一种抗菌肽发酵生产方法
【专利摘要】本发明属于生物发酵领域，要解决的技术问题是抗菌肽生产成本高，效率低，本发明为解决上述问题，提供一种抗菌肽发酵生产方法，节约了成本，提高了生产效率。本发明采用牛骨蛋白胨作为原料，牛骨蛋白胨每吨一万多，大大降低了成本，并且培养周期短，提高了培养效率，发酵培养PH值范围放宽了，便于操作控制。
【专利说明】一种抗菌肽发酵生产方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种抗菌肽发酵生产方法。
【背景技术】
[0002]抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点，抗菌肽对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了人们的重视。除此之外，人们还发现，某些抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等有杀灭作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程，抗菌肽的广泛的生物学活性显示了其在医学上良好的应用前景，其应用价值很大。
[0003]目前发酵生产抗菌肽一般利用植物蛋白胨作为培养基原料，植物蛋白胨价格比较贵,每吨4万多，成本高，原来发酵温度为36-37°C恒温培养，发酵周期需要32小时，生产效率低，并且PH范围小，只能控制在5.4-5.6之间，不易操作。
【发明内容】
[0004]本发明针对上述抗菌肽生产成本高，效率低的问题，提供一种抗菌肽发酵生产方法，节约了成本，提高了生产效率。
[0005]本发明采取的技术方案为:
一种抗菌肽发酵生产方法，包括以下步骤:
(1)、摇瓶培养:按照配方配制IL培养基，平均分装与10个100ml三角瓶中，高温灭菌冷却后，用枯草杆菌接种，接种量1:80?120，摇床培养，搅拌速度为180?220rpm/min，温度30?34°C，培养时间8?12小时；培养基配方:
牛骨蛋白胨8?12g 酵母提取物3?7g 食盐3?7g
用蒸馏水定容至1L，高压来菌制得枯草杆菌菌种；
(2)、发酵罐发酵:按照配方配制7L培养基，高温灭菌冷却至30-34°C，采用枯草杆菌菌种进行发酵，菌种与培养基比例为0.2:6?7，PH5.2?6.0，温度30_34°C，搅拌速度为180?220rpm/min，整体发酵时间为16?20小时，在发酵过程中，每2小时取样检测，12小时后补加第一步培养基，加入量为第2步的枯草杆菌菌种和第2步培养基总体积量的10?20%,显微镜下检测菌体数量较多，大小均匀，没有其他杂菌生长，合格后得到含有抗菌肽的发酵物，培养基配方为:
玉米:2?4%
豆栢:I?3%
牛骨蛋白胨:0.5?1.5%
硫酸铵:0.5?1.5%
葡萄糖:0.1?0.5% 磷酸二氢钾:0.2?0.4%
麦芽糖:0.5?1.5%
消泡剂:0.015 ?0.025%。
[0006]上述抗菌肽发酵生产方法，包括以下步骤:
(1)、摇瓶培养:按照配方配制IL培养基，平均分装与10个100ml三角瓶中，高温灭菌冷却后，用枯草杆菌接种，接种量1:100，摇床培养，搅拌速度为200rpm/min，温度30_34°C，培养时间10小时；培养基配方:
牛骨蛋白胨1g 酵母提取物5g 食盐5g
用蒸馏水定容至1L，高压来菌制得枯草杆菌菌种；
(2)、发酵罐发酵:按照配方配制7L培养基，高温灭菌冷却至30-34°C，采用枯草杆菌菌种进行发酵，菌种与培养基比例为0.2:7，PH5.2-6.0，温度30_34°C，搅拌速度为200rpm/min,整体发酵时间为16-20小时，在发酵过程中，每2小时取样检测，12小时后补加第一步培养基，加入量为第2步的枯草杆菌菌种和第2步培养基总体积量的10-20%，显微镜下检测菌体数量较多，大小均匀，没有其他杂菌生长，合格后得到含有抗菌肽的发酵物，培养基配方为:
玉米:3%
豆栢:2%
牛骨蛋白胨:1%
硫酸铵:1%
葡萄糖:0.3%
磷酸二氢钾:0.3%
麦芽糖:1%
消泡剂:0.02%。
[0007]本发明采用牛骨蛋白胨作为原料，牛骨蛋白胨每吨一万多，大大降低了成本，并且培养周期短，提高了培养效率，发酵培养PH值范围放宽了，便于操作控制。
【具体实施方式】
[0008]实施例1
一次1L发酵罐的抗菌肽发酵生产
(1)、摇瓶培养:按照配方配制200mL培养基，平均分装与3个500ml三角瓶中，高温灭菌冷却后，用枯草杆菌接种，接种量1:80，摇床培养，搅拌速度为200rpm/min，30°C培养10小时；培养基配方:
牛骨蛋白胨2g 酵母提取物Ig 食盐Ig
用蒸馏水定容至200ml，高压灭菌备用；
(2)、发酵罐发酵:按照配方配制7L培养基，高温灭菌冷却至32°C，移种量1:35，PH5.2-6.0，温度32°C，搅拌速度为200rpm/min，每2小时取样检测，接种后10时补料，整体发酵时间为16-24小时，显微镜检测菌体数量多，大小均已，没有其他杂菌生长，合格后放罐用，培养基配方为:
玉米:3%
豆栢:2%
牛骨蛋白胨:1%
硫酸铵:1%
葡萄糖:0.3%
磷酸二氢钾:0.3%
麦芽糖:1%
消泡剂:0.02%。
[0009]实施例2
一次Im3发酵罐的抗菌肽发酵生产
(1)、摇瓶培养:按照配方配制3L培养基，平均分装与20个100ml三角瓶中，高温灭菌冷却后，用试管菌种接种，接种量1:500，摇床培养，搅拌速度为200rpm/min，34°C培养10小时，检测合格后得菌种，待用；培养基配方:
牛骨蛋白胨30g 酵母提取物15g 食盐15g
用蒸馏水定容至31，高压灭菌备用；
(2)、发酵罐发酵:按照配方配制7L培养基，高温灭菌冷却至33°C，移种量1:35，PH5.2-6.0，温度33°C，搅拌速度为200rpm/min，每2小时取样检测，接种后10小时补料，整体发酵时间为16-24小时，显微镜检测菌体数量多，大小均已，没有其他杂菌生长，合格后放罐用，培养基配方为:
玉米:3%
豆栢:2%
牛骨蛋白胨:1%
硫酸铵:1%
葡萄糖:0.3%
磷酸二氢钾:0.3%
麦芽糖:1%
消泡剂:0.02%。
[0010]实施例3
一次30m3发酵罐的抗菌肽发酵生产
(I)、摇瓶培养:按照配方配制1.5L培养基，平均分装与20个100ml三角瓶中，高温灭菌冷却后，用试管菌种接种，接种量1:500，摇床培养，搅拌速度为200rpm/min，32°C培养10小时，检验合格后的菌种，待用；培养基配方:
牛骨蛋白胨15g 酵母提取物7.5g 食盐7.5g
用蒸馏水定容至1.51，高压灭菌备用；
(2)、种子罐培养:按照配方配制300L培养基，高温灭菌降至31°C，然后接种，接种量1:200, PH5.2-6.0，温度31 °C，搅拌速度为35-40 rpm/min，每2小时取样检测一次，生长时间为12小时,显微镜检测菌体数量多,大小均一,没有其他杂菌生长,培养基配方为:玉米面:3%
豆栢:2%
牛骨蛋白胨:1%
硫酸铵:1%
葡萄糖:0.3%
磷酸二氢钾:0.3%
消泡剂:0.02%。
[0011](3)、发酵罐发酵:按照配方配制20m3培养基，高温灭菌冷却至31°C，移种量
I: 100，PH5.2-6.0，温度31 °C，补料前通气量0.6:1,补料后通气量0.8:1,搅拌速度为80-90rpm/min，每2小时取样检测，接种后10小时补料，整体发酵时间为16-24小时，检测合格后放罐，培养基配方为:
玉米:3%
豆栢:2%
牛骨蛋白胨:1%
硫酸铵:1%
葡萄糖:0.3%
磷酸二氢钾:0.3%
实施例4:一种抗菌肽发酵生产方法，包括以下步骤:
(1)、摇瓶培养:按照配方配制IL培养基，平均分装与10个100ml三角瓶中，高温灭菌冷却后，用枯草杆菌接种，接种量1:80，摇床培养，搅拌速度为180rpm/min，温度30°C，培养时间8小时；培养基配方:
牛骨蛋白胨8g 酵母提取物3g 食盐3g
用蒸馏水定容至1L，高压来菌制得枯草杆菌菌种；
(2)、发酵罐发酵:按照配方配制7L培养基，高温灭菌冷却至30°C，采用枯草杆菌菌种进行发酵，菌种与培养基比例为0.2:6，PH5.2，温度30°C，搅拌速度为180rpm/min，整体发酵时间为16小时,在发酵过程中，每2小时取样检测，12小时后补加第一步培养基,加入量为第2步的枯草杆菌菌种和第2步培养基总体积量的10%，显微镜下检测菌体数量较多，大小均匀，没有其他杂菌生长，合格后得到含有抗菌肽的发酵物，培养基配方为:
玉米:2%
豆栢:1%
牛骨蛋白胨:0.5%
硫酸铵:0.5% 葡萄糖:0.1%
磷酸二氢钾:0.2%
麦芽糖:0.5%
消泡剂:0.015%。
[0012]实施例5:—种抗菌肽发酵生产方法，包括以下步骤:
(1)、摇瓶培养:按照配方配制IL培养基，平均分装与10个100ml三角瓶中，高温灭菌冷却后，用枯草杆菌接种，接种量1:100，摇床培养，搅拌速度为195rpm/min，温度32°C，培养时间10小时；培养基配方:
牛骨蛋白胨1g 酵母提取物5g 食盐4.8g
用蒸馏水定容至1L，高压来菌制得枯草杆菌菌种；
(2)、发酵罐发酵:按照配方配制7L培养基，高温灭菌冷却至32°C，采用枯草杆菌菌种进行发酵，菌种与培养基比例为0.2:6.5，PH5.5，温度31°C，搅拌速度为195rpm/min，整体发酵时间为19小时，在发酵过程中，每2小时取样检测，12小时后补加第一步培养基，加入量为第2步的枯草杆菌菌种和第2步培养基总体积量的12%，显微镜下检测菌体数量较多，大小均匀，没有其他杂菌生长，合格后得到含有抗菌肽的发酵物，培养基配方为:
玉米:3%
豆栢:2%
牛骨蛋白胨:1%
硫酸铵:1.2%
葡萄糖:0.3%
磷酸二氢钾:0.2%
麦芽糖:1%
消泡剂:0.02%。
[0013]实施例6:—种抗菌肽发酵生产方法，包括以下步骤:
(1)、摇瓶培养:按照配方配制IL培养基，平均分装与10个100ml三角瓶中，高温灭菌冷却后，用枯草杆菌接种，接种量1: 120，摇床培养，搅拌速度为220rpm/min，温度34°C，培养时间12小时；培养基配方:
牛骨蛋白胨12g 酵母提取物7g 食盐7g
用蒸馏水定容至1L，高压来菌制得枯草杆菌菌种；
(2)、发酵罐发酵:按照配方配制7L培养基，高温灭菌冷却至34°C，采用枯草杆菌菌种进行发酵，菌种与培养基比例为0.2: 7，PH6.0，温度34°C，搅拌速度为220rpm/min，整体发酵时间为16?20小时,在发酵过程中，每2小时取样检测，12小时后补加第一步培养基,力口入量为第2步的枯草杆菌菌种和第2步培养基总体积量的20%，显微镜下检测菌体数量较多，大小均匀，没有其他杂菌生长，合格后得到含有抗菌肽的发酵物，培养基配方为:
玉米:4%豆栢:3%
牛骨蛋白胨:1.5%硫酸铵:1.5%葡萄糖:0.5%
磷酸二氢钾:0.4%麦芽糖:1.5%消泡剂:0.025%。
【权利要求】
1.一种抗菌肽发酵生产方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)、摇瓶培养:按照配方配制IL培养基，平均分装与10个100ml三角瓶中，高温灭菌冷却后，用枯草杆菌接种，接种量1:80?120，摇床培养，搅拌速度为180?220rpm/min，温度30?34°C，培养时间8?12小时；培养基配方: 牛骨蛋白胨8?12g 酵母提取物3?7g 食盐3?7g 用蒸馏水定容至1L，高压来菌制得枯草杆菌菌种； (2)、发酵罐发酵:按照配方配制7L培养基，高温灭菌冷却至30-34°C，采用枯草杆菌菌种进行发酵，菌种与培养基比例为0.2:6?7，PH5.2?6.0，温度30_34°C，搅拌速度为180?220rpm/min，整体发酵时间为16?20小时，在发酵过程中，每2小时取样检测，12小时后补加第一步培养基，加入量为第2步的枯草杆菌菌种和第2步培养基总体积量的10?20%,显微镜下检测菌体数量较多，大小均匀，没有其他杂菌生长，合格后得到含有抗菌肽的发酵物，培养基配方为: 玉米:2?4% 豆栢:I?3% 牛骨蛋白胨:0.5?1.5% 硫酸铵:0.5?1.5% 葡萄糖:0.1?0.5% 磷酸二氢钾:0.2?0.4% 麦芽糖:0.5?1.5% 消泡剂:0.015 ?0.025%。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽发酵生产方法，其特征在于:包括以下步骤: (I )、摇瓶培养:按照配方配制IL培养基，平均分装与10个100ml三角瓶中，高温灭菌冷却后，用枯草杆菌接种，接种量1:100，摇床培养，搅拌速度为200rpm/min，温度30_34°C，培养时间10小时；培养基配方: 牛骨蛋白胨1g 酵母提取物5g 食盐5g 用蒸馏水定容至1L，高压灭菌制得枯草杆菌菌种； (2)、发酵罐发酵:按照配方配制7L培养基，高温灭菌冷却至30-34°C，采用枯草杆菌菌种进行发酵，菌种与培养基比例为0.2:7，PH5.2-6.0，温度30_34°C，搅拌速度为200rpm/min，整体发酵时间为16-20小时，在发酵过程中，每2小时取样检测，12小时后补加第一步培养基，加入量为第2步的枯草杆菌菌种和第2步培养基总体积量的10-20%，显微镜下检测菌体数量较多，大小均匀，没有其他杂菌生长，合格后得到含有抗菌肽的发酵物，培养基配方为: 玉米:3% 豆栢:2% 牛骨蛋白胨:1%硫酸铵:1%葡萄糖:0.3%磷酸二氢钾:0.3%麦芽糖:1%消泡剂:0.02%。
【文档编号】C12P21/00GK104513841SQ201310450697
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】胡国春, 郭文江, 赵福生 申请人:中农颖泰林州生物科园有限公司