专利名称：一种茶树表达序列标签构成的基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种茶树基因检测技术，尤其涉及一种茶树表达序列标签构成的基因
-H-· I I心片。
背景技术：
利用已知基因信息在待测样品中特异地检测目的基因的表达信息，是分子生物学 领域中常用的检测手段，如常用的Southern杂交、Northern杂交以及PCR技术。但是，随 着分子生物学的发展，这些技术不能在同一条件下对成千上万个基因同时进行分析，因此 具有一定的局限性。通过原位合成(in sitil Synthesis)探针或合成目的基因片段后采 用交联的方式，可以将成千上万个基因固定在载体上，再利用杂交方式检测基因表达信息 的方法已成为一种趋势，随着这种方法的不断发展，出现了生物芯片技术。生物芯片的实 质就是在面积不大的基片上有序地点阵排列了一系列固定于一定位置地可寻址的生物识 别分子(Lipshutz RJ et al.，Bio Techniques 19 (1995), 442-447 ；Fodor SP et al.， Nature 364 (1993),555-556 ；Fodor SP et al.，Science 251 (1991),767-773 ；Pease AC et al. , Proceedings of National Academy of Science, USA 91 (1994)，5022—5026)。 由于最初的生物芯片主要是用于DNA序列测定、基因表达谱鉴定(Lockhart DJ et al., Nature Biotechnology 14 (1996)，1675-1680)、基因突变体的检测和分析(Feriotto G et al. , Human Mutation 13 (1999),390-400 ；Hacia JG et al. , Nature Genetics 21 (suppl 1)(1999),42-47；Hacia JG et al.，Nature Genetics 22 (1999)，164—167 ；Nilsson P et al. ,Bio Techniques 26 (1999)，308-316)，所以又称为DNA芯片或生物芯片。目前，这一技 术已扩展至免疫反应、受体结合等非核酸领域，因此生物芯片已超出了原来的范围。如今生 物芯片主要包括cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列、动电微阵列、蛋白质芯片和免疫芯片等，还 出现了组织芯片、细胞芯片、多肽芯片、质谱芯片和电芯片等新的品种和技术。目前DNA芯 片因具有强有力性、灵活性、敏感性和相对简单等特点而被应用在许多领域，如医学临床诊 断、药物开发、环境监测、食品卫生监督以及司法鉴定等；在科研领域，生物芯片主要用于检 测生物体在不同发育阶段、组织器官、及在各种生物及非生物胁迫下基因的表达情况，鉴定 特异表达基因的信息，从而为研究提供信息和方向。通过构建cDNA文库、测序获取基因信息，是生物芯片制备过程中目的探针设计的 主要来源。目前，在一些大型数据库(如NCBI上的GenBank)中已经有多种生物基因的 EST (基因表达序列标签)、基因、甚至基因组序列信息，为一些模式生物芯片的制作提供了 信息，大大方便了生物基因表达信息的获取。探针制作完成后，通过将液相化学合成的大量 探针，或将PCR扩增的cDNA、基因组DNA经纯化、定量分析后，通过阵列点样机及电脑控制的 机器手，准确、快速地将不同探针样品定量点样子带正电荷的尼龙膜或多聚赖氨酸包被的 硅片等载体的相应位置上，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。而常规的杂 交检测方法主要包括目的片段扩增、直接点样或电泳后转到尼龙膜上、紫外铰链等步骤，因 此，整体需要目的片段的量较大，且每次只能分析少数基因，具有一定的局限性。待测的生
3物样品往往是各种组分的混合体，成分非常复杂，直接用样品本身进行标记杂交对样品量 的要求较高。因此，待测样品DNA在杂交前一般都要通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增，然 后对扩增后的靶DNA进行标记。芯片杂交可以根据实际情况在常规杂交技术的基础上进行 优化，然后进行扫描，图像处理、数据提取、进行统计分析，最终得到结果。这种处理和分析 数据方式比常规杂交检测的灵敏度高，尤其是对一些低丰度表达的基因，此外，通过统计学 进行分析可提高结果的准确性。利用茶树表达序列标签构成的生物芯片进行基因表达分析，有助于发现并克隆基 因家族新成员、基因定位克隆、作为序列标签位点进行染色体的基因定位和基因图谱制作、 遗传突变位点的鉴定、分析基因在不同组织中的表达特异性和建立DNA物理图谱和对细胞 和有机体的整体研究等。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种茶树表达序列标签构成的基因
-H-· I I心片。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的，一种茶树表达序列标签构成的基 因芯片，该基因芯片以茶树表达序列标签作为探针，由序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 4866序列的探针组成。诸序列点所对应代表的EST编号及其对应的矩阵号1 48 ；列 号1 18 ；行号1 20 卩，该4866个序列点排布在平行的48个矩阵单元中，每个序列 点设三个重复；该芯片中的每序列点是以100 1000个连续的核苷酸为探针的序列和/或 同源序列和/或其互补序列。进一步地，所述的每个矩阵，其第一排1 15个序列点为内参，第一排16 18个 序列点为阳性对照序列点，第二排1 3个序列点为阴性对照序列点，第二排4 18个序 列点和第三排1 9个序列点为外标。进一步地，所述的内参，其是5个茶树看家基因，即TC0024H07，TC0038D06, TC0047B06, TL004D11, TC0011C07。进一步地，所述的阴性对照序列点为空白点样液，即50% DMS0。进一步地，所述的适合的载体是固相载体，其或为玻片，或为硅片，或为尼龙膜，或 为硝酸纤维膜。 进一步地，所述的核苷酸，其是脱氧核糖核酸，和/或核糖核酸，和/或多聚寡核苷酸。本发明的有益效果是由于本发明的基因芯片具备高通量的优势，可通过定量监 测大量基因表达水平，阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗靶。采 用本发明的基因芯片技术从整体水平研究功能基因的表达谱等技术是一种高通量的进行 功能基因表达分析的研究手段，具有许多商用价值和科研价值1、可同时检测除去对照点以外的4866条茶树功能基因的表达情况；2、可用于克隆植物的重要功能基因，如抗病、抗逆、生长发育相关基因的克隆；3、应用该表达序列标签芯片可用于作物种质资源的鉴定评价；4、应用该生物芯片也可用于对农作物的杂种优势进行早期预测，筛选出最佳的优 势杂交种；
5、应用该生物芯片还可用于查找药物的毒性和副作用，进行毒理学研究，利于对 新型除草剂和新型农药的筛选；6、该生物芯片可用于植物的育种和植物新品种的产生；7、该生物芯片还可用于从整体上研究整个信使核糖核酸(mRNA)的表达，这对生 物体基因调节的整体性研究具有重要的科研和实践指导价值；8、应用该生物芯片还可以运用突变体研究植物中胞间和胞内信号传导，为发现植 物中的基因功能和生理代谢途径提供重要的理论依据；9、该生物芯片能够作为一种商品，广泛应用于农业、林业科学研究和实际生产中。
图1是茶树表达序列标签构成的基因芯片矩阵分布示意图；图2是茶树基因芯片矩阵点制示意图；图3是安吉白茶不同白化阶段差异表达基因统计表。
具体实施例方式本发明研制了一种茶树表达序列标签构成的基因芯片。该芯片是在适合的载体面 上点制组合有4866个序列点，诸序列点所对应代表的EST编号及其对应的矩阵号1 48 ； 列号1 18 ；行号1 20 ；S卩，该4866个序列点排布在平行的48个矩阵单元中，每个序 列点设三个重复；该芯片中的每序列点是以100 1000个连续的核苷酸为探针的序列和/ 或同源序列和/或其互补序列。所述的每个矩阵，其第一排1 15个序列点为内参，第一排16 18个序列点为 阳性对照序列点，第二排1 3个序列点为阴性对照序列点，第二排4 18个序列点和第 三排1 9个序列点为外标。所述的内参，其是5个茶树看家基因，EST编号为TC0024H07，TC0038D06, TC0047B06, TL004D11, TC0011C07，其基因序列如 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 5 所示。所述的阴性对照序列点为空白点样液，S卩50% DMS0。所述的适合的载体是固相载体，其或为玻片，或为硅片，或为尼龙膜，或为硝酸纤维膜。所述的核苷酸，其是脱氧核糖核酸，和/或核糖核酸，和/或多聚寡核苷酸。本发明提供了一种用于检测茶树功能基因表达情况的基因芯片。该基因芯片以茶 树叶片和幼根基因的非冗余cDNA片段作为探针，包含有4688个茶树cDNA序列和5个茶树 看家基因序列，8个和已知基因均没有相似性的酵母基因间序列作为外标及阴性对照，且每 个探针设置了 3个重复，便于对杂交结果进行统计学分析，提高了检测结果的准确性。应用该芯片对安吉白茶不同白化阶段叶片进行鉴定，结果获取了 580个差异表达 基因，并构建出了不同基因表达时间和空间上的表达谱。本发明不仅可用于构建茶树特异 品种不同生长发育阶段、不同组织器官乃至特异细胞中的基因表达谱，还可用于批量检测 茶树在生物或非生物胁迫下的基因表达信息、筛选差异基因。应用该芯片可实现基因表达 信息的高通量检测，且操作方便、安全，检测结果可靠、有效，可节省大量时间、人力、物力和 财力，具有广阔的应用前景。
下面根据附图和实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。实施例1茶树叶片cDNA文库的构建一、茶树叶片总RNA的提取春天取生长健壮的茶树嫩叶lOOmg，迅速加液氮冷冻研磨成细粉末状，加入 IOOOyL Trizol试剂(购自Gibco BRL)继续研磨后，又再加入1000 μ L Trizol试剂，混勻 分装到两个经焦炭酸二乙酯处理的1. 5mL离心管中，冰上放置5分钟，各加入200 μ L的氯 仿，颠倒混勻，4°C 12000转/分钟离心10分钟，取500 μ L上清液，加入等体积的异丙醇，上 下轻轻颠倒10次，室温放置10分钟，4°C 12000转/分钟离心10分钟，去上清，沉淀中加 入ImL 75%乙醇轻轻清洗，倒去乙醇，干燥后加入20 μ L经焦炭酸二乙酯处理过的双蒸水 溶解沉淀。甲醛凝胶变性电泳检测RNA质量后，放于_70°C冰箱中长期保存，备用。二、mRNA的分离和纯化1、生物素标记的Oligo (dT)探针与mRNA的退火在经焦炭酸二乙酯处理不含RNA酶的1. 5mL离心管中加入0. 5mg总RNA，溶解于 500 μ L焦炭酸二乙酯处理水中，65°C水浴保温10分钟，加入3 μ L的Oligo (dT)探针，13 μ L ^ 20 X SSC(1L 20XSSC含175. 3g氯化钠和88. 2g柠檬酸钠，ρΗ 7.0)轻轻混勻，室温放置 约10-20分钟至冷却。2、亲和素顺磁磁珠的冲洗将一管亲和素顺磁磁珠(购白Promega Corporation)轻轻悬浮后放入磁性分离 架中，使亲和素顺磁磁珠集中到管的一侧，小心除去上清，用300yL 0.5XSSC清洗亲和素 顺磁磁珠三次，每次用磁性分离架集中磁珠，去除上清液，将清洗过的亲和素顺磁磁珠溶于 IOOyL 的 0.5XSSC 中备用。3、杂交体的生成和漂洗将已退火的生物素标记探针，加入到溶于100 μ L的0. 5 X SSC的亲和素顺磁磁珠 中，轻轻混勻，室温放置10分钟，每隔1-2分钟轻混勻一次，用磁性分离架捕获磁珠亲和素 顺磁磁珠，小心去除上清，用300 μ L的0. 1 X SSC洗涤亲和素顺磁磁珠，磁性分离架集中后 去除上清液，共重复4次。4、洗脱 mRNA将漂洗过的亲和素顺磁磁珠重新悬浮于100μ L的焦炭酸二乙酯水中，用磁性分 离架捕获磁珠，将洗脱的水相吸至一新管中，重复清洗亲和素顺磁磁珠，共得到250 μ L的 mRNA。5、mRNA的沉淀和溶解加入0. IX体积的醋酸钠(ρΗ 5. 2)和IX体积的异丙醇沉淀mRNA，-20°C过夜。 12000转/分钟离心10分钟，去上清。加入ImL的75 %的乙醇悬浮后，离心片刻，去上清， 干燥，复溶于30 μ L的焦炭酸二乙酯处理的水中。3. 5yL mRNA加入16. 5 μ L上样缓冲液 (按7 33配)混勻后在95°C变性2分钟，拿出后立即放入冰上，防止退火，甲醛凝胶变性 电泳时，电泳槽置于冰上，保证低温。电压不超过5v/cm。三、cDNA第一链合成在0. 5mL的离心管中，分别加入3 μ L的茶树mRNA，IyL 10 μ M 5，PCR第一链合 成引物(5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3，)，1 μ L 10 μ M 3，PCR 弓|物(5，-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)‘ ) (N = A，G，C 或者 T ；N^1 = A, G, C)。 混勻，稍离心，72°C温育2分钟，冰上冷却2分钟，离心把组分收集到底部，每管中加入2μ L 5 X第一链合成缓冲液，1 μ L二硫苏糖醇(20mM)，1 μ L dNTP混合物(IOmM)，1 μ L反转录酶， 至总体积为10yL。经涡旋、瞬间离心混勻，在PTC-220 PCR仪中42°C温育1小时后，取出 放于冰上，终止第一链的合成。放于-20°C冰箱中可保存3个月，备用。四、cDNA第二链的合成先把PCR仪加热到95 °C。在一个0. 5mL的离心管中加入2yL第一链cDNA，80yL 无离子水，IOyL 10XPCR缓冲液，2μ L 50 X dNTP mix,2y L 10 μ M 5，PCR第二链合成引物 (5‘-AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGT_3，)，2yL 3，PCI^|*(5，-ATTCTAGAGG CCGAGGCGGCCGACA TG-d (T) 30^^-3' ) (N = A，G，C 或者 T ；N^1 = A，G，C)，2 μ L 50 X 聚合酶混合物至总体积为 100 μ L，轻轻振动混勻，稍离心，将物质收集到底部，必要时加2滴矿物油以覆盖液面。放进 经预热到95°C的PCR仪中，PCR反应程序如下95°C变性20秒，接着95°C 5秒，68°C 6分 钟共24个循环，PCR结束后，取5yL用1. 琼脂糖凝胶电泳检测。其余放于-20°C冰箱 可保存3个月。五、Sfi I酶切获得可连接的cDNA1、在一个0. 5mL的离心管中加入79 μ L cDNA10 μ L IOXSfi I 缓冲液10 μ L Sfi I 内切酶(20 单位 / μ L)IyL IOOX牛血清白蛋白充分混勻2、50°C水浴保温2小时，取出后放于-20V冰箱中3、分离时再加入2μ L 二甲苯青，充分混勻六、建库用cDNA分离1、将约100 μ L经Sfi I酶切的cDNA和二甲苯青的混合物加到CHROMA SPIN-400 柱(Clontech Laboratories, Inc.)胶顶部中心表面。2、用100 μ L的柱子缓冲液清洗含有cDNA的管，再轻倒入胶表面。3、让缓冲液流光，当停止时，继续下一步，让染料层进入胶内几毫米。4、将放有16个管子的架子放在柱子下面，第一个管子正在柱子下的出口。5、加600 μ L的柱子缓冲液，立即开始收集，每管35 μ L (约1滴)，收集后的管子立 即加盖，当都收集完后，盖上柱子的盖子。6、在进行实验前，检查每个管子的组分，在1. 的琼脂糖/EB胶上电泳，每管用 3 μ L连续在点样孔加样，用Ikb DNA Marker作分子量标记，150V电泳10分钟。收集最亮 的3-4个组分到一个新1. 5mL的管中。7、加入 1/10 体积醋酸钠(3M ；pH4. 8)，1. 3 μ L 糖原(20mg/mL)和 2. 5 体积的 95% 乙醇，_20°C过夜。9、室温14000转/分钟离心20分钟。10、小心去上清。11、轻离心，去剩余的上清，干燥约10分钟后溶于7μ L的无离子水。七、cDNA与载体连接
1、按下列组分准备一个连接反应对照(UL)样祝
(UL)
cDNA1. 01. 0
λ TripIEx2 载体(500ng/1. 01. 0
IOX连接酶缓冲液0. 50. 5
ATP(IOmM)0. 50. 5
T4 DNA连接酶(400单位./μ L)0. 50. 5
无离子水1. 51. 5
总体积5. 05. 0
2、轻轻混勻，避免产生气泡，瞬间离心使组分沉到底部，16°C连接过夜
3、对于每一个连接，做一个包装反应。 八、包装反应
1、在每一个连接产物中加入25μ L的包装蛋白。
2、30°C温育90分钟。
3、取出放于4°C冰箱中可保存2周。经过扩增的文库可以在4°C稳定保存6-74
月，或在7%二甲基亚砜中-70°C至少保存1年以上。九、测定滴度从平板中挑取分离良好的单克隆接种到含15mL LB/硫酸镁/麦芽糖培养基的 50mL试管中，140转/分钟震荡37°C培养过夜直至OD值达到2. 0，5000转/分钟离心5分 钟，去上清液，用7. 5mL IOmM硫酸镁重新悬浮沉淀。将包装产物用噬菌体缓冲液稀释5_20 倍，在200 μ L过夜培养的XL-IBlue受体菌中加入1 μ L稀释的噬菌体，让噬菌体在37°C吸 收10-15分钟，再加入2mL溶解的LB/硫酸镁顶层琼脂。快速颠倒混勻并倒入经37°C预热 的LB/硫酸镁平板，快速摇动平板使均勻分布，室温冷却10分钟让顶层琼脂变硬，倒置平板 在37°C培养6-17小时，统计菌斑并根据公式文库滴度(pfu/mL)=(噬菌斑数X稀释倍 数)/受体菌的体积，计算未扩增文库滴度6. 8X105pfu/mL,总克隆数为3. 5 X IO5个。十、文库重组率的测定本文库可以利用X-Gal显色原理测定重组率，在测定滴度时加入IOOmM的IPTG及 IOOmM的X-Gal，过夜培养后，通过蓝斑(未重组克隆)、白斑(重组克隆)的数量计算重组 率为 98. 05%。i^一、cDNA插入片段的PCR鉴定从LB平板上随机挑取15-20个独立的噬菌斑，分别加到含有200 μ L噬菌体缓 冲液的离心管中，37 °C放置1小时后，保存于4°C，利用XTripEX2噬菌体5’ PCR引物 (5，-CTCCGAGATCTGGACGAGCT-3，)和 3' PCR 引物(5，-GGGATATCACTCAG CATAAT-3，)对构 建的文库进行PCR鉴定。PCR结果表明插入片段大多分布在0. 5-2. Okb之间，绝大部分在 1. 0-1. 5kb 左右。实施例2茶树幼根cDNA文库的构建一、幼根总RNA的提取将茶树龙井43的储存种子播种于一定湿度的石英砂中，室温25°C培养室中培养， 待长出幼苗后，取其幼根lOOmg，迅速加液氮冷冻研磨成细粉末状，加入1000 μ L Trizol试剂继续研磨后，再加入1000 μ L Trizol试剂，混勻分装到两个经DEPC (焦炭酸二乙酯)处 理的1. 5mL离心管中，冰上放置5min，各加入200 μ L的氯仿，颠倒混勻，4°C 12000rpm离 心lOmin，取500 μ L上清液，加入等体积异丙醇，上下轻轻颠倒10次，室温放置lOmin，4°C 12000rpm离心lOmin，去上清，沉淀中加入ImL 75%乙醇轻轻清洗，倒去乙醇，干燥后加入 20 μ L经DEPC处理过的ddH20溶解沉淀。甲醛凝胶变性电泳检测RNA质量后于_70°C冰箱 中长期保存，备用。二、mRNA的分离和纯化采用实施例1，“茶树叶片cDNA文库的构建”中的“mRNA的分离和纯化”所描述的 流程、方法分离和纯化幼根mRNA。三、cDNA第一链合成在RNase-free 的 0. 2ml PCR 管中，加入 3 μ L 上面提取的 mRNA，1 μ L 带有 Xho I 酶切位点的引物(5 ‘ -GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ‘)， 8 μ L的RNase-free ddH20。混勻后，70°C反应lOmin，冰上冷却2min，离心把组分收集到底 部，按顺序加入以下试剂4μ L 5Χfirst strand buffer2μ L 0. IM DTT1 μ L dNTP (IOmM)混勻后稍离心，42°C放置2min，反应完成，趁热加入IyL Superscipt II_RT，42°C 反应50min，然后70°C水浴15min灭活反转录酶。四、cDNA第二链的合成第一链反应完成后，取2yL 第一链 cDNA，140yL ddH20, 20 μ L IOXDNA Polymerase I buffer,6y L IOmM dNTP,1 μ L RNase H(2U/μ L)，10 μ M DNA Polymerase Ι(10υ/μ L)，总体系为200 μ L。混勻后，16°C反应2. 5hr，70°C灭活lOmin，反应完成后，得到 200 μ L cDNA第二链反应体系，将此体系置于冰上，取2 μ L 二链产物，同保存的一链产物一 起电泳鉴定。同时上Ikb ladder，确定双链的大小范围。五、双链cDNA末端补平1.在第二链反应体系中，顺序加入下列试剂6μ L dNTP(IOmM)2 μ L T4 DNA Polymerase (8. 7U/ μ L)2μ L BSA(10mg/ml)2.稍微离心混勻反应物，37°C反应至少30min，然后75°C灭活IOmin ；3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇，剧烈振荡后，常温下13000g离心5min ；4.离心后，吸取上清于另一 1. 5ml离心管中，加入等体积氯仿，上下颠倒几次混勻 后，常温下13000g离心5min ；5.吸取上清至新离心管中，加入1/10体积的3M NaAc (PH5. 2)和2. 5倍体积的预 冷的无水乙醇，混勻，_20°C放置过夜以沉淀双链cDNA ；6.将过夜的沉淀物在4°C，13000g离心60min以充分沉淀双链cDNA ；7.离心完毕，弃上清，加入Iml 70%乙醇洗涤沉淀，常温下13000g离心5min ；8.离心完毕，弃上清，干燥沉淀至无乙醇气味。I adaptor(400ng/yL)，4°C 至少放置
0118]六、EcoR I adaptor 力口接
0119]1.往双链cDNA沉淀中加入9yL EcoR 30min以充分溶解cDNA沉淀；
0120]2.溶解完成后，顺序加入下列试剂
0121]1. 2μ L IOXLigase Buffer
0122]1 μ L ATP(IOmM)
0123]1 μ L T4 DNA Ligase (4U/ μ L)
0124]3.混勻后，8°C过夜连接；
0125]七、双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切
0126]1.连接反应完成后，将反应体系在70°C水浴15min，灭活T4 DNA Ligase ；
0127]2.稍微离心使反应物集中至管底，室温下放置5min，然后加入下列试剂
0128]1 μ L IOXLigase Buffer
0129]1 μ L ATP(IOmM)
0130]6 μ L dd H2O
0131]1 μ L T4 PNK (1OU/μ L)
0132]3. 37°C反应 30min 后，70°C灭活 15min ；
0133]4.稍微离心使反应物集中至管底，室温放置5min后，加入下列试剂
0134]4μ L Xho IOXBuffer
0135]2μ L BSA
0136]5 μ L ddH20
0137]8μ L Xho I(10U/y L)
0138]5. 37°C反应 1. 5hr，然后 65°C灭活 IOmin ；
0139]6.反应完成后将双链cDNA回收，然后与同样经Xho I酶切的pBluescript载体连接。
0140]八、cDNA与载体连接
0141]1.按下列组分准备一个连接反应 对照(yL) 样品(yL)
0142]cDNAO6.5
0143]ddH206.5O
0144]IOXligase buffer1. O1. O
0145]ATP(IOmM)1. O1. O
0146]pBluescript vector1.O1.O
0147]T4 DNA ligase (4U/μ L)1. O1. O
0148]总体积10.010.0
0149]2.轻轻混勻，避免产生气泡，瞬间离心使组分沉到底部，12°C连接过夜。
0150]3.将连接产物在纯化膜上纯化一个半小时，然后吸到一个新的PCR管里，_20°C保 存备用。
0151]九、电转化
0152]1.从-80°C冰箱中取出制备好的感受态细胞，置于冰上解冻；
0153]2.取1 μ L纯化后的连接产物于1. 5ml的离心管中，将其和0. ICM的电极杯一起置于冰上预冷；3.将40 μ L解冻的感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，小心混勻，冰上放置 IOmin ；4.打开电转仪，调节电压为2. IKV ；5.将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均勻进入电极 杯的底部；6.将电极杯推入电转化仪，按下pulse键，听到蜂鸣后，向电击杯中迅速加入 500 μ L的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1. 5ml的离心管中；7.将离心管置于37°C，220rpm复苏1小时；8.取20 μ L转化产物加160 μ L SOC涂板，放于37°C过夜培养；9.其余菌液加1 1的30%甘油后，混勻_80°C保存。十、文库重组率的测定利用X-Gal显色原理测定重组率，在测定滴度时加入IOOmM的IPTG及IOOmM的 X-Gal过夜培养后，通过蓝斑(未重组克隆)、白斑(重组克隆)的数量计算重组率。实施例3，茶树叶片及幼根表达序列标签测序以前面构建的茶树叶片cDNA文库和茶树幼根cDNA文库为测序EST的文库来源， 采用自动测序仪Megabace 1000对龙井43新梢cDNA文库的4320个克隆进行随机测序 分析，获得有效序列2963个，将所有有效序列进行去重复和拼接后获得新梢表达序列标签 1692个；对幼根cDNA文库的5115个克隆进行随机测序分析，获得有效序列4833个，大部 分序列长度在300bp-700bp之间，平均长度474bp，将所有有效序列进行去重复和拼接后获 得幼根表达序列标签3482个。将得到的所有非冗余序列与GenBank的蛋白质数据库进行 BlastX比对分析，结果与已知防卫病、虫等生物胁迫及干旱、寒冷等非生物胁迫相关基因 200多个、还含有大量与已知拟境相关转录因子和信号转导基因、以及在能量代谢、基础代 谢中起作用的关键基因。最后选取了 1692条叶片表达序列标签和3174条幼根表达序列标 签用作芯片探针。实施例4，芯片的制备一、探针的制备将1692条叶片表达序列标签和3174条幼根表达序列标签对应的克隆挑选出来， 重新排列后，摇菌并提取质粒，以此为模板PCR扩增目的片段，将PCR扩增得到的两部分序 列用乙醇沉淀法进行纯化，测定浓度后，定量到250ng/ μ L，取10 μ L转移到384孔板上。二、外标基因片段的制备选取了酿酒酵母基因间的8段序列(编号为Υ1-Υ8)，经过序列同源性的BLAST比 对，这8段核酸序列和NCBI上所有已知的核酸序列都没有同源性。把这8段序列以酵母 基因组DNA为模板经过PCR扩增出来，然后把此8段核酸序列克隆到以下带有PolyA的 pSP64Poly(A)质粒载体中，通过体外转录的方法制备外标核酸序列对应的PolyA-RNA。把 此PolyA-RNA按照不同比例的数量掺入到实验样品的RNA中去，一同进行标记、杂交。在芯 片上也点有外标核酸DNA序列，因此杂交后，在芯片上外标DNA序列对应的点就会有杂交信 号，并且通过调节掺入PolyA-RNA的量而得到外标的不同杂交信号。三、芯片的点制
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取5yL纯化产物，加5yL 2XDNA点样液至384孔板中，用博奥生物有限公司的 SmartArrayerTM-48型点样仪点样，矩阵设计为48小围栏分布方式(图1)。所有矩阵的设 计完全相同。每个矩阵的排列方式为18x20，每点重复3次。其中第一排1 15个序列点 为内参，第一排16 18个序列点为阳性对照序列点，第二排1 3个序列点为阴性对照序 列点，第二排4 18个序列点和第三排1 9个序列点为外标，其余为茶树表达序列标签 序列，如图2所示。实施例5用本发明的基因芯片检测安吉白茶不同白化阶段的基因表达差异一、实验材料准备及RNA的提取分别于2008年4月1号、11号、24号、30号和6月13号采摘白茶不同白化阶段的 的茶树叶片，液氮处理后，保存于_70°C冰箱中备用。Trizol—步法提取叶片总RNA，通过异 丙醇沉淀法浓缩RNA，并进一步采用NucleoSpinRNA clean-up试剂对总RNA进行过柱纯 化，最后用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检。检测结果显示样本RNA电泳条带清晰， 28S比18S rRNA条带亮度接近1 1，质量合格，总量够用，可进行芯片实验。二、芯片杂交设计将提取好的5份样品组成具有可比性的4组，分别为BC4-11 vs BC4_1、BC4_24 vs BC4-UBC4-30 vs BC4-1和BC6-13 vs BC4-1，进行芯片比较实验。在同一张芯片上杂交的 两个样品分别用二种不同的荧光染料进行标记，并设计荧光交换以保证试验准确性。三、对样品RNA进行荧光标记以Total RNA为起始，含有T7启动子序列的T7 Oligo (dT) Primer为引物，使 用CbcScript酶合成lst_strand cDNA,用RNase H将杂合链中的RNA切成短片段，DNA Polymerase以RNA短片段为引物延伸，合成2nd-strand cDNA，并纯化双链cDNA。以cDNA为 模板，利用 T7 Enzyme Mix 合成 cRNA ；然后用 RNA Clean-up Kit(MN)纯化。取 2yg cRNA, 用 CbcScript II 酶，Random Primer 进行反转录，反转录产物用 PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化。取上述反转录产物，以Random Primer为引物进行KLENOW酶标记，标记产物 用 PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化，纯化后抽干。四、杂交与清洗标记的DNA溶于80 μ 1杂交液中，于42°C杂交过夜。杂交结束后，先在42°C左右 含0.2% SDS，2XSSC的液体中洗5min，而后在0. 2XSSC中室温洗5min。玻片甩干后用 LuxScan IOKA双通道激光扫描仪进行扫描。五、数据采集及分析采用LuxScan 3. O图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信 号；采用Lowess方法对芯片数据进行归一化；并删除了荧光信号弱的基因以及芯片上的阴 性对照、内标、外标等冗余的数据。根据归一化后的结果得到每张芯片中基因的ratio值， 再将两张荧光交换芯片的ratio值整合，ratio = (ratiol*ratio2) "0. 5，用SAM软件进行 分析，再以上调或下调1. 5倍标准筛选差异表达基因。结果显示6月13号和4月1号的叶 片杂交结果中，检测到差异表达的基因580个，其中上调427个，下调153个；4月30号和4 月1号的叶片杂交结果中，检测到差异表达的基因427个，其中上调304，下调123 ；4月24 号和4月1号的叶片杂交结果中，检测到差异表达的基因337个，其中上调122，下调215 ； 4月11号和4月1号的叶片杂交结果中，检测到差异表达的基因337个，其中上调14，下调67(图3)。6月13号的复绿叶片与4月1号的白化叶片之间得到了最多的显著差异表达 基因，其中光和作用相关基因49个、碳固定相关基因24个，还有多个逆境防卫基因、次生代 谢途径基因、转录相关基因等。以上结果表明本发明的芯片具有足够量的探针，可检测到大 量差异表达基因，灵敏度较高，可用于快速、批量检测茶树特异品种不同生长发育阶段、不 同组织器官乃至特异细胞中的基因表达谱，以及茶树在生物或非生物胁迫下的基因表达信 息、筛选差异基因。
权利要求
一种茶树表达序列标签构成的基因芯片，其特征在于该基因芯片以茶树表达序列标签作为探针，由序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.4866序列的探针组成。诸序列点所对应代表的EST编号及其对应的矩阵号1～48；列号1～18；行号1～20；即，该4866个序列点排布在平行的48个矩阵单元中，每个序列点设三个重复；该芯片中的每序列点是以100～1000个连续的核苷酸为探针的序列和/或同源序列和/或其互补序列。
2.根据权利要求1所述茶树表达序列标签构成的基因芯片，其特征在于所述的每个 矩阵，其第一排1 15个序列点为内参，第一排16 18个序列点为阳性对照序列点，第二 排1 3个序列点为阴性对照序列点，第二排4 18个序列点和第三排1 9个序列点为 外标。
3.根据权利要求2所述茶树表达序列标签构成的基因芯片，其特征在于所述的内参， 其是 5 个茶树看家基因，即TC0024H07，TC0038D06，TC0047B06，TL004D11，TC0011C07，其基 因序列如SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 5所示。
4.根据权利要求2所述茶树表达序列标签构成的基因芯片，其特征在于所述的阴性 对照序列点为空白点样液，即50% DMS0。
5.根据权利要求1所述茶树表达序列标签构成的基因芯片，其特征在于所述的适合 的载体是固相载体，其或为玻片，或为硅片，或为尼龙膜，或为硝酸纤维膜。
6.根据权利要求1所述茶树表达序列标签构成的基因芯片，其特征在于所述的核苷 酸，其是脱氧核糖核酸，和/或核糖核酸，和/或多聚寡核苷酸。
全文摘要
本发明公开了一种茶树表达序列标签构成的基因芯片。该基因芯片以茶树表达序列标签作为探针，由序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.4866序列的探针组成。本发明不仅可用于批量检测不同茶树品种在生物或非生物胁迫下的基因表达信息、筛选差异基因，还可用于构建茶树品种不同生长阶段、不同组织器官乃至特异细胞中的基因表达谱。应用该芯片可实现基因表达信息的高通量检测，且操作方便、安全，检测结果可靠、有效，可节省大量时间、人力、物力和财力，具有广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK101942514SQ20101026948
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者姚明哲, 王新超, 金基强, 陈亮, 马春雷 申请人:中国农业科学院茶叶研究所