一种快速获取大量优质神经干细胞的培养方法

一种快速获取大量优质神经干细胞的培养方法
【专利摘要】本发明提供一种提高干细胞培养效率的方法，所述方法包括在亚磁环境下培养干细胞。本发明使用的方法在不影响细胞性质的前提下快速获得大量优质的干细胞，不会对细胞造成任何额外生物或化学污染，对解决干细胞治疗中细胞数量稀少问题及提高干细胞相关产品产量有重要意义。
【专利说明】一种快速获取大量优质神经干细胞的培养方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种能提高神经干细胞培养效率且不影响干细胞品质的培养方法。

【背景技术】
[0002] 当前对于神经干细胞的分离培养，主要是利用添加生长因子EGF和bFGF无血清培 养基来维持细胞增殖，形成神经干细胞球，从而把干细胞从细胞混合物中分离并维持细胞 的正常生长[1-6]。但是，受细胞培养条件限制及组织来源等因素的限制，常规方法最终能 够获得的细胞数量十分有限。此外，大部分神经干细胞在体外传代20代后都会出现退化， 并且神经干细胞对培养环境要求比较严格，容易出现因环境变化导致的细胞品质改变等问 题，所有这些因素都导致了神经干细胞的基础研究、临床应用以及工业化生产受到限制[2， 5-6]。目前，已有研究发现一些化学分子或生物分子能促进神经干细胞的增殖，从而在短时 间内获取大量细胞，但是，化学分子或生物分子除了对细胞增殖的效应，往往对干细胞的其 他方面产生额外的效应，即它们在影响细胞增殖的同时也会可能会导致细胞自身品质的改 变，所以存在风险[7-10]。另外一个不可避免的问题是化学分子或生物分子的使用为后续 的科学研究或临床及工业应用埋下隐患，难以祛除。
[0003] 亚磁环境是一种物理环境，是利用设备把环境中磁场屏蔽之后产生的一种磁场强 度极低的环境。过去的研究中，科学界一直没有对亚磁环境的标准给出一个明确的定义， 近期中国科学院生物物理所赫荣乔研究组发表的文章把亚地磁场定义为磁场总强度小于 500nT的磁场环境[11]。经过过去几十年的研究，科学家发现亚磁场对动物的生长、发育、 行为，植物的生长、发育，微生物增殖、抗药性，细胞的增殖、形态等生物学过程产生不同的 效应[12-19]。这些结果说明亚磁拥有十分广泛的生物学效应，因此，亚磁相关研究引起了 广泛的关注。


【发明内容】

[0004] 本发明的发明人发现在亚地磁场环境中生长的神经干细胞增殖速度显著增加，但 细胞增殖能力和分化能力没有发生显著改变。由于细胞在培养过程中不引入额外化学分子 或生物分子的干扰，并且在短时间内能得到与常规方法相比数倍的优质细胞，所以，这种方 法极大的降低成本，提高效率。
[0005] 更具体地，本发明提供以下各项：
[0006] 1. -种提高干细胞培养效率的方法，所述方法包括在亚磁环境下培养干细胞。
[0007] 2.根据1所述的方法，其中所述亚磁环境是通过屏蔽环境磁场产生的。
[0008] 3.根据1所述的方法，其中所述亚磁环境的磁场总强度小于500ηΤ。
[0009] 4.根据1所述的方法，其中所述干细胞来自于哺乳动物，所述哺乳动物选自人、 狗、猫、马、牛、兔、猴、大鼠、小鼠。
[0010] 5.根据4所述的方法，其中所述干细胞来自于人。
[0011] 6.根据1所述的方法，其中所述干细胞是神经干细胞。
[0012] 7.根据6所述的方法，其中所述神经干细胞包括原代培养脑来源神经干细胞、纯 化的神经干细胞、大鼠 SVZ来源神经干细胞，人胚胎来源神经干细胞。
[0013] 8.利用根据1-7中任一项所述的方法培养获得的神经干细胞。

【专利附图】

【附图说明】
[0014] 图1 :亚磁环境（hypogeomagnetic field, HGMF)磁场强度分布示意图，虚线标出 为放置细胞的位置。
[0015] 图2 :地磁场（geomagnetic field,GMF)环境磁场强度分布示意图，虚线标出为放 置细胞的位置。
[0016] 图3 :在地磁（GMF)或亚磁（HGMF)环境中生长的神经干细胞形成的神经球。
[0017] 图4 :培养7天后分别统计地磁（GMF)和亚磁（HGMF)环境中生长的神经干细胞细 胞数目，发现亚磁中得到3倍于地磁数量的细胞，经统计分析有极显著差异（t-test，***， P〈0. 001)。
[0018] 图5 :统计生长于96孔板中细胞球，结果显示亚磁中的细胞形成更多体积大神经 球（直径大于1〇〇 U m)。
[0019] 图6 :统计每1000个原代细胞形成的神经球数目，结果成球率没有出现显著差异。
[0020] 图7 :连续亚磁处理两次的神经干细胞，其增殖能力与亚磁处理一次的细胞相同， 但是，它们所获得细胞数量都高于地磁组。亚磁处理后的细胞重新种在地磁环境中，与持续 地磁处理组相比，细胞数目没有出现显著差异。
[0021] 图8 :生长于亚磁中的神经球能连续传代10代以上。
[0022] 图9 :在地磁（GMF)和亚磁（HGMF)环境中生长的神经球经4%多聚甲醛固定后， 免疫细胞化学显示细胞球为Nestin阳性（红色），分化后能形成神经元（β 3-Tubulin阳 性，绿色）和神经胶质细胞（GFAP阳性，红色），所有细胞细胞核用Hochest染色（蓝色） (bar=50 μ m) 〇

【具体实施方式】
[0023] 本发明中所指的"亚磁环境"是指通过磁屏蔽线圈或磁屏蔽箱获得的总磁场强度 小于500nT的磁场环境。
[0024] 实施例1、亚磁细胞培养环境控制
[0025] 在错合金制作的支架上，用磁屏蔽金属坡莫合金（厚度：0. 5mm，磁通透性：20000, 购自北京首都钢铁有限公司））包裹制作成磁屏蔽箱，缠绕层数12层，箱体最终尺寸为 470mm*641mm*6511mm (长*宽*高）。在箱体顶部开数个小孔（直径0. 5mm)，分别安装进气 扇和出气扇，箱体边侧开门。为了保持箱体内适合细胞生长的环境，亚磁屏蔽箱被放置在一 个细胞培养箱（HERA240，Thermo Fisher Scientific，USA)中，细胞培养箱的环境保持为适 宜细胞生长的条件：温度37°C，湿度95%，C02浓度5%。通过运行磁屏蔽箱顶部的风扇，箱体 内的环境与外部进行交换，保持内外环境一致[12,15]。用温度计和湿度计（Smart Sensor AR827, Smart Sensor，HongKong)检测温度和湿度，用（1)2计（Labotec Incubator Control 1050，Labotec，Rosdorf，Germany)检测箱体内(302浓度，发现内外环境一致。磁场总强度用 三轴磁强计（APS Model 520 3-Axis Fluxgate Magnetometer，Applied Physics Systems， Mountain View，CA，USA)检测，检测结果见图1、图2。
[0026] 实施例2、神经干细胞原代培养
[0027] 材料：C57BL/6小鼠（购自北京斯贝福公司）
[0028] 溶液：HEM 溶液，MEM(GIBCO,415〇〇-〇l8) -袋，HEPES (Sigma，H4〇34)3· 81：3g，力口 ddH20 至 0· 875L，添加 2% 双抗（Penicillin/Streptomycin，Gibco, 14140-122)
[0029] NSA 溶液，（DMEM/F12(Gibco, 12500-062) -袋，Glucose (Sigma，G7021)3. 75g，碳 酸氢钠（Sigma，S5761) 1. 125g，HEPES1. 192g，加 ddH20 至 0· 9L。
[0030] NSA-/-溶液，（50mL)，NSA 44mL，10%BSA(Roche，10711454001) lmL，Proliferation Supplement (Stem Cell Technologies, 05701) 5mL,双抗 l%〇
[0031] NSA+/+ 溶液，（50mL)，NSA-/-50mL，！feparin(Sigma，H3149,3. 78mg/mL)50y L, EGF(BD Bioscience,354010,1 μ g/mL)100 μ L, bFGF (Roche,11104616001,0. 1 μ g/ mL)50 μ L〇
[0032] 0· 05%胰蛋白酶溶液，胰蛋白酶（Sigma，T5266)0. 05g，EDTA(Sigma，E6158)0. 004g, 加 PBS 100mL。
[0033] 胰蛋白酶抑制剂溶液，胰蛋白酶抑制剂（Sigma，T6522) 11. 2mg，DNase I (Roche， 10104159001，lmg/mL)0. 8mL，HEM 79. 2mL。
[0034] 操作步骤：
[0035] 1.新生P2小鼠，用70%酒精消毒后，压迫颈椎处死，在无菌环境中完整取出脑，浸 泡在冰冷的HEM溶液中。
[0036] 2. P15或成年小鼠，70%酒精消毒后，颈椎脱臼处死，在无菌环境中取出脑，浸泡在 冰冷的HEM中。在体视显微镜下，取出SVZ区组织放在冰冷的HEM溶液中（操作视频http: // www. stemcell· com/en/Technical-Resources/Multimedia· aspx)〇
[0037] 3.用剪刀将组织破碎成大块，加6mL 0. 05%胰酶后转移到15mL离心管中，37°C消 化 10min。
[0038] 4.在混悬液中加入等体积的胰蛋白酶抑制剂终止消化，室温静止3分钟后在100g 离心5分钟。
[0039] 5.去上清液，在沉淀物中加入2mL NSA+/+，反复吹打把组织打散成单细胞悬液。
[0040] 6.细胞悬液用 40 μ m滤网（BD Bioscience，354020)过滤，用额外 2mLNSA+/+冲洗 离心管和滤网，获得的所有滤液转移到新的离心管中。
[0041] 7.再次在100g离心5分钟，去上清液，沉淀物用l-2mL NSA+/+重悬获得细胞悬 液。
[0042] 8.用血球计数板数计算细胞密度。按照80万细胞每T25细胞培养瓶（BD Falcon) 接种，添加5mL NSA+/+ ;1000个细胞/孔，200μ L NSA+/+，分别放在地磁和实施例1中的亚 磁环境中培养，7天后计数细胞数目或统计神经球数目和大小。
[0043] 结果分析：
[0044] 结果显示，生活在地磁和亚磁中的细胞都能形成形态正常的神经球（图3)，统计 细胞数目发现，亚磁中获得3倍于地磁的细胞数量，经统计分析有极显著差异（***，Ρ值 〈0. 001)(图4)，结果说明，亚磁处理能获得更多数量的神经干细胞。统计生长在96孔板 中的细胞球发现，原代神经干细胞细胞的成球率（原代细胞形成的神经球数量与接种细胞 数量比值），地磁为2. 96%±0. 24%，亚磁为3. 34%±0. 16%，二者之间没有显著差异（图6)， 这说明亚磁处理没有影响到细胞的成球能力。干细胞的成球能力反应了细胞的干性水平 [20]，这个结果说明亚磁处理没有影响到细胞的干性。另外，统计细胞球的大小，我们发现 生长在亚磁中细胞形成直径大细胞球（直径大于100 μ m)的数量高于地磁，地磁环境中形 成的神经球大球比例为22. 16%±1. 42%，亚磁环境中大球的比率为42. 56%±1. 16%，二者之 间存在极显著差异（t-test，*#，P值〈0. 001)(图3,图5)，该结果说明亚磁是通过促进细 胞增殖来获得更多数量的细胞。
[0045] 实施例3、神经干细胞传代
[0046] 操作步骤
[0047] 1.原代神经干细胞细胞在亚磁环境中培养7天（如在实施例2中所述）后，收集 所有的神经球，在l〇〇g离心5分钟。
[0048] 2.添加0. 05%胰酶或accutase在常温消化3分钟，加入等量胰蛋白酶抑制剂，轻 轻混匀。在l〇〇g离心5分钟。
[0049] 3.吸去上清后，加入l_2mL NSA+/+，反复吹打制成成单细胞备悬液。
[0050] 4.按照10万细胞接种到60mm细胞培养皿（Corning)，添加5mLNSA+/+ ; 1000个细 胞每孔，200 μ L NSA+/+，分别放在地磁和亚磁环境中培养，7天后计数细胞数目或统计神经 球数目和大小。
[0051] 结果分析：
[0052] 结果显示，生长在地磁和亚磁中的神经球都能正常传代，生长于亚磁中的细胞分 别接种在地磁和亚磁环境中，7天后计数结果显示，亚磁处理一次和两次的细胞数量没有显 著差异，但是，它们的数量都高于地磁中获得细胞数量。亚磁中细胞重新种在地磁环境中 后，细胞数量与地磁相比没有显著差异（图7)，说明亚磁效应不会出现累积，并且一旦脱离 亚磁环境，亚磁效应消失。亚磁大神经球能连续传代10代以上（图8)，显示亚磁处理并不 会降低细胞的增殖能力。
[0053] 实施例4、神经球分化与免疫组化染色
[0054] 操作步骤
[0055] 1.玻片预处理，直径10mm的玻片用酸液处理后，流水洗净，灭菌。玻片放 到24孔板中，每孔一个，添加0. 5mL包埋液（15mL包埋液包含12. 45mL PBS，0. 3mL Laminin (Invitrogen, 23017-015), 2. 25mL Poly-〇rnithine (Sigma，P4957))，在 37°C孵育 至少三个小时。包埋结束后吸去包埋也，用PBS清洗6遍备用。
[0056] 2.神经球分化，分别收集在地磁和亚磁中生长7天的神经球（如在实施例2中所 述），在100g离心3分钟后，除去上清，用NSA-/-重悬细胞球。
[0057] 3.根据细胞球的密度把细胞球种到玻片上，每孔细胞球的数量在50-100之间。
[0058] 4.免疫组化染色，分化的细胞球用4%多聚甲醛固定30分钟，PBS清洗三遍，37°C 封闭液（包含5%山羊血清，5%胎牛血清，0. l%Twen-20)孵育60分钟。用封闭液稀释的 一抗抗体 Nestin(l: 100, R&D Systems，MAB2736)或 β 3-Tubulin (1:200, CST，5666)与 GFAP(1:200，CST，3670)在 4°C 孵育过夜，PBST(PBS，添加 0. l%Twen-20)清洗 5 分钟，共三次。 封闭液稀释的二抗抗体Alexa Fluor 568抗小鼠抗体（1:1000; Invitrogen, A11061)，Alexa Fluor488 抗兔抗体（1:1000; Invitrogen，A11008)，以及 DAPI (1:2000; Sigma-Aldrich， D9564)在常温孵育3小时或在4°C孵育过夜。PBST清洗5分钟，共三次，用封闭液封闭。封 闭后的片子用荧光显微镜观察并拍照。
[0059] 结果分析：
[0060] 免疫组织化学显示，生长在地磁或亚磁中的细胞球都显示Nestin阳性（神经干 细胞特异性标记，荧光为红色）（图7a，b)，显示地磁和亚磁中的神经球中含有神经干细胞。 神经球分化后，分化产物中包含神经元（β 3-Tubulin阳性，荧光为红色）和神经胶质细胞 (GFAP阳性，荧光为绿色）。DAPI用于染核（荧光显示蓝色）（图7c，d)，结果说明获得的神 经球是有多向分化能力的。这些结果证明在亚磁中生长的细胞没有失去干细胞的性质。
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【权利要求】
1. 一种提高干细胞培养效率的方法，所述方法包括在亚磁环境下培养干细胞。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述亚磁环境是通过屏蔽环境磁场产生的。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述亚磁环境的磁场总强度小于500nT。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞来自于哺乳动物，所述哺乳动物选自 人、狗、猫、马、牛、兔、猴、大鼠、小鼠。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述干细胞来自于人。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是神经干细胞。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述神经干细胞包括原代培养脑来源神经干细 胞、纯化的神经干细胞、大鼠 SVZ来源神经干细胞，人胚胎来源神经干细胞。
8. 利用根据权利要求1-7中任一项所述的方法培养获得的神经干细胞。
【文档编号】C12N5/0797GK104087553SQ201310450694
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】赫荣乔, 刘缨, 付晶鹏, 莫炜川 申请人:中国科学院生物物理研究所