专利名称：Nm_017084.1基因对神经干细胞分化的调控与用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程和发育生物学，涉及神经干细胞分化发育相关基因的遗传工程，以及利用RNA干扰等技术，以神经干细胞分化发育相关基因及其产物作为干预干细胞分化发育的靶标，从而调控神经干细胞分化发育。
背景技术：
神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，并能进行自我更新、足以提供脑组织细胞的可再生细胞。在哺乳动物中枢神经系统发育，保持中枢神经系统的功能具有重要作用。神经干细胞分化是一个极为复杂的过程。影响神经干细胞分化的因子很多，如CNTF能促进神经干细胞分化为胶质细胞，而BDNF则促进分化为神经元。我们发现了神经干细胞分化过程中NM_017084.1基因的特异表达(见专利申请)。特异性干预这个基因表达的技术，对于研究这个基因的具体功能，以及特异性调控这个基因的表达，从而调节神经干细胞的发育、分化，非常重要。
由于神经干细胞固有的体外分离培养困难的特点，目前对其所做的报道往往局限在分离培养技术上。
发明概述本发明的目的在于证实NM_017084.1基因与神经干细胞分化有关。本发明的另一目的在于利用RNAi技术沉默该基因后对神经干细胞分化的影响。
本发明包括下列步骤分离和培养神经干细胞；用Northern技术鉴定与神经干细胞分化相关的NM_017084.1基因，以该基因为模板合成与其同源的RNA，以这些合成的核酸片段干预神经干细胞的分化发育，研究调控的效果。另一方面NM_017084.1基因编码甘氨酸-N-甲基转移酶，利用该酶的底物S-腺苷高半光氨酸抑制甘氨酸-N-甲基转移酶，研究其对神经干细胞分化的影响。具体的包括以下的实施方案实施例材料与方法一、神经干细胞的分离培养和鉴定1.神经干细胞传代培养(未分化神经干细胞的培养)原代培养(培养液为基础培养液+20ng·mL-1的EGF和bFGF)一周后，收集细胞团，用枪头吹打成单细胞悬液，再用移液器将细胞悬液收集到50mL的离心管，1500rpm，5分钟，弃上清，然后用新鲜培养基悬浮细胞沉淀，用移液管转移的无菌的培养瓶内。
观察结果发现在原代培养过程中第1天观察到细胞呈圆形亮点；第2、第3天可见有几个细胞形成的哑铃状形态，绝大多数单个细胞已贴壁，部分细胞有突起生成；第4、第5天可见到约几十个细胞的悬浮球形成，并且小型细胞团长成中型的细胞团第7天时细胞团进一步变大，悬浮神经球也明显增大且可以多次传代。
2.分化神经干细胞的培养原代培养(培养液为基础培养液+20ng/mL的EGF和bFGF)两周后，收集细胞团，用枪头吹打成单细胞悬液，再用含10％胎牛血清的基础培养基培养两周。在神经干细胞的培养过程中，已加胎牛血清培养的实验组和未加胎牛血清的对照组在培养的前3天可以观察到细胞呈圆形。到第4天时，大部分细胞贴壁，并且部分细胞有突起生成，第7天后部分细胞团有突起形成，细胞团和单细胞相互交叉，出现突起交织成网状并且紧紧贴在培养瓶上。
3.鉴定神经干细胞的间接免疫荧光细胞化学法(1)原理已知抗体或抗原用荧光素做标记物，检查细胞或组织标本上相应的抗原或抗体，在荧光显微镜下，由于抗原抗体特异性结合，结合部位的荧光素因受激发光照射而发出明亮的荧光。从标记物存在的位置和数量，可确定在组织细胞中的定位和分布。常见的标记荧光素有异硫氰酸(FITC)和四乙基罗丹明(RB200)，前者发出荧光波长为490-619纳米(黄绿色荧光)。后者发射荧光波长为540-660纳米(橙红色荧光)。FITC和RB200常用于标记免疫荧光蛋白Ig。
(2)方法染色前一天，将细胞传代，种植到Poly-L-lysine包被的玻片上(Poly-L-lysine包被玻片的处理将载玻片置于0.5％的Hcl中，浸泡过夜，流水冲洗并用双蒸水清洗，高温灭菌，浸泡在多聚赖氨酸中并放于电热培养箱中2-3小时，去除多余多聚赖氨酸，并用0.01％PBS漂洗)。染色当天，取出待染细胞，PBS漂洗两次，用40g·L-1多聚甲醛固定15分钟，吸除固定液，PBS漂洗两次，边洗边轻轻振荡，用10mg·L-1BSA/3mg·L-1Triton×100封闭1小时，再加入一抗，常温下孵育90分钟，PBS漂洗三次，每次10分钟，除去未反应的非特异性吸附的抗体，减少背景染色。然后加入连有FITC荧光素的相应的二抗，孵育30分钟，弃二抗，PBS漂洗三次，每次10分钟，甘油明胶封片，荧光显微镜下观察。Nestin蛋白是神经干细胞的标志蛋白，通过免疫荧光单标染色证实了在采用无血清培养液的对照组中观察到大量Nestin的阳性细胞，细胞呈散状或重叠分布。
二、总RNA提取、纯化及mRNA的分离1.用于提取总RNA的细胞培养无菌条件下取E14的SD大鼠的纹状体，机械法将组织吹打成单细胞悬液，以3×105mL-1的细胞浓度，将细胞种植在添加了20ng/mL EGF和10ng/mLbFGF的基础培养液I中，然后将装有培养液的培养瓶置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。培养一周后，收集细胞团，用枪头吹打成单细胞悬液，然后重复上述操作3次后，将悬浮的神经干细胞团收集起来，一部分细胞用于提取总RNA，另一部分则吹打成单细胞悬液后，以同样的细胞密度种植在添加了20ng/mLEGF、10ng/mL bFGF和10％胎牛血清(FCS)的基础培养液I中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养两周后，收集贴壁分化细胞提取总RNA。
2.总RNA提取细胞计数，离心神经干细胞，然后加Trizol(若是悬浮细胞，约5～10×107个细胞中加1mL Trizol；若是贴壁细胞，约1mL Trizol/10cm2)，用枪头反复抽吸混匀，再加入糖原(终浓度250μg/mL)，剧烈振荡或匀浆器匀浆。等细胞裂解完全后将细胞裂解液转移至1.5mL的离心管中(每管中1mL)，加预冷氯仿/异戊醇200uL，振荡30秒，12000g，4℃离心5分钟，取出上清于另一试管中，加入等体积异丙醇于上清液中，振荡10秒，-20℃放置30分钟。12000g，4℃离心10分钟，弃上清(防止沉淀丢失)。用70％乙醇洗两次(每次12000g，4℃离心2分钟)，干燥，加0.1％DEPC水，-70℃下存放备用。
3.总RNA的处理(去除少量基因组DNA)用不含RNA酶的DNA酶处理总RNA去除少量基因组DNA，具体方法如下在一灭菌的Eppendorf管中加入10×PCR buffer 5.0μL50mmol/L MgCl21.5μLRNasin 5.0UDNA酶I(RNase-Free) 4.5U总RNA 20μg加DEPC处理过所双蒸水至50μL→混匀→37℃，30分钟→加DEPC处理过的双蒸水至50μL→加酚/氯仿(3∶1)100μL→4℃，10000g，20分钟→转移上清，加等体积氯仿→4℃，10000g，20分钟→转移上清，加15μL 2mmol/L乙酸钠，250μL无水乙醇→-20℃，1小时→4℃，10000g，20分钟→75％乙醇洗沉淀一次→沉淀溶于20μL DEPC处理过的双蒸水中备用。
4.RNA的鉴定及定量采用比色法和电泳法鉴定总RNA的质量①比色法上述RNA溶液经适当稀释(50～100倍)后于260nm和280nm波长处测吸光度(A)，求出A260/A280的值。
②电泳法(1)凝胶的制备称取琼脂糖1.2克，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液12mL，DEPC处理过的双蒸水37.3mL，加热溶解。待溶液冷却至60℃时加入12.3mol/L的甲醛贮存液10.7mL，10mg/mL的溴乙啶3.0μL，混匀，于室温中静置半小时左右，使凝胶凝固。
(2)样品的制备及上样在一灭菌的Eppendorf管中加入RNA样品 4.5μL5×甲醛凝胶电泳缓冲液 2.0μL甲醛3.5μl
甲酰胺 10.0μL上述各成分混匀后于65℃保温15分钟，离心5秒钟使管内液体集中于管底，然后立即置于冰裕中，加2μL灭菌的并经EDPC处理的10×甲醛凝胶上样缓冲液，混匀。将凝胶预电泳5分钟(5V/cm)，然后上样。
(3)电泳在1×甲醛凝胶电泳缓冲液中以4V/cm的场强电泳。40分钟后于紫外灯下观察电泳结果。
5.RNA的定量测出RNA溶液的A260值后，根据下列公式求出其浓度RNA溶液的浓度(μg/mL)＝A260×40×稀释倍数6.质粒的抽提本实验室前期工作表明，神经干细胞分化过程涉及到1400余条差异表达的基因，为了进一步研究这些基因在神经干细胞分化过程中相关的功能，从中挑选出15个基因克隆，进行质粒抽提以备杂交。
三、反Northern杂交1.以总RNA为模板合成探针(1)在室温下，0.5mL的离心管内配制Master Mixperr×n 3r×n(+10％)5×Reaction Buffer10μL 33μL10×Labeling Mix 5μL16.5μLDTT(100mM)2.5μL 8.2μLTotal Volume 17.5μL 57.7μL(2)将PCR仪预热到70℃；(3)在每个反应中，每0.5mL的PCR管加入以下试剂50μgRNA5μL CDS PrimerMix然后加去离子水到30μL。
(4)轻微振荡上述PCR管，使混合均匀，再离心；(5)把PCR管在70℃温育10分钟；(6)然后将PCR管置冰上1分钟；(7)PCR管与装有Master Mix0.5mL的离心管在48℃，温育5分钟，每个0.5mL的离心管里加入2.5μL Power script Reverse TraNSCsriptase，振荡混匀，然后快速向每个PCR管各加20μL Master Mix；(8)混匀上述物质，PCR管在48℃温育45分钟；(9)最后加1μL0.5M EDTA(pH8.0)终止反应。
2.点膜(1)将15个基因和一个对照点在10×2(cm)的尼龙膜上，每个样品3μL，分三次点膜，然后每次都用电吹风吹干；(2)将膜上的DNA进行碱变性，置于浸有0.1mol/L，1.5mol/LNacl的滤纸上5分钟；(3)重复步骤2。然后凉干；(4)再将滤膜置于浸有0.5mol/L Tris-HCl(pH7.0)，3mol/LNaCl的滤纸上15分钟，凉干；(5)用干净的铝铂纸包好，60-80℃真空干燥2小时。
3.预杂交(1)取一只大小适宜的塑料袋，用2倍SSC溶液润湿而凉干后的尼龙膜放在带袋内，用该膜不能重叠；(2)用适量的预杂交溶液倒入袋中，预杂交溶液的配置如下100-200μg/L已变性小牛胸腺DNA，取10mg/L浓度的小牛胸腺DNA 0.2mL于100煮沸5分钟，使其变性；5倍Denhardt’s取100倍Denhardt’s 0.5mL；5倍SSC取20倍SSC溶液2.5mL；10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)取1mol/LTris-HCl(pH7.5)0.1mL；0.1％SDS取20％SDS溶液0.05mL；
dH2O加6.85mL，定容至10mL；(3)把塑料袋中的气泡赶走，用塑料热封口器把塑料袋开口一边封好；(4)把塑料袋放在68℃水浴中(不断振荡)，预杂交2-4小时。
4.杂交(1)把预杂交过的塑料袋剪开，到去预杂交液，并尽量挤干；(2)配制杂交溶液5倍Denhardt’s取100倍Denhardt’s 0.5mL6×SSC取20倍SSC溶液3.0mL0.5％SDS取20％SDS溶液0.25mL0.025mol/LHCl取5mol/LHCl0.05mL加dH2O6.2mL，定容至9mL；再加变性的小牛胸腺DNA与生物素标记的探针DNA溶液1mL；(3)把适量的杂交液加入上述含有(预杂交过的)尼龙膜的塑料袋中，把塑料袋中的气泡尽量赶走，热封口；(4)把塑料袋放在60℃的杂交炉中，过夜。
5.杂交后尼龙膜的洗脱(1)戴手套剪开塑料袋，用镊子迅速取出尼龙膜，放入另一个新的塑料袋内；(2)先用2×SSC，1％SDS溶液60℃洗脱两次，每次15分钟；(3)再用0.1×SSC，0.5％SDS溶液60℃洗脱两次，每次15分钟。
6.化学发光检测(1)剪开塑料袋，倒掉洗脱液，立即加入0.5mLGEAblocking Solution Q，室温下温育40分钟，并在杂交炉里不断转动；(2)弃掉GEAblocking Solution Q，加入2mL含有AP(1∶7500稀释)的BindingBuffer，室温温育10分钟，并连续轻微的转动；(3)用0.5mL1×BufferF洗脱四次，每次5分钟；(4)用0.5mLBuffer G洗脱两次，每次5分钟；(5)弃掉Buffer G，加0.3mL CDP-Star溶液室温温育2-5分钟；(6)再弃掉CDP-Star溶液，用滤纸吸干残留液，热封口；(7)1.5小时放射自显影。
7.放射自显影把X-光片覆盖在尼龙膜上，然后加紧在暗室中，曝光5-10分钟，冲洗X-光片。
技术效果通过上述技术，我们看到1、3、7、8、10、11、13、14、15号克隆基因在神经干细胞分化的过程中表达明显下调，2、4、5、6、9、12、号克隆基因在分化过程中表达明显上调。尤其第15号克隆基因差异表达尤为显著。所以本文着重研究第15号克隆基因在神经干细胞分化中的作用，在Genebank中查找到其基因号为NM_017084.1。
四、合成双链RNA(dsRNA)1.线形DNA模板的制备将克隆NM_017084.1基因的质粒分别采用EcoRI和Xhol单酶切，酶切体系如下(1)EcorRI单酶切Y+/TanqoTMBuffer 2μL样品DNA5μLEcorRI 0.5mL水 12.5μLTotal Volume 20μL(2)Xhol单酶切Y+/TanqoTMBuffer 2μL样品DNA5μLXhol 0.5mL水 12.5μLTotal Volume 20μL将上述酶切体系混匀后置于37℃温育1小时。
2.凝胶电泳及条带回收用前述同样的方法进行电泳，琼脂糖凝胶的浓度为1.0％，将酶切液电泳证实质粒已被切开后。采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA。
回收步骤如下(1)用干净的手术刀割下含需回收的DNA琼脂块，放入1.5mL离心管中。琼脂块的体积尽量小，但尽量不要因此损失DNA，判断DNA片段的位置时，使用长波紫外光，在紫外光下的照射时间尽可能的短；(2)按没400μL/100mg琼脂糖凝胶的比例加入Binding Buffer，置于50-60℃水中浴中10分钟，使胶彻底融化，加热溶胶时，每两分钟混匀一次。加热的时间可以延长到15分钟，以保证胶全部融化；(3)将融化的凝胶溶液转移到套放在2mL收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2分钟，8000rpm室温离心1分钟；(4)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10放入同一个收集管中，加入500μL洗脱液，8000rmp室温离心1分钟；(5)重复步骤4一次；(6)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10放入同一个收集管中，12000rmp室温离心15秒；(7)将UNIQ-10柱放入一根新的1.5mL的无菌离心管中，在柱子膜中央家加30μL灭过菌的双蒸水，37℃放置2分钟；(8)2000rmp室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段。
3.RNA的合成(1)将贮存于-20℃的MEGAscriptTMT3和T7试剂盒取出，将其中的T3和T7RNA聚合酶取出直接置于冰上，四种核甘酸(ATP，CTP，GTP，UTP)完全溶解后置于冰上，10×反应缓冲液则溶解后置于室温，实验后收回-20℃。
(2)将下述配方组装20μL的反应体系ddH2O 4μLATP 2μLCTP 2μL
GTP 2μLUTP 2μL10×反应缓冲液 2μLDNA模版 4μLT3或T7RNA聚合酶 2μLTotal Volume 20μL要注意按上述次序加入各成分，T7RNA聚合酶对应EcoRI单酶切制得的线形DNA片段，T3 RNA聚合酶对应Xhol单酶切制得的线形DNA片段(3)将上述体系组装好以后，轻轻混匀，短暂离心使液体滞留在管底，然后将管置于37℃下温育4小时。
4.RNA的回收(1)向每个20μL反应体系中加入25μL LiCl；(2)混匀后放于-20℃冷冻1小时；(3)4℃，14000r/分钟离心15分钟，以沉淀RNA；(4)小心的除去上清液，加入1mL70％乙醇于4℃洗涤双链RNA沉淀一次，然后4℃，14000r/分钟离心15分钟，以便最大程度的去除未结合的单核甘酸；(5)小心的除尽上清液，将双链RNA沉淀重悬与无菌的双蒸水，放-70℃保存。
5.RNA的复性将每钟外源DNA片段对应的两个单链RNA片段等量置于一起，充分混匀后，置于水浴中，升温至90℃并保持4分钟，然后使其自然而缓慢的冷却至室温(约需4-5h)然后将所得双链RNA保存在-70℃。
6.电泳观察dsRNA的合成结果制取1.2％的琼脂糖凝胶，制胶方法同前，但是在制胶之前预先将电泳槽和封好的凝胶灌制平台浸泡在0.1％的DEPC中并置于37℃环境下过夜，在制胶前再用双蒸水将残留于电泳槽和制胶槽的DEPC冲去。用常规RNA电泳法观察。
五、电转化法(1)将细胞悬液离心，使细胞沉淀重悬于电转化缓冲液中，制成密度为1×107mL-1的细胞悬液；(2)将8.0μg dsRNA加入到细胞悬液中使总体积为400μL，混匀。同时做空白对照实验；(3)将步骤2中的细胞悬液移入预先冰上放置的规格为400μL体积的电转化杯；(4)室温下将电转化杯放入电转化装置的杯架上，以200伏，80微秒电击一次；(5)电击完毕后，将转化杯置于冰上10分钟；(6)用完全培养液稀释10倍被转化的细胞，并用该培养液洗电转化杯以移出所有的被转化细胞，置于培养瓶中于37℃，5％CO2中培养，观察细胞形态并传代培养。转化后对神经干细胞进行观察。在培养1天后，转化有dsRNA的实验组和未转化dsRNA的对照组的细胞大部分都以圆形的单细胞存在，仅有少数的细胞团；培养3天后，实验组的细胞有小突起形成，细胞逐渐由圆形变成梭状；到第5天后，细胞大多数贴壁并且分化更明显；第9天细胞的突起相互交叉成网状；第12天所有的细胞都分化并且紧密贴壁。而对照组的细胞仍然以未分化的形态存在。
六、反转录PCR(RT-PCR)1.总RNA(total RNA)提取按前面叙述的方法提取并纯化。
2.反转录(1)将下列反应体系加入到一无RNase的EP管中，其反应体系为纯化后的总RNA2μgOligo(dT)18Primer(0.5μg/μL)1μL加DEPC-H2O至总体为 12μL将此反应体系混匀，于70℃水浴培养5分钟，再冰上冷却30秒；(2)将EP管置于冰上按以下顺序加入各试剂，混匀；5×reaction buffer 4μLRNase inhibitor(20U/μL) 1μLdNTP mix(10mmol/L) 2μL(3)将此EP管置于42℃水浴中培养5分钟；(4)追加AMV reverse traNSCsriptase(20U/μL)1μL，在42℃水浴中培养60分钟；
(5)在70℃水浴中加热10分钟停止反应，再将此EP管置于冰上冷却，在-20℃冰箱中保存待进行PCR反应。
3.PCR反应(1)PCR引物的设计根据NM_017084.1基因的全长序列，设计对应于NM_017084.1基因的PCR引物，其引物I序列为TTATGCTGGTGGAAGAGGG和引物II序列为GCAAGGGAAGGCTGTATTG，各为19bp，其PCR产物大小为400bp。
(2)PCR反应体系ddH2O 18μL10×PCR buffer 3μLdNTPs(10mmol/L) 2μL模板DNA 3μL引物I(100ng/μL)1.5μL引物II(100ng/μL) 1.5μLTaq DNA聚合酶(2U/μL) 1μL(3)将反应体系置于PCR仪中，按下列PCR扩增条件进行PCR。
PCR扩增条件为①95℃3分钟②30个循环 (95℃45秒；55℃2分钟；72℃90秒)③72℃ 10分钟(4)PCR扩增完毕后，将PCR产物离心片刻，取3μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，同时用PCR Markers作分子量标准物。
结果显示该基因在不同时间段mRNA水平上的表达量随着时间的逐渐降低。到转化后12天通过实验可以观察到该基因表达明显下调。
七、S-腺苷高半光氨酸(SAH)对神经干细胞分化的影响(1)将SAH配成4ng/mL的母液；(2)把原代神经干细胞传代两次，然后转移到24孔板，密度为105个/mL；(3)在基本培养基的配方里加入SAH，以4ng/mL浓度，并设对照组；(4)然后从细胞形态观察细胞的形态变化；
(5)分别提取对照组和实验组的干细胞总RNA；(6)进行RT-PCR并电泳鉴定其结果。
研究发现Gnmt在分化和未分化神经干细胞中有显著的差异表达，所以我们在酶水平上对该基因进行进一步的研究，通过增加Gnmt酶的产物SAH的浓度，探讨下调Gnmt的表达后对神经干细胞分化影响。神经干细胞经原代培养两周后，转移到24孔板，在基本培养基溶液中加入4ng/mL的SAH作为实验组，同时以未加入SAH作为对照组。在神经干细胞培养过程中观察到，开始2-3天实验组和对照组均生长良好；培养5天后，实验组细胞呈梭形，均已长出突起，部分细胞连成网状；培养到第8天时，胞体丰满，细胞呈梭形、多角形、多突起，神经细胞增多；培养12天后，可见生长良好的神经细胞连成致密的网状。而对照组在培养过程中始终保持未分化状态。
在SAH处理12天后，对实验组和对照组的细胞同时抽提总RNA，然后进行RT-PCR，结果显示NM_017084.1基因的mRNA在实验组中的表达量明显降低。
小结本专利首次在基因表达和酶水平上研究了基因NM_017084.1对神经干细胞分化的调控作用。结果表明NM_017084.1基因mRNA水平、酶水平表达抑制，促进神经干细胞的分化，可用于神经干细胞分化调控与应用。
权利要求
1.一个与神经干细胞分化发育相关基因。
2.权利要求1所述的方法，其中调控的基因NM_017084.1沉默促进神经干细胞分化。
3.权利要求1所述的方法，其中调控的基因NM_017084.1编码的蛋白酶的抑制促进神经干细胞的分化。
全文摘要
本发明提供了在神经干细胞分化过程中有显著差异表达的NM_017084.1基因；本发明也提供了用RNAi沉默该基因表达后促进了神经干细胞分化，并且在酶水平抑制该基因编码蛋白后得到同样的结论该基因在神经干细胞分化过程中具有非常重要的作用。
文档编号C12N15/12GK1693460SQ20041003886
公开日2005年11月9日 申请日期2004年5月4日 优先权日2004年5月4日
发明者文铁桥, 李海龙 申请人:上海大学