专利名称：一种用于挑取小鼠干细胞单克隆的口吸器的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种用于挑取干细胞单克隆的口吸器。
背景技术：
生命科学是20世纪发展最为迅速的学科之一，已成为自然科学中最为引人注目 的领域。干细胞研究是21世纪生命科学领域的一大热门课题，研究的热点首推胚胎干细胞 (Embryonic Stem cells，ES细胞)。1999年末美国《kience》将人类胚胎干细胞研究成 果评为当年世界十大科技进展之首，2000年，((Time))周刊将其列为20世纪末世界十大科 技成就之首，并认为胚胎干细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领 域。干细胞如此受到重视是基于其研究对人类生命健康有重大意义。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ES细胞)是从附植前早期胚胎内细胞团 (ICM)或附植后原始生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)分离克隆出来的一种具无限 增殖能力和全向分化能力的细胞，即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小， 同时又可以在一定条件下进一步分化成为各种不同的组织细胞，从而构成机体各种复杂的 组织器官，并具有形成嵌合体的能力(包括生殖系嵌合体)。ES细胞是研究动物胚胎早期 发生、细胞分化、基因调控等发育生物学基本问题的理想模型，也是组织工程、药理学和临 床医学研究的重要工具。目前，实验室内独立制备ES细胞面临诸多的技术难点，其中之一 是内细胞团形成单克隆的挑取。
实用新型内容本实用新型是为了解决在制备ES细胞的过程中难以完成挑取ES细胞单克隆的问 题，从而提供一种用于挑取小鼠干细胞单克隆的口吸器。一种用于挑取小鼠干细胞单克隆的口吸器，它包括一号橡胶导管、塑料导管、二号 橡胶导管和玻璃针头，所述一号橡胶导管的一端是口吸端，所述一号橡胶导管的另一端与 塑料导管的一端连通，所述塑料导管的另一端与二号橡胶导管的一端连通，二号橡胶导管 的另一端与玻璃针头的基体连通，玻璃针头的针尖是小鼠干细胞单克隆的挑取端；所述塑 料导管内填充脱脂棉。本实用新型在使用时，将玻璃针头的针尖伸入小鼠干细胞团内实现克隆的挑取。 本实用新型操作简单，吸取成功率较高。
图1是本实用新型的结构示意图；图2是具体实施方式
三的结构示意图。
具体实施方式
具体实施方式
一、结合图1说明本具体实施方式
，一种用于挑取小鼠干细胞单克 隆的口吸器，它包括一号橡胶导管1、塑料导管2、二号橡胶导管3和玻璃针头4，所述一号橡胶导管1的一端是口吸端，所述一号橡胶导管1的另一端与塑料导管2的一端连通，所述 塑料导管2的另一端与二号橡胶导管3的一端连通，二号橡胶导管3的另一端与玻璃针头 4的基体41连通，玻璃针头4的针尖42是小鼠干细胞单克隆的挑取端；所述塑料导管2内 填充脱脂棉。本实施方式中，玻璃针头4的针尖在制备过程中，在酒精灯外焰烧2-3秒，使其开 口端平滑，避免划伤细胞。进行小鼠胚胎干细胞(ES)单克隆挑取方法包括以下操作1、饲养单层的制备(1)将冷冻后的MEF(小鼠胚胎成纤维细胞制作的饲养层细胞)进行解冻并培养至 80% 90% (铺满培养皿底部)，换成含10 μ g/ml丝裂霉素C的培养液，在培养箱中作用 2 5小时。(2)事先用明胶覆盖培养板孔0. 5小时，使用前吸去明胶。去除饲养层细胞培养液 中的丝裂霉素C，胰酶消化，IOOOrp离心5分钟，并接种到预先用明胶铺底的培养板孔中，在 温度为37°C、浓度为5%的(X)2下，饱和湿度的培养箱中培养。2、小鼠胚胎干细胞分离(一)实验用胚胎的获得(1)下午15:00挑选10只雌性昆明小鼠，并腹腔注射PMSG10IU/只，4 后腹腔注 射HCG10IU/只，同时与雄鼠1 1合笼，次日晨8:00左右检查阴栓并标记为0. 5dPc。(2) 3. 5天后将小鼠颈椎脱白法处死，然后打开腹腔，暴露子宫，显微镜下利用操作 液(PBI)冲洗子宫，获得囊胚。(二)分离方法(1)将囊腔充分扩展的胚胎在PH为2的酸液中处理30s左右，去掉透明带，在无 钙镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗，然后将去透明带的囊胚移植到制备好的饲养单层 上，换上ES培养基。(2)48小时左右胚胎贴壁，滋养层细胞舒展开并贴附着培养皿表面生长，内细胞团 位于滋养层细胞层的中央部位，向上隆起生长。(3)继续培养2至4天，内细胞团继续增大，观察到内细胞团明显隆起生长时利用 口吸管将其挑出。(4)用末端口径比内细胞团块稍大的自制口吸器的毛细针挑起内细胞团，吸至消 化液小滴内。(5)将内细胞团逐一吸至消化液小滴，在室温下作用1至3分钟。改用末端口径比 内细胞团小的自制口吸器的毛细针，轻轻吸吹内细胞团块，使之分散至3至4个细胞在一起 的小团块。(6)将分散的内细胞团小块吸至新制备的添加ES培养基的饲养单层上进行培养， 3-4天可获得小鼠胚胎干细胞(ES)克隆。
具体实施方式
二、本具体实施方式
与具体实施方式
一所述的一种用于挑取小鼠干 细胞单克隆的口吸器的区别在于，它还包括吸嘴5，所述吸嘴5为一段塑料管，所述吸嘴5与 一号橡胶导管1的口吸端连通。
具体实施方式
三、结合图2说明本具体实施方式
，本具体实施方式
与具体实施方式
一或二所述的一种用于挑取小鼠干细胞单克隆的口吸器的区别在于，玻璃针头4的针尖 42与玻璃针头4的基体41之间的角度为90° 180°。本实施方式更方便深入到培养皿中吸取内细胞团形成的克隆。
具体实施方式
四、本具体实施方式
与具体实施方式
一所述的一种用于挑取小鼠干 细胞单克隆的口吸器的区别在于，玻璃针头4的针尖42与玻璃针头4的基体41之间的角 度为120°。
权利要求1.一种用于挑取小鼠干细胞单克隆的口吸器，其特征是它包括一号橡胶导管(1)、塑 料导管O)、二号橡胶导管C3)和玻璃针头G)，所述一号橡胶导管(1)的一端是口吸端，所 述一号橡胶导管(1)的另一端与塑料导管O)的一端连通，所述塑料导管O)的另一端与 二号橡胶导管(3)的一端连通，二号橡胶导管(3)的另一端与玻璃针头(4)的基体连 通，玻璃针头(4)的针尖0 是小鼠干细胞单克隆的挑取端；所述塑料导管O)内填充脱 月旨棉。
2.根据权利要求1所述的一种用于挑取小鼠干细胞单克隆的口吸器，其特征在于它还 包括吸嘴(5)，所述吸嘴(5)为一段塑料管，所述吸嘴(5)与一号橡胶导管(1)的口吸端连通。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于挑取小鼠干细胞单克隆的口吸器，其特征在于 玻璃针头的针尖G2)与玻璃针头的基体Gl)之间的角度为90° 180°。
4.根据权利要求3所述的一种用于挑取小鼠干细胞单克隆的口吸器，其特征在于玻璃 针头的针尖G2)与玻璃针头的基体Gl)之间的角度为120°。
专利摘要一种用于挑取小鼠干细胞单克隆的口吸器，涉及一种用于挑取干细胞单克隆的口吸器，解决了在独立制备ES细胞的过程中难以完成挑取ES细胞单克隆的问题。它的一号橡胶导管的一端是口吸端，一号橡胶导管的另一端与塑料导管的一端连通，所述塑料导管的另一端与二号橡胶导管的一端连通，二号橡胶导管的另一端与玻璃针头的基体连通，玻璃针头的针尖是小鼠干细胞单克隆的挑取端；塑料导管内填充脱脂棉。本实用新型适用于制备小鼠干细胞单克隆。
文档编号C12M1/26GK201908091SQ20102069350
公开日2011年7月27日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者梁洋 申请人:东北林业大学