg ggc tct1968Ser Glu Phe Pro Thr Tyr Gly Phe Asn Cys Glu Phe Gly Trp Gly Ser645 650 655cac aag acc ttc tgc cac tgg gaa cat gac aat cac gtg cag ctc aag2016His Lys Thr Phe Cys His Trp Glu His Asp Asn His Val Gln Leu Lys660 665 670tgg agt gtg ttg acc agc aag acg gga ccc att cag gat cac aca gga2064Trp Ser Val Leu Thr Ser Lys Thr Gly Pro Ile Gln Asp His Thr Gly675 680 685gat ggc aac ttc atc tat tcc caa gct gac gaa aat cag aag ggc aaa2112Asp Gly Asn Phe Ile Tyr Ser Gln Ala Asp Glu Asn Gln Lys Gly Lys690 695 700gtg gct cgc ctg gtg agc cct gtg gtt tat tcc cag aac tct gcc cac2160Val Ala Arg Leu Val Ser Pro Val Val Tyr Ser Gln Asn Ser Ala His705 710 715 720tgc atg acc ttc tgg tat cac atg tct ggg tcc cac gtc ggc aca ctc2208Cys Met Thr Phe Trp Tyr His Met Ser Gly Ser His Val Gly Thr Leu725 730 735agg gtc aaa ctg cgc tac cag aag cca gag gag tac gat cag ctg gtc2256Arg Val Lys Leu Arg Tyr Gln Lys Pro Glu Glu Tyr Asp Gln Leu Val740 745 750tgg atg gcc att gga cac caa ggt gac cac tgg aag gaa ggg cgt gtc2304Trp Met Ala Ile Gly His Gln Gly Asp His Trp Lys Glu Gly Arg Val755 760 765ttg ctc cac aag tct ctg aaa ctt tat cag gtg att ttc gag ggc gaa2352Leu Leu His Lys Ser Leu Lys Leu Tyr Gln Val Ile Phe Glu Gly Glu770 775 780atc gga aaa gga aac ctt ggt ggg att gct gtg gat gac att agt att2400
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Gln Ala Asn Asn Asp Ala Thr Glu Val Val Leu Asn Lys Leu His Met385 390 395 400Pro Leu Leu Thr Arg Phe Ile Arg Ile Arg Pro Gln Thr Trp His Leu405 410 415Gly Ile Ala Leu Arg Leu Glu Leu Phe Gly Cys Arg Val Thr Asp Ala420 425 430Pro Cys Ser Asn Met Leu Gly Met Leu Ser Gly Leu Ile Ala Asp Thr435 440 445Gln Ile Ser Ala Ser Ser Thr Arg Glu Tyr Leu Trp Ser Pro Ser Ala450 455 460Ala Arg Leu Val Ser Ser Arg Ser Gly Trp Phe Pro Arg Asn Pro Gln465 470 475 480Ala Gln Pro Gly Glu Glu Trp Leu Gln Val Asp Leu Gly Thr Pro Lys485 490 495Thr Val Lys Gly Val Ile Ile Gln Gly Ala Arg Gly Gly Asp Ser Ile500 505 510Thr Ala Val Glu Ala Arg Ala Phe Val Arg Lys Phe Lys Val Ser Tyr515 520 525Ser Leu Asn Gly Lys Asp Trp Glu Tyr Ile Gln Asp Pro Arg Thr Gln530 535 540Gln Thr Lys Leu Phe Glu Gly Asn Met His Tyr Asp Thr Pro Asp Ile545 550 555 560Arg Arg Phe Asp Pro Val Pro Ala Gln Tyr Val Arg Val Tyr Pro Glu565 570 575Arg Trp Ser Pro Ala Gly Ile Gly Met Arg Leu Glu Val Leu Gly Cys580 585 590Asp Trp Thr Asp Ser Lys Pro Thr Val Glu Thr Leu Gly Pro Thr Val595 600 605Lys Ser Glu Glu Thr Thr Thr Pro Tyr Pro Met Asp Glu Asp Ala Thr610 615 620Glu Cys Gly Glu Asn Cys Ser Phe Glu Asp Asp Lys Asp Leu Gln Leu625 630 635 640Pro Ser Gly Phe Asn Cys Asn Phe Asp Phe Pro Glu Glu Thr Cys Gly645 650 655Trp Val Tyr Asp His Ala Lys Trp Leu Arg Ser Thr Trp Ile Ser Ser660 665 670Ala Asn Pro Asn Asp Arg Thr Phe Pro Asp Asp Lys Asn Phe Leu Lys
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1 5 10gga gta tta ctt aca gca aga gca aac tat cag aat ggg aag aac aat99Gly Val Leu Leu Thr Ala Arg Ala Asn Tyr Gln Asn Gly Lys Asn Asn15 20 25gtg cca agg ctg aaa tta tcc tac aaa gaa atg ttg gaa tcc aac aat147Val Pro Arg Leu Lys Leu Ser Tyr Lys Glu Met Leu Glu Ser Asn Asn30 35 40gtg atc act ttc aat ggc ttg gcc aac agc tcc agt tat cat acc ttc195Val Ile Thr Phe Asn Gly Leu Ala Asn Ser Ser Ser Tyr His Thr Phe45 50 55 60ctt ttg gat gag gaa cgg agt agg ctg tat gtt gga gca aag gat cac243Leu Leu Asp Glu Glu Arg Ser Arg Leu Tyr Val Gly Ala Lys Asp His65 70 75ata ttt tca ttc gac ctg gtt aat atc aag gat ttt caa aag att gtg291Ile Phe Ser Phe Asp Leu Val Asn Ile Lys Asp Phe Gln Lys Ile Val80 85 90tgg cca gta tct tac acc aga aga gat gaa tgc aag tgg gct gga aaa339Trp Pro Val Ser Tyr Thr Arg Arg Asp Glu Cys Lys Trp Ala Gly Lys95 100 105gac atc ctg aaa gaa tgt gct aat ttc atc aag gta ctt aag gca tat387Asp Ile Leu Lys Glu Cys Ala Asn Phe Ile Lys Val Leu Lys Ala Tyr110 115 120aat cag act cac ttg tac gcc tgt gga acg ggg gct ttt cat cca att435Asn Gln Thr His Leu Tyr Ala Cys Gly Thr Gly Ala Phe His Pro Ile125 130 135 140tgc acc tac att gaa att gga cat cat cct gag gac aat att ttt aag483Cys Thr Tyr Ile Glu Ile Gly His His Pro Glu Asp Asn Ile Phe Lys145 150 155ctg gag aac tca cat ttt gaa aac ggc cgt ggg aag agt cca tat gac531Leu Glu Asn Ser His Phe Glu Asn Gly Arg Gly Lys Ser Pro Tyr Asp160 165 170cct aag ctg ctg aca gca tcc ctt tta ata gat gga gaa tta tac tct579Pro Lys Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Ile Asp Gly Glu Leu Tyr Ser175 180 185gga act gca gct gat ttt atg ggg cga gac ttt gct atc ttc cga act627Gly Thr Ala Ala Asp Phe Met Gly Arg Asp Phe Ala Ile Phe Arg Thr190 195 200ctt ggg cac cac cac cca atc agg aca gag cag cat gat tcc agg tgg675Leu Gly His His His Pro Ile Arg Thr Glu Gln His Asp Ser Arg Trp205 210 215 220ctc aat gat cca aag ttc att agt gcc cac ctc atc tca gag agt gac723Leu Asn Asp Pro Lys Phe Ile Ser Ala His Leu Ile Ser Glu Ser Asp225 230 235aat cct gaa gat gac aaa gta tac ttt ttc ttc cgt gaa aat gca ata771Asn Pro Glu Asp Asp Lys Val Tyr Phe Phe Phe Arg Glu Asn Ala Ile240 245 250gat gga gaa cac tct gga aaa gct act cac gct aga ata ggt cag ata819Asp Gly Glu His Ser Gly Lys Ala Thr His Ala Arg Ile Gly Gln Ile255 260 265tgc aag aat gac ttt gga ggg cac aga agt ctg gtg aat aaa tgg aca867Cys Lys Asn Asp Phe Gly Gly His Arg Ser Leu Val Asn Lys Trp Thr270 275 280aca ttc ctc aaa gct cgt ctg att tgc tca gtg cca ggt cca aat ggc915Thr Phe Leu Lys Ala Arg Leu Ile Cys Ser Val Pro Gly Pro Asn Gly285 290 295 300
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Ile Gln Thr Leu Leu Lys Val Thr Leu Glu Val Ile Asp Thr Glu His660 665 670Leu Glu Glu Leu Leu His Lys Asp Asp Asp Gly Asp Gly Ser Lys Thr675 680 685Lys Glu Met Ser Asn Ser Met Thr Pro Ser Gln Lys Val Trp Tyr Arg690 695 700Asp Phe Met Gln Leu Ile Asn His Pro Asn Leu Asn Thr Met Asp Glu705 710 715 720Phe Cys Glu Gln Val Trp Lys Arg Asp Arg Lys Gln Arg Arg Gln Arg725 730 735Pro Gly His Thr Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu Gln Glu740 745 750Asn Lys Lys Gly Arg Asn Arg Arg Thr His Glu Phe Glu Arg Ala Pro755 760 765Arg Ser Val770<210>11<211>2919<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
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<221>CDS<222>(467)..(2794)<400>15gtttggcaag tcagtgcaag aggctgactt ctgagaggct tccaggagcc cgaagagagg60acctccacgg gagaagggag tgcgtgtgct cggttttttt tttttctctc tttttttttt120ttttttctga atgaacagct ttgcccaagt gactgaaaaa tacagcttct tcctgaatct180accggcgtag ttgctgaaga gcgctctaga caggacatgg ctctgaagac tcactctttg240gaatgtcctc ttgctcccgg cttataaaca actgtcccga ggaaagaaag gttttacata300
gccaaataca gcctgacaaa tggcacttcg gaactgtgct ttctgatgac aacgcgttcg 360atttctgaca aagcctctcg cacgctgccc ctggagggaa gtcctaagta aaactcagac 420cctccttaaa gtgaggagcg agggcttgga cggtgaacac ggcagc atg gca tcc 475Met Ala Ser1gcg ggg cac att atc acc ttg ctc ctg tgg ggt tac tta ctg gag ctt 523Ala Gly His Ile Ile Thr Leu Leu Leu Trp Gly Tyr Leu Leu Glu Leu5 10 15tgg aca gga ggt cat aca gct gat act acc cac ccc cgg tta cgc ctg 571Trp Thr Gly Gly His Thr Ala Asp Thr Thr His Pro Arg Leu Arg Leu20 25 30 35tca cat aaa gag ctc ttg aat ctg aac aga aca tca ata ttt cat agc 619Ser His Lys Glu Leu Leu Asn Leu Asn Arg Thr Ser Ile Phe His Ser40 45 50cct ttt gga ttt ctt gat ctc cat aca atg ctg ctg gat gaa tat caa 667Pro Phe Gly Phe Leu Asp Leu His Thr Met Leu Leu Asp Glu Tyr Gln55 60 65gag agg ctc ttc gtg gga ggc agg gac ctt gta tat tcc ctc agc ttg 715Glu Arg Leu Phe Val Gly Gly Arg Asp Leu Val Tyr Ser Leu Ser Leu70 75 80gag aga atc agt gac ggc tat aaa gag ata cac tgg ccg agt aca gct 763Glu Arg Ile Ser Asp Gly Tyr Lys Glu Ile His Trp Pro Ser Thr Ala85 90 95cta aaa atg gaa gaa tgc ata atg aag gga aaa gat gcg ggt gaa tgt 811Leu Lys Met Glu Glu Cys Ile Met Lys Gly Lys Asp Ala Gly Glu Cys100 105 110 115gca aat tat gtt cgg gtt ttg cat cac tat aac agg aca cac ctt ctg 859Ala Asn Tyr Val Arg Val Leu His His Tyr Asn Arg Thr His Leu Leu120 125 130acc tgt ggt act gga gct ttt gat cca gtt tgt gcc ttc atc aga gtt 907Thr Cys Gly Thr Gly Ala Phe Asp Pro Val Cys Ala Phe Ile Arg Val135 140 145gga tat cat ttg gag gat cct ctg ttt cac ctg gaa tca ccc aga tct 955Gly Tyr His Leu Glu Asp Pro Leu Phe His Leu Glu Ser Pro Arg Ser150 155 160gag aga gga agg ggc aga tgt cct ttt gac ccc agc tcc tcc ttc atc 1003Glu Arg Gly Arg Gly Arg Cys Pro Phe Asp Pro Ser Ser Ser Phe Ile165 170 175tcc act tta att ggt agt gaa ttg ttt gct gga ctc tac agt gac tac 1051Ser Thr Leu Ile Gly Ser Glu Leu Phe Ala Gly Leu Tyr Ser Asp Tyr180 185 190 195tgg agc aga gac gct gcg atc ttc cgc agc atg ggg cga ctg gcc cat 1099Trp Ser Arg Asp Ala Ala Ile Phe Arg Ser Met Gly Arg Leu Ala His200 205 210atc cgc act gag cat gac gat gag cgt ctg ttg aaa gaa cca aaa ttt 1147Ile Arg Thr Glu His Asp Asp Glu Arg Leu Leu Lys Glu Pro Lys Phe215 220 225gta ggt tca tac atg att cct gac aat gaa gac aga gat gac aac aaa 1195Val Gly Ser Tyr Met Ile Pro Asp Asn Glu Asp Arg Asp Asp Asn Lys230 235 240gta tat ttc ttt ttt act gag aag gca ctg gag gca gaa aac aat gct 1243Val Tyr Phe Phe Phe Thr Glu Lys Ala Leu Glu Ala Glu Asn Asn Ala245 250 255cac gca att tac acc agg gtc ggg cga ctc tgt gtg aat gat gta gga 1291His Ala Ile Tyr Thr Arg Val Gly Arg Leu Cys Val Asn Asp Val Gly
260 265 270 275ggg cag aga ata ctg gtg aat aag tgg agc act ttc cta aaa gcg aga1339Gly Gln Arg Ile Leu Val Asn Lys Trp Ser Thr Phe Leu Lys Ala Arg280 285 290ctc gtt tgc tca gta cca gga atg aat gga att gac aca tat ttt gat1387Leu Val Cys Ser Val Pro Gly Met Asn Gly Ile Asp Thr Tyr Phe Asp295 300 305gaa tta gag gac gtt ttt ttg cta cct acc aga gat cat aag aat cca1435Glu Leu Glu Asp Val Phe Leu Leu Pro Thr Arg Asp His Lys Asn Pro310 315 320gtg ata ttt gga ctc ttt aac act acc agt aat att ttt cga ggg cat1483Val Ile Phe Gly Leu Phe Asn Thr Thr Ser Asn Ile Phe Arg Gly His325 330 335gct ata tgt gtc tat cac atg tct agc att cgg gca gcc ttc aac gga1531Ala Ile Cys Val Tyr His Met Ser Ser Ile Arg Ala Ala Phe Asn Gly340 345 350 355cca tat gca cat aag gaa gga cct gaa tac cac tgg tca gtc tat gaa1579Pro Tyr Ala His Lys Glu Gly Pro Glu Tyr His Trp Ser Val Tyr Glu360 365 370gga aaa gtc cct tat cca agg cct ggt tct tgt gcc agc aaa gta aat1627Gly Lys Val Pro Tyr Pro Arg Pro Gly Ser Cys Ala Ser Lys Val Asn375 380 385gga ggg aga tac gga acc acc aag gac tat cct gat gat gcc atc cga1675Gly Gly Arg Tyr Gly Thr Thr Lys Asp Tyr Pro Asp Asp Ala Ile Arg390 395 400ttt gca aga agt cat cca cta atg tac cag gcc ata aaa cct gcc cat1723Phe Ala Arg Ser His Pro Leu Met Tyr Gln Ala Ile Lys Pro Ala His405 410 415aaa aaa cca ata ttg gta aaa aca gat gga aaa tat aac ctg aaa caa1771Lys Lys Pro Ile Leu Val Lys Thr Asp Gly Lys Tyr Asn Leu Lys Gln420 425 430 435ata gca gta gat cga gtg gaa gct gag gat ggc caa tat gac gtc ttg1819Ile Ala Val Asp Arg Val Glu Ala Glu Asp Gly Gln Tyr Asp Val Leu440 445 450ttt att ggg aca gat aat gga att gtg ctg aaa gta atc aca att tac1867Phe Ile Gly Thr Asp Asn Gly Ile Val Leu Lys Val Ile Thr Ile Tyr455 460 465aac caa gaa atg gaa tca atg gaa gaa gta att cta gaa gaa ctt cag1915Asn Gln Glu Met Glu Ser Met Glu Glu Val Ile Leu Glu Glu Leu Gln470 475 480ata ttc aag gat cca gtt cct att att tct atg gag att tct tca aaa1963Ile Phe Lys Asp Pro Val Pro Ile Ile Ser Met Glu Ile Ser Ser Lys485 490 495cgg caa cag ctg tat att gga tct gct tct gct gtg gct caa gtc aga2011Arg Gln Gln Leu Tyr Ile Gly Ser Ala Ser Ala Val Ala Gln Val Arg500 505 510 515ttc cat cac tgt gac atg tat gga agt gct tgt gct gac tgc tgc ctg2059Phe His His Cys Asp Met Tyr Gly Ser Ala Cys Ala Asp Cys Cys Leu520 525 530gct cga gac cct tac tgt gcc tgg gat ggc ata tcc tgc tcc cgg tat2107Ala Arg Asp Pro Tyr Cys Ala Trp Asp Gly Ile Ser Cys Ser Arg Tyr535 540 545tac cca aca ggc aca cat gca aaa agg cgt ttc cgg aga caa gat gtt2155Tyr Pro Thr Gly Thr His Ala Lys Arg Arg Phe Arg Arg Gln Asp Val550 555 560
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cgtaaaatat tcattaaagt acattcacac tatttttgct ttataacaca gtctttaatt3434ttcactcact gtggaaataa aaactaaggt aacttctcag aaagatatca aatctcagaa3494agaatgtcaa atcagatgaa gttatagtta ggattctaac tactgtaaaa gatttttgct3554tccctcttgt ggtaaaaaaa attatattct cacacatttc ttttttctct acagacggat3614atctgtttag gaaagatttg aaagcagatt atcagtaggt acatggatac atcaagttca3674tttgcagaaa caaataactg aaataaaaaa catgttaatc cttgtatcat actttaatat3734gaaagtattg tttatagata atttatctca caagtcaaaa atgaagattt tgcagcactg3794aaaatctatt aaagctccaa attttaagtt tctaaataat cttcgctgaa atctaaaata3854tactataaca accgtgtttt atttgtgaaa aaaatattaa agtgatttgc tctcaaatat3914caaattttct tctctctttt atattaagag acagaaaatt gtttcatgag ttcacttaac3974tactgagata ttcagagcat ttttacctct ctcttaaatg ttataaaaaa caattgtatt4034tttaagaatg tttatttatc aaagtctttc cttcttctat taaatattta gcaattacct4094ttctaaaata tgaaattttg taagatgttt tcacctaaat aaaaattgaa agcaagtgga4154ttacacagga gaaccattat gaacatttat ttagatatta atcttaaaca gtgtttattt4214cagttttcaa agttagctta taggttatac atttaagtta aagtgctcat aatcacttgc4274aatttcattg taaaatgaac aaatacataa atattttaag aaaaatttaa gtttattcag4334ataagtcacc atgcttcaaa agatctaaga aatgcaaata tactgaaaat tgacatcctc4394tgaaaattcc acttgctatt tacccaagaa tccactggag gtcattactg ccattaaata4454ataactgaaa agactatgta gtgaaatgta tttttaaaaa ctatattcag taaaagcctg4514ctcaatttgg agaaatagaa ccacaaacac agatcacagg ggccttacaa agtttatgtc4574tgaacaaata agtcaattaa gtacacttta ttgaaaattg ccttccatta acacacaaga4634aagaaagcag gattttctcc tgtatctgaa ttttaaaatt aaaaaggcag ataagacata4694aatagttatc attttaattg caataacaca gacaagtagt taatgatgat aacaatggtg4754taacttgtaa actaaatatt tggtaactga agcaataggc agaggaaaat agcttttcta4814tgacacaagt cataagaagt ccatatactg aagagcgttt gattaaaata aagtgactat4874taaccagaaa agaaacattt tacataaaat gctaaaattt attataggaa aataaatcaa4934acccaaagaa agtttattca atgctaattt gaaagaaaat tgataagaaa actttgaggg4994cccaagtcca caatttggtg agaccactaa attttacata taattataca cacacatatg5054tacatatata tgtatataat cttgcttccc gcctgtttat ggcagtactg aagagaaatg5114ggaaagaaga gggagggaga gagaaagacg aagggagaga gaaagcagtt tccaaggata5174tgtttcatgt cccaccattt tctcagtttc tccctctctc tcccaacaca cacacacaca5234cacccctcac atactataaa ataaatcttc actgccctat caaaatacaa ataaatcaat5294ctatgctgtt ctgtccttct tgagaatcta aaacatacca caaaaataca tccccagtct5354tttgttctgt ctgaggttag aattaattca aattcagaat ctgttgtgag aaatgcccag5414gctttaaaaa ttaaaaatgg atggatcttc tctgaactca gggagggcac atacttagat5474acctacaaga cttggaggaa ttaagagttc acccttcatc tcaccaaatt ttccccattt5534ttctctttct tgtagaagga gagaaaccat gctctctagc aacattgagc aaaaatcata5594
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435 440 445Asp Val Leu Phe Ile Gly Thr Asp Asn Gly Ile Val Leu Lys Val Ile450 455 460Thr Ile Tyr Asn Gln Glu Met Glu Ser Met Glu Glu Val Ile Leu Glu465 470 475 480Glu Leu Gln Ile Phe Lys Asp Pro Val Pro Ile Ile Ser Met Glu Ile485 490 495Ser Ser Lys Arg Gln Gln Leu Tyr Ile Gly Ser Ala Ser Ala Val Ala500 505 510Gln Val Arg Phe His His Cys Asp Met Tyr Gly Ser Ala Cys Ala Asp515 520 525Cys Cys Leu Ala Arg Asp Pro Tyr Cys Ala Trp Asp Gly Ile Ser Cys530 535 540Ser Arg Tyr Tyr Pro Thr Gly Thr His Ala Lys Arg Arg Phe Arg Arg545 550 555 560Gln Asp Val Arg His Gly Asn Ala Ala Gln Gln Cys Phe Gly Gln Gln565 570 575Phe Val Gly Asp Ala Leu Asp Lys Thr Glu Glu His Leu Ala Tyr Gly580 585 590Ile Glu Asn Asn Ser Thr Leu Leu Glu Cys Thr Pro Arg Ser Leu Gln595 600 605Ala Lys Val Ile Trp Phe Val Gln Lys Gly Arg Glu Thr Arg Lys Glu610 615 620Glu Val Lys Thr Asp Asp Arg Val Val Lys Met Asp Leu Gly Leu Leu625 630 635 640Phe Leu Arg Leu His Lys Ser Asp Ala Gly Thr Tyr Phe Cys Gln Thr645 650 655Val Glu His Ser Phe Val His Thr Val Arg Lys Ile Thr Leu Glu Val660 665 670Val Glu Glu Glu Lys Val Glu Asp Met Phe Asn Lys Asp Asp Glu Glu675 680 685Asp Arg His His Arg Met Pro Cys Pro Ala Gln Ser Ser Ile Ser Gln690 695 700Gly Ala Lys Pro Trp Tyr Lys Glu Phe Leu Gln Leu Ile Gly Tyr Ser705 710 715 720Asn Phe Gln Arg Val Glu Glu Tyr Cys Glu Lys Val Trp Cys Thr Asp725 730 735
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35 40 45 50tat gca agc aaa gat ctg gag gag cag tta cgg tct gtg tcc agt gta549Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser Ser Val55 60 65gat gaa ctc atg act gta ctc tac cca gaa tat tgg aaa atg tac aag597Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met Tyr Lys70 75 80tgt cag cta agg aaa gga ggc tgg caa cat aac aga gaa cag gcc aac645Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln Ala Asn85 90 95ctc aac tca agg aca gaa gag act ata aaa ttt gct gca gca cat tat693Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala His Tyr100 105 110aat aca gag atc ttg aaa agt att gat aat gag tgg aga aag act caa741Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln115 120 125 130tgc atg cca cgg gag gtg tgt ata gat gtg ggg aag gag ttt gga gtc789Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val135 140 145gcg aca aac acc ttc ttt aaa cct cca tgt gtg tcc gtc tac aga tgt837Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys150 155 160ggg ggt tgc tgc aat agt gag ggg ctg cag tgc atg aac acc agc acg885Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr165 170 175agc tac ctc agc aag acg tta ttt gaa att aca gtg cct ctc tct caa933Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln180 185 190ggc ccc aaa cca gta aca atc agt ttt gcc aat cac act tcc tgc cga981Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg195 200 205 210tgc atg tct aaa ctg gat gtt tac aga caa gtt cat tcc att att aga1029Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile Ile Arg215 220 225cgt tcc ctg cca gca aca cta cca cag tgt cag gca gcg aac aag acc1077Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn Lys Thr230 235 240tgc ccc acc aat tac atg tgg aat aat cac atc tgc aga tgc ctg gct1125Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys Leu Ala245 250 255cag gaa gat ttt atg ttt tcc tcg gat gct gga gat gac tca aca gat1173Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser Thr Asp260 265 270gga ttc cat gac atc tgt gga cca aac aag gag ctg gat gaa gag acc1221Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu Glu Thr275 280 285 290tgt cag tgt gtc tgc aga gcg ggg ctt cgg cct gcc agc tgt gga ccc1269Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys Gly Pro295 300 305cac aaa gaa cta gac aga aac tca tgc cag tgt gtc tgt aaa aac aaa1317His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys Asn Lys310 315 320ctc ttc ccc agc caa tgt ggg gcc aac cga gaa ttt gat gaa aac aca1365Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu Asn Thr325 330 335
tgc cag tgt gta tgt aaa aga acc tgc ccc aga aat caa ccc cta aat 1413Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro Leu Asn340 345 350cct gga aaa tgt gcc tgt gaa tgt aca gaa agt cca cag aaa tgc ttg 1461Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys Cys Leu355 360 365 370tta aaa gga aag aag ttc cac cac caa aca tgc agc tgt tac aga cgg 1509Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr Arg Arg375 380 385cca tgt acg aac cgc cag aag gct tgt gag cca gga ttt tca tat agt 1557Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser Tyr Ser390 395 400gaa gaa gtg tgt cgt tgt gtc cct tca tat tgg aaa aga cca caa atg 1605Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro Gln Met405 410 415agc taa gattgtactg ttttccagtt catcgatttt ctattatgga aaactgtgtt 1661Sergccacagtag aactgtctgt gaacagagag acccttgtgg gtccatgcta acaaagacaa1721aagtctgtct ttcctgaacc atgtggataa ctttacagaa atggactgga gctcatctgc1781aaaaggcctc ttgtaaagac tggttttctg ccaatgacca aacagccaag attttcctct1841tgtgatttct ttaaaagaat gactatataa tttatttcca ctaaaaatat tgtttctgca1901ttcattttta tagcaacaac aattggtaaa actcactgtg atcaatattt ttatatcatg1961caaaatatgt ttaaaataaa atgaaaattg tattat 1997<210>24<211>419<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>24Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala1 5 10 15Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe20 25 30Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala35 40 45Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser50 55 60Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met65 70 75 80Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln85 90 95Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala100 105 110His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys115 120 125
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180 185 190gcc ccc cgc cat cca tac tca att atc aga aga tcc atc cag atc cct 1040Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser Ile Ile Arg Arg Ser Ile Gln Ile Pro195 200 205 210gaa gaa gat cgc tgt tcc cat tcc aag aaa ctc tgt cct att gac atg 1088Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu Cys Pro Ile Asp Met215 220 225cta tgg gat agc aac aaa tgt aaa tgt gtt ttg cag gag gaa aat cca 1136Leu Trp Asp Ser Asn Lys Cys Lys Cys Val Leu Gln Glu Glu Asn Pro230 235 240ctt gct gga aca gaa gac cac tct cat ctc cag gaa cca gct ctc tgt 1184Leu Ala Gly Thr Glu Asp His Ser His Leu Gln Glu Pro Ala Leu Cys245 250 255ggg cca cac atg atg ttt gac gaa gat cgt tgc gag tgt gtc tgt aaa 1232Gly Pro His Met Met Phe Asp Glu Asp Arg Cys Glu Cys Val Cys Lys260 265 270aca cca tgt ccc aaa gat cta atc cag cac ccc aaa aac tgc agt tgc 1280Thr Pro Cys Pro Lys Asp Leu Ile Gln His Pro Lys Asn Cys Ser Cys275 280 285 290ttt gag tgc aaa gaa agt ctg gag acc tgc tgc cag aag cac aag cta 1328Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys Gln Lys His Lys Leu295 300 305ttt cac cca gac acc tgc agc tgt gag gac aga tgc ccc ttt cat acc 1376Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg Cys Pro Phe His Thr310 315 320aga cca tgt gca agt ggc aaa aca gca tgt gca aag cat tgc cgc ttt 1424Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys Arg Phe325 330 335cca aag gag aaa agg gct gcc cag ggg ccc cac agc cga aag aat cct 1472Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gln Gly Pro His Ser Arg Lys Asn Pro340 345 350tga ttcagcgttc caagttcccc atccctgtca tttttaacag catgctgctt 1525tgccaagttg ctgtcactgt ttttttccca ggtgttaaaa aaaaaatcca ttttacacag1585caccacagtg aatccagacc aaccttccat tcacaccagc taaggagtcc ctggttcatt1645gatggatgtc ttctagctgc agatgcctct gcgcaccaag gaatggagag gaggggaccc1705atgtaatcct tttgtttagt tttgtttttg ttttttggtg aatgagaaag gtgtgctggt1765catggaatgg caggtgtcat atgactgatt actcagagca gatgaggaaa actgtagtct1825ctgagtcctt tgctaatcgc aactcttgtg aattattctg attctttttt atgcagaatt1885tgattcgtat gatcagtact gactttctga ttactgtcca gcttatagtc ttccagttta1945atgaactacc atctgatgtt tcatatttaa gtgtatttaa agaaaataaa caccattatt2005caagccaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2029<210>26<211>354<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>26Met Tyr Arg Glu Trp Val Val Val Asn Val Phe Met Met Leu Tyr Val1 5 10 15
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His Thr Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys325 330 335Arg Phe Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gln Gly Pro His Ser Arg Lys340 345 350Asn Pro<210>27<211>1645<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
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aac tgg gaa tac cct tct tcg aag cat cag cat aag aaa ctt gta aac816Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn260 265 270cga gac cta aaa acc cag tct ggg agt gag atg aag aaa ttt ttg agc864Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser275 280 285acc tta act ata gat ggt gta acc cgg agt gac caa gga ttg tac acc912Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr290 295 300tgt gca gca tcc agt ggg ctg atg acc aag aag aac agc aca ttt gtc960Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val305 310 315 320agg gtc cat gaa aaa cct ttt gtt gct ttt gga agt ggc atg gaa tct1008Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser325 330 335ctg gtg gaa gcc acg gtg ggg gag cgt gtc aga atc cct gcg aag tac1056Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr340 345 350ctt ggt tac cca ccc cca gaa ata aaa tgg tat aaa aat gga ata ccc1104Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro355 360 365ctt gag tcc aat cac aca att aaa gcg ggg cat gta ctg acg att atg1152Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met370 375 380gaa gtg agt gaa aga gac aca gga aat tac act gtc atc ctt acc aat1200Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn385 390 395 400ccc att tca aag gag aag cag agc cat gtg gtc tct ctg gtt gtg tat1248Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr405 410 415gtc cca ccc cag att ggt gag aaa tct cta atc tct cct gtg gat tcc1296Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val Asp Ser420 425 430tac cag tac ggc acc act caa acg ctg aca tgt acg gtc tat gcc att1344Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr Ala Ile435 440 445cct ccc ccg cat cac atc cac tgg tat tgg cag ttg gag gaa gag tgc1392Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu Glu Cys450 455 460gcc aac gag ccc agc caa gct gtc tca gtg aca aac cca tac cct tgtl440Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr Pro Cys465 470 475 480gaa gaa tgg aga agt gtg gag gac ttc cag gga gga aat aaa att gaa1488Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys Ile Glu485 490 495gtt aat aaa aat caa ttt gct cta att gaa gga aaa aac aaa act gta1536Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys Thr Val500 505 510agt acc ctt gtt atc caa gcg gca aat gtg tca gct ttg tac aaa tgt1584Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr Lys Cys515 520 525gaa gcg gtc aac aaa gtc ggg aga gga gag agg gtg atc tcc ttc cac1632Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser Phe His530 535 540gtg acc agg ggt cct gaa att act ttg caa cct gac atg cag ccc act1680
Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln Pro Thr545 550 555 560gag cag gag agc gtg tct ttg tgg tgc act gca gac aga tct acg ttt1728Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser Thr Phe565 570 575gag aac ctc aca tgg tac aag ctt ggc cca cag cct ctg cca atc cat1776Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro Ile His580 585 590gtg gga gag ttg ccc aca cct gtt tgc aag aac ttg gat act ctt tgg1824Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr Leu Trp595 600 605aaa ttg aat gcc acc atg ttc tct aat agc aca aat gac att ttg atc1872Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile Leu Ile610 615 620atg gag ctt aag aat gca tcc ttg cag gac caa gga gac tat gtc tgc1920Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr Val Cys625 630 635 640ctt gct caa gac agg aag acc aag aaa aga cat tgc gtg gtc agg cag1968Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val Arg Gln645 650 655ctc aca gtc cta gag cgt gtg gca ccc acg atc aca gga aac ctg gag2016Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn Leu Glu660 665 670aat cag acg aca agt att ggg gaa agc atc gaa gtc tca tgc acg gca2064Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys Thr Ala675 680 685tct ggg aat ccc cct cca cag atc atg tgg ttt aaa gat aat gag acc2112Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn Glu Thr690 695 700ctt gta gaa gac tca ggc att gta ttg aag gat ggg aac cgg aac ctc2160Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg Asn Leu705 710 715 720act atc cgc aga gtg agg aag gag gac gaa ggc ctc tac acc tgc cag2208Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr Cys Gln725 730 735gca tgc agt gtt ctt ggc tgt gca aaa gtg gag gca ttt ttc ata ata2256Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe Ile Ile740 745 750gaa ggt gcc cag gaa aag acg aac ttg gaa atc att att cta gta ggc2304Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu Val Gly755 760 765acg acg gtg att gcc atg ttc ttc tgg cta ctt ctt gtc atc atc cta2352Thr Thr Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile Ile Leu770 775 780ggg acc gtt aag cgg gcc aat gga ggg gaa ctg aag aca ggc tac ttg2400Gly Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly Tyr Leu785 790 795 800tcc atc gtc atg gat cca gat gaa ctc cca ttg gat gaa cat tgt gaa 2448Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His Cys Glu805 810 815cga ctg cct tat gat gcc agc aaa tgg gaa ttc ccc aga gac cgg ctg2496Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Arg Leu820 825 830aac cta ggt aag cct ctt ggc cgt ggt gcc ttt ggc caa gag att gaa2544Asn Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Glu Ile Glu835 840 845
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<211>737<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>38Met Pro Asp His Asp Ser Thr Ala Leu Leu Ser Arg Gln Thr Lys Arg1 5 10 15Arg Arg Val Asp Ile Gly Val Lys Arg Thr Val Gly Thr Ala Ser Ala20 25 30Phe Phe Ala Lys Ala Arg Ala Thr Phe Phe Ser Ala Met Asn Pro Gln35 40 45Gly Ser Glu Gln Asp Val Glu Tyr Ser Val Val Gln His Ala Asp Gly50 55 60Glu Lys Ser Asn Val Leu Arg Lys Leu Leu Lys Arg Ala Asn Ser Tyr65 70 75 80Glu Asp Ala Met Met Pro Phe Pro Gly Ala Thr Ile Ile Ser Gln Leu85 90 95Leu Lys Asn Asn Met Asn Lys Asn Gly Gly Thr Glu Pro Ser Phe Gln100 105 110Ala Ser Gly Leu Ser Ser Thr Gly Ser Glu Val His Gln Glu Asp Ile115 120 125Cys Ser Asn Ser Ser Arg Asp Ser Pro Pro Glu Cys Leu Ser Pro Phe130 135 140Gly Arg Pro Thr Met Ser Gln Phe Asp Met Asp Arg Leu Cys Asp Glu145 150 155 160His Leu Arg Ala Lys Arg Ala Arg Val Glu Asn Ile Ile Arg Gly Met165 170 175Ser His Ser Pro Ser Val Ala Leu Arg Gly Asn Glu Asn Glu Arg Glu180 185 190Met Ala Pro Gln Ser Val Ser Pro Arg Glu Ser Tyr Arg Glu Asn Lys195 200 205Arg Lys Gln Lys Leu Pro Gln Gl n Gln Gln Gln Ser Phe Gln Gln Leu210 215 220Val Ser Ala Arg Lys Glu Gln Lys Arg Glu Glu Arg Arg Gln Leu Lys225 230 235 240Gln Gln Leu Glu Asp Met Gln Lys Gln Leu Arg Gln Leu Gln Glu Lys245 250 255Phe Tyr Gln Ile Tyr Asp Ser Thr Asp Ser Glu Asn Asp Glu Asp Gly260 265 270
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权利要求
1.血管内皮生长因子C(VEGF-C)产物或血管内皮生长因子D(VEGF-D)产物在制备促进神经细胞或神经前体细胞募集、增殖、分化、迁移或存活的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述药物促进神经元细胞或神经元前体细胞的募集、增殖、分化、迁移或存活
3.根据权利要求1的用途，其中所述药物促进少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的募集、增殖或分化。
4.根据权利要求1-3之任一项的用途，其中所述药物用于治疗以神经元细胞的异常生长、神经元结疤或神经变性为特征的疾病或病症。
5.根据权利要求1-3之任一项的用途，其中所述药物用于治疗由选自阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、运动神经元疾病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、痴呆和大脑麻痹的神经变性病导致的神经变性。
6.根据权利要求1-3之任一项的用途，其中所述药物用于治疗以少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的异常生长为特征的疾病或病症。
7.根据权利要求6的用途，其中所述病症的特征在于神经系统脱髓鞘。
8.根据权利要求1-8之任一项的用途，其中所述药物用于治疗选自如下的病症多发性硬化、苯丙酮酸尿症、脑室周围白质软化(PVL)、HIV-1脑炎(HIVE)、格林-巴利综合征(GBS)、急性炎性脱髓鞘性多发性神经病(AIDP)、急性运动性轴索型神经病(AMAN)、急性运动感觉性轴索型神经病(AMSAN)、Fisher综合症、急性全自主神经病变和Krabbe氏病。
9.根据权利要求1-3之任一项的用途，其中所述药物用于治疗慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)。
10.根据权利要求9的用途，其中CIPD选自多病灶获得性脱髓鞘感觉运动性神经病(MADSAM，也称作Lewis-Sumner综合症)和远端获得性脱髓鞘对称性神经病(DADS)。
11.根据权利要求1-3之任一项的用途，其中所述药物用于治疗神经创伤或神经损伤。
12.根据权利要求11的用途，其中所述神经创伤选自中风相关的损伤、脊髓损伤、手术后损伤和脑局部缺血。
13.在哺乳动物个体中促进神经细胞或神经前体细胞募集、增殖、分化、迁移或存活的方法，包括鉴定需要治疗以促进神经细胞或神经前体细胞募集、增殖、分化、迁移或存活的哺乳动物个体，和向所述个体施用包含血管内皮生长因子C(VEGF-C)产物或血管内皮细胞生长因子D(VEGF-D)产物的组合物，其中施用量为在所述个体中有效地刺激神经细胞或神经前体细胞募集、增殖、分化、迁移或存活的量。
14.根据权利要求13的方法，其中所述鉴定包括鉴定需要治疗以促进神经元细胞或神经元前体细胞募集、增殖、分化、迁移或存活的哺乳动物个体。
15.根据权利要求13的方法，其中所述鉴定包括鉴定需要治疗以促进少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞募集、增殖或分化的哺乳动物个体。
16.促进神经干细胞或神经前体细胞增殖、分化、迁移或存活的方法，包括使纯化的神经干细胞或神经前体细胞与可以有效地促进所述细胞存活或刺激所述细胞增殖或分化的量的、含有血管内皮生长因子C(VEGF-C)产物或血管内皮生长因子D(VEGF-D)产物的组合物接触。
17.根据权利要求16的方法，其中神经干细胞选自C17.2、纯化的神经干细胞、HSN-1细胞、胎猪细胞、神经嵴细胞、骨髓来源的神经干细胞、hNT细胞和人神经元祖先细胞系。
18.体外诱导少突胶质细胞前体细胞增殖的方法，包括使少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞与含有VEGF-C产物或VEGF-D产物的组合物接触，其中少突胶质细胞前体细胞选自CG-4细胞、SVG p12胎儿神经胶质细胞系、DBTRG-05MG神经胶质细胞系、纯化的少突胶质细胞前体细胞、分离的NG2蛋白聚糖(NG2+)细胞、骨髓来源的神经干细胞和人神经元祖先细胞系。
19.刺激神经干细胞增殖或分化的方法，包括从哺乳动物个体获得生物学样品，其中所述样品包含神经干细胞，和使所述神经干细胞与含有血管内皮生长因子C(VEGF-C)产物或血管内皮生长因子D(VEGF-D)产物的组合物接触。
20.刺激神经元前体细胞增殖或分化的方法，包括从哺乳动物个体获得生物学样品，其中所述样品包含神经元前体细胞，和使所述神经元前体细胞与含有血管内皮生长因子C(VEGF-C)产物或血管内皮生长因子D(VEGF-D)产物的组合物接触。
21.刺激少突胶质细胞前体细胞增殖或分化的方法，包括从哺乳动物个体获得生物学样品，其中所述样品包含少突胶质细胞前体细胞，和使所述少突胶质细胞前体细胞与含有血管内皮生长因子C(VEGF-C)产物或血管内皮生长因子D(VEGF-D)产物的组合物接触。
22.根据权利要求16-21之任一项的方法，其中所述接触包括在含有VEGF-C产物或VEGF-D产物的培养基中培养细胞。
23.根据权利要求19-22之任一项的方法，还包括在所述接触步骤之前从样品纯化和分离所述细胞的步骤。
24.根据权利要求16-23之任一项的方法，还包括在接触步骤之后纯化和分离所述细胞的步骤。
25.根据权利要求16-24之任一项培养的、纯化的和分离的神经细胞。
26.根据权利要求19-24之任一项的方法，还包括在所述接触步骤之后将所述细胞施用给哺乳动物个体的步骤。
27.根据权利要求19-24之任一项的方法，还包括在所述接触步骤之后将细胞移植入不同的哺乳动物个体中的步骤。
28.根据权利要求16-18之任一项的方法，还包括在所述接触步骤之后将所述细胞施用给哺乳动物个体的步骤。
29.权利要求26-28之任一项的方法，其中将所述细胞离体接种在组织、器官、或人工基质中，并将所述组织、器官或人工基质附着到、植入或移植入所述哺乳动物个体
30.根据权利要求13-15或26-29之任一项的方法，其中所述个体患有以神经元细胞的异常生长、神经元结疤或神经变性为特征的疾病或病症。
31.根据权利要求30的方法，其中所述神经变性由选自阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、运动神经元疾病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、痴呆和大脑麻痹的神经变性病导致。
32.根据权利要求13-15或26-29之任一项的方法，其中所述个体患有以少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的异常生长为特征的疾病或病症。
33.根据权利要求13-15或26-29之任一项的方法，其中所述个体患有以神经系统脱髓鞘为特征的病症。
34.根据权利要求33的方法，其中所述病症是多发性硬化、苯丙酮酸尿症、脑室周围白质软化(PVL)、HIV-1脑炎(HIVE)、格林-巴利综合征(GBS)、急性炎性脱髓鞘性多发性神经病(AIDP)、急性运动性轴索型神经病(AMAN)、急性运动感觉性轴索型神经病(AMSAN)、Fisher综合症、急性全自主神经病变和Krabbe氏病。
35.根据权利要求13-15或26-29之任一项的方法，其中所述个体患有慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)。
36.根据权利要求35的方法，其中CIPD选自MADSAM(多病灶获得性脱髓鞘感觉运动性神经病，也称作Lewis-Sumner综合症)和DADS(远端获得性脱髓鞘对称性神经病)。
37.根据权利要求13-15或26-29之任一项的方法，其中所述疾病或病症选自神经创伤或神经损伤。
38.根据权利要求37的方法，其中所述神经创伤选自中风相关的损伤、脊髓损伤、手术后损伤和脑局部缺血。
39.根据权利要求13-15或26-38之任一项的方法，其中所述哺乳动物个体是人。
40.根据权利要求1-24或26-28之任一项的方法或用途，其中所述产物是VEGF-C产物。
41.根据权利要求40的方法或用途，其中所述VEGF-C产物包含纯化的哺乳动物前VEGF-C原多肽或其结合VEGFR-3或神经毡蛋白-2的片段。
42.根据权利要求40的方法或用途，其中VEGF-C产物包含VEGF-CΔC156多肽。
43.根据权利要求40的方法或用途，其中VEGF-C产物包含嵌合肝素结合型VEGF-C多肽。
44.根据权利要求40的方法，其中所述个体是人，而前VEGF-C原多肽是人的。
45.根据权利要求40的方法或用途，其中VEGF-C产物包含含有与SEQID NO24的氨基酸32-227有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽结合VEGFR-3。
46.根据权利要求40的方法或用途，其中VEGF-C产物包含含有与SEQID NO24的氨基酸103-227有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽结合VEGFR-3。
47.权利要求40的方法或用途，其中VEGF-C产物包含选自如下的多核苷酸(a)含有与SEQ ID NO23的核苷酸序列有至少90％同一性的核苷酸序列并编码结合VEGFR-3的多肽的多核苷酸；和(b)编码结合VEGFR-3的多肽的(a)的片段。
48.权利要求40的方法或用途，其中VEGF-C产物包含选自如下的多核苷酸(a)含有编码包含与SEQ ID NO24有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多肽结合VEGFR-3；和(b)编码结合VEGFR-3的多肽的(a)的片段。
49.根据权利要求40的方法或用途，其中VEGF-C产物包含与SEQ IDNO23的互补序列在如下杂交和洗涤条件下杂交并编码结合VEGFR-3的多肽的多核苷酸在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中65℃杂交，以及在0.2XSSC/0.1％SDS中42℃洗涤。
50.权利要求40的方法或用途，其中VEGF-C产物包含选自如下的多核苷酸(a)包含编码SEQ ID NO24人VEGF-C氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；和(b)编码结合VEGFR-3的多肽的(a)的片段。
51.权利要求40的方法或用途，其中VEGF-C产物包含编码VEGF-CΔC156多肽的多核苷酸。
52.权利要求40的方法或用途，其中VEGF-C产物包含编码嵌合肝素结合型VEGF-C多肽的核苷酸序列。
53.根据权利要求47-52之任一项的方法或用途，其中VEGF-C产物包含含有所述多核苷酸的病毒载体。
54.根据权利要求53的方法或用途，其中所述载体包括复制缺陷型腺病毒、腺相关病毒或慢病毒。
55.根据权利要求1-24或26-39之任一项的方法或用途，其中所述产物是VEGF-D产物。
56.根据权利要求1-24或26-55之任一项的方法或用途，其中所述组合物还包含可药用载体。
57.根据权利要求13-24或26-55之任一项的方法，还包括向哺乳动物个体施用神经治疗剂。
58.根据权利要求1-12之任一项的用途，还包括在所述药物中包含神经治疗剂。
59.根据权利要求57-58之任一项的方法或用途，其中所述神经治疗剂包含选自如下的一种或多种神经生长因子干扰素γ、神经生长因子、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、neurogenin、脑衍生神经营养因子(BDNF)、甲状腺激素、骨形态发生蛋白(BMP)、白血病抑制因子(LIF)、sonic hedgehog、神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素、干扰素、干细胞因子(SCF)、活化素、抑制素、趋化因子、视黄酸和睫状神经营养因子(CNTF)。
60.根据权利要求57-58之任一项的方法或用途，其中神经治疗剂包含含有编码神经生长因子的核苷酸序列的多核苷酸，所述神经生长因子选自如下的一种或多种干扰素γ、神经生长因子、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、neurogenin、脑衍生神经营养因子(BDNF)、甲状腺激素、骨形态发生蛋白(BMP)、白血病抑制因子(LIF)、sonic hedgehog、神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素、干扰素、干细胞因子(SCF)、活化素、抑制素、趋化因子、视黄酸和睫状神经营养因子(CNTF)。
61.根据权利要求57或58的方法或用途，其中神经治疗剂选自tacrine(Cognex)、多奈哌齐(Aricept)、酒石酸卡巴拉汀(Exelon)、galantamine(Reminyl)，胆碱脂酶抑制剂和抗炎药。
62.根据权利要求57或58的方法或用途，其中神经治疗剂选自抗胆碱能药物、多巴胺激动剂、儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)、金刚胺(Symmetrel)、Sinemet_、司来吉兰、卡比多巴、罗匹尼罗(Requip)、辅酶Q10、普拉克索(Mirapex)和左旋多巴(L-dopa)。
63.根据权利要求1-24或26-62之任一项的方法或用途，其中VEGF-C或VEGF-D产物与PDGF-A或PDGF-C联合使用或施用。
64.在可药用稀释剂或载体中包含VEGF-C产物和神经生长因子的组合物。
65.在可药用稀释剂或载体中包含VEGF-C产物和神经治疗剂的组合物。
66.在可药用稀释剂或载体中包含VEGF-D产物和神经生长因子的组合物。
67.在可药用稀释剂或载体中包含VEGF-D产物和神经治疗剂的组合物。
68.权利要求64-67之任一项的组合物，还包含PDGF-A产物或PDGF-C产物。
69.VEGF-C抑制剂在制备用于治疗成神经细胞瘤或神经肿瘤的药物中的用途。
70.抑制成神经细胞瘤和神经肿瘤生长和进展的方法，包括向患有成神经细胞瘤或神经元肿瘤的个体施用包含VEGF-C抑制剂的组合物。
71.权利要求69或70的方法或用途，其中VEGF-C抑制剂选自(a)包含结合VEGF-C的VEGFR-2胞外片段的多肽；(b)包含结合VEGF-C的VEGFR-3胞外片段的多肽；(c)与VEGF-C多肽免疫反应的抗体物质；(d)VEGF-C反义分子；和(e)VEGF-C siRNA。
72.权利要求69或70的方法或用途，其中VEGF-C抑制剂选自包含结合VEGF-C的VEGFR-3胞外片段的多肽、包含结合VEGF-C的NRP-1胞外片段的多肽、和包含结合VEGF-C的NRP-2胞外片段的多肽。
73.权利要求67-70之任一项的方法或用途，其中VEGF-C或VEGF-D产物与PDGF-A抑制剂或PDGF-C抑制剂联合使用或施用。
74.筛选调节VEGF-C对神经干细胞或神经前体细胞的生长、迁移、分化或存活的刺激作用的调节剂，包括使包含VEGF-C多肽的组合物和神经细胞或神经前体细胞在有和无被测药剂存在时接触；测量细胞在有和无所述药剂存在时的生长、迁移、分化或存活；和基于存在所述被测药剂时相对于不存在所述被测药剂时的差别测量结果，将所述被测药剂鉴定为调节VEGF-C对神经细胞或神经前体细胞的作用的调节剂。
75.筛选调节VEGF-D对神经干细胞或神经前体细胞的生长、迁移、分化或存活的刺激作用的调节剂，包括使包含VEGF-D多肽的组合物和神经细胞或神经前体细胞在有和无被测药剂存在时接触；测量所述细胞在有和无所述药剂存在时的生长、迁移、分化或存活；和基于存在所述被测药剂时相对于不存在所述被测药剂时的差别测量结果，将所述被测药剂鉴定为调节VEGF-D对神经细胞或神经前体细胞的作用的调节剂。
76.权利要求74或75的方法，其中所述细胞包含神经干细胞系。
77.权利要求74或75的方法，其中所述细胞包含表达VEGFR-3的神经细胞或神经祖先细胞。
78.权利要求74、75和76之任一项的方法，其中所述细胞表达神经毡蛋白2。
79.权利要求74和75的方法，其用于检测作为神经干细胞或神经前体细胞生长、迁移、分化或存活刺激的激动剂的调节剂，其中通过细胞表面神经细胞标志染色的增加或在细胞中检测到增殖标志的增加，检测激动剂。
80.权利要求74或75的方法，用于检测作为神经干细胞或神经前体细胞生长、迁移、分化或存活刺激的拮抗剂的调节剂，其中通过细胞表面神经细胞标志染色的减少或在细胞中检测到增殖标志的减少，检测拮抗剂。
全文摘要
本发明涉及VEGF－C或VEGF－D物质及促进神经干细胞、神经元细胞和神经元前体细胞、少突胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞生长和分化的方法和通过施用于所述细胞以抑制神经病的物质和方法。
文档编号A61K38/18GK1886149SQ200480034569
公开日2006年12月27日 申请日期2004年9月23日 优先权日2003年9月23日
发明者卡里·阿利塔洛, 马里卡·卡凯南, 葆拉·海科, 基尔西·赛尼奥, 基尔莫·沃蒂奥瓦拉, 让·L·托马斯, 安妮·艾克曼 申请人:路德维格癌症研究院, 利森蒂亚有限公司, 国家健康和医学研究院(Inserm)