专利名称：木聚糖酶、编码木聚糖酶的核酸以及制备和应用它们的方法
技术领域：
本发明总体上涉及酶、编码所述酶的多聚核苷酸、这样的多聚核苷酸和多肽的 应用，更具体地，是涉及具有木聚糖酶活性的酶，例如催化内部β_1，4-木糖苷键(β-1， 4-xylosidic linkage)或内-β 4_葡聚糖酶键(endo-β 4-glucanase linkages)的 水解的酶。
背景技术：
木聚糖酶(例如，内-1，4_β-木聚糖酶，EC 3. 2. 1.8)水解木聚糖中的内部β-1， 4_木糖苷键，产生更小分子量的木糖和木糖寡聚体。木聚糖是由1，4-β-糖苷-连接的 D-吡喃木糖形成的多糖。木聚糖酶具有很重要的商业价值，用于食品工业中的面包焙烤和 水果蔬菜加工，还在动物饲料的生产和纸浆生产和造纸中用于农业废物的分解。木聚糖酶 可由真菌和细菌形成。阿拉伯糖基木聚糖是谷类的主要的非淀粉类多糖，根据品种和生长条件，其含量 为2.5-7. l%w/w。这种多糖的物化性质为在氧化条件下可产生粘状溶液或甚至凝胶。另 外，阿拉伯糖基木聚糖具有很高的水结合能力，在蛋白泡沫的稳定性中具有一定的作用。对 于一些工业包括酿造、焙烤、动物营养和造纸工业，所有这些特性都带来了问题。在酿造应 用中，木聚糖的存在可导致麦芽汁过滤性(wort filterability)和混浊形成的问题(haze formation issues) 0在焙烤应用中(特别是甜饼和饼干)，这些阿拉伯糖基木聚糖产生粘 性的面团，这使得难以加工和减小饼干的大小。另外，这种糖与烘制品的迅速再水化有关， 引起脆性的丢失和保存期限的缩短。对于利用谷类食物的单胃动物饲料应用，阿拉伯糖基 木聚糖是肠道内容物的粘度的主要贡献性因素，因此对饲料的消化率和动物生长速率有负 面影响。对于反刍动物，这些多糖代表了摄入纤维的实质性成分，阿拉伯糖基木聚糖的更完 全消化有助于更高的饲料转化效率。木聚糖酶目前在面团加工中用作添加剂(面团性质改进剂)以水解水溶性的阿拉 伯糖基木聚糖。在焙烤应用中(特别是甜饼和饼干)，这些阿拉伯糖基木聚糖产生粘性的面 团，这使得难以加工和减小饼干的大小。另外，这种糖与烘制品的迅速再水化有关，引起脆 性的丢失和保存期限的缩短。增强动物饲料中木聚糖的消化可改善有价值的碳水化合物和蛋白饲料营养物质的可利用度和可消化性。对于利用谷类食物的单胃动物饲料应用，阿拉伯糖基木聚糖是肠 道内容物的粘度的主要贡献性因素，因此对饲料的消化率和动物生长速率有负面影响。对 于反刍动物，这些多糖代表了摄入纤维的实质性成分，阿拉伯糖基木聚糖的更完全消化有 助于更高的饲料转化效率。希望动物饲料的木聚糖酶在动物胃中能够保持活性。这需要饲 料酶在37°C，单胃动物的低pH(pH 2-4)和反刍动物的近中性pH(pH 6. 5-7)下具有很高活 性。该酶也应该具有对动物肠木聚糖酶的抵抗性，并在饲料粒化过程的更高温度下具有稳 定性。正是如此，在本领域中需要单胃动物饲料的具有高度特异活性的木聚糖酶饲料添加 剂，其在35-40°C和pH 2-4时具有活性，在SGF中半衰期超过30分钟，在剂型状态中在85°C 时的半衰期> 5分钟。对于反刍动物饲料，需要具有很高特异活性的木聚糖酶饲料添加剂， 其在35-40°C和pH 6. 5-7. 0时具有活性，在SRF中半衰期超过30分钟，具有如浓缩干粉的 稳定性。木聚糖酶也可用于其它的大量应用中。例如，木聚糖酶可用于改善泌乳母牛中 产生的乳蛋白的质量和数量(见，例如，Kung, L.等人，T.Dairy Science, 2000年1月, 83 :115-122)，可用于增加在猪的胃内和小肠内的可溶性糖类的数量(见，例如，van der Meulen，J.等人，Arch. Tieremahr, 200154 :101_115)，改善母鸡晚期蛋的生产效率和蛋的 产量(见，例如，Jaroni, D.等人，Poult. Sci.，1999 年 6 月，78 :841_847)。另外，已经显 示木聚糖酶可用于化学纸浆的生物漂白和处理(见，例如，美国专利5，202，249)，可用于 木材或纸浆的生物漂白和处理(见，例如，美国专利5，179，021、5，116，746、5，407，827、 5，405，769,5，395，765,5，369，024,5，457，045,5，434，071,5，498，534,5，591，304, 5，645，686,5, 725，732,5, 759，840,5, 834，301,5, 871，730 和 6，057，438)，可用于降低在 木材和改良木材中的木素(见，例如，美国专利5，486，468和5，770，012)，可用作面粉、面 团和面包改进剂(见，例如，美国专利5，108，765和5，306，633)，可用作饲料添加剂和/ 或补充物，如上所述(见，例如，美国专利5，432，074,5, 429，828,5, 612，055,5, 720，971、 5，981，233,5, 948，667,6, 099，844,6, 132，727 和 6，132，716)，可用于制造纤维素溶液(见， 例如，美国专利5，760，211)。具有木聚糖酶活性的去垢剂组合物可用于水果、蔬菜和/或泥 浆和粘土化合物(见，例如，美国专利5，786，316)。为了制造治疗和/或预防球虫病的试剂，木聚糖酶也可用于糖酶和/或木聚糖 酶的组合物和应用方法中。制造的试剂可以是基于谷物的动物饲料的形式(见，例如，美 国专利5，624，678)。木聚糖酶的其它应用包括用于生产水溶性饮食纤维(见，例如，美 国专禾Ij 5，622，738)，改善淀粉的过滤性、分离和生产(见，例如，美国专利4，960，705和 5，023，176)，在饮料工业中改善麦芽汁或啤酒的过滤性(见，例如，美国专利4，746，517)， 促进家畜泌乳和改善乳质量的酶组合物(见，例如，美国专利4，144，354)，降低植物材料 的粘度(见，例如，美国专利5，874，274)，增加食品如果酱、桔子酱、果冻、果汁、浆糊、汤、 调味汁等的粘度或胶强度(见，例如，美国专利6，036，981)。木聚糖酶也可用于对其具 有选择性的半纤维素的水解，特别是在存在纤维素的情况下。另外，富纤维素酶的滞留物 (cellulase rich retentate)适合进行纤维素的水解(见，例如，美国专利4，725，544)。木聚糖酶的多种应用包括生产乙醇(见，例如，PCT申请W00043496和 W08100857)，对产乙醇微生物进行转化(见，例如，PCT申请W099/46362)，生产酒类鞣酸 和酶组合物(见，例如，PCT申请W00164830)，刺激植物的天然防御(见，例如，PCT申请W00130161)，从半纤维素底物中产生糖类(见，例如，PCT申请W09203541)，清洗水果、蔬 菜、土壤泥浆或粘土(见，例如，PCT申请W09613568)，清洗啤酒滤膜(见，例如，PCT申请 W09623579)，杀死或抑制微生物细胞的方法(见，例如，PCT申请W09732480)，通过使用两种 UV吸收测定的比值和比较该光谱来确定木质纸浆漂洗中工艺用水的特性(见，例如，PCT申 it W09840721)。关于用于纸张和纸浆工业中的木聚糖酶，已经从许多来源分离了木聚糖酶。特别 地，参见美国专利6，083，733和6，140，095和6，346，407。特别地，注意美国专利6，140，095 提出了耐受碱的木聚糖酶。但是，要注意在本领域仍需要可用于纸张和纸浆工业的木聚糖 酶，其中该酶在65°C至75°C的温度范围内和大约10的pH是有活性的。另外，本发明的用 于纸张和纸浆工业的酶将降低对漂洗化学物质，如二氧化氯的需求。在此讨论的出版物被提供，仅仅是显示了它们先于本发明申请日的公开。并不能 凭借在此的任何内容认为本发明没有资格先于在前发明的那些公开内容。发明概述本发明提供了分离出的或重组的核酸，其包括与本发明的示例性核酸例如SEQID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO: 13、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :47、 SEQ ID NO 49, SEQ ID N0:51、SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO 57, SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO -JrJ、SEQ ID NO :79、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO :89、SEQ ID NO :91、SEQ ID NO :93、 SEQ ID NO 95, SEQ ID NO : 97、SEQ ID NO : 99、SEQ ID NO =IOUSEQ ID NO 103, SEQ ID NO: 105,SEQ ID NO 107,SEQ ID NO 109,SEQ ID NO =IlUSEQ ID NO :113、SEQ ID NO : 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119、SEQID NO: 121、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO :129、SEQ ID NO :131、SEQ ID NO :133、SEQ ID NO :135、SEQ ID NO :137、 SEQ IDNO :139、SEQ ID NO :141、SEQ ID NO :143、SEQ ID NO :145、SEQ ID NO :147、SEQID NO :149、SEQ ID NO :151、SEQ ID NO :153、SEQ ID NO :155、SEQ ID NO :157、SEQ ID NO 159,SEQ ID NO 161,SEQ ID NO 163,SEQ ID NO 165,SEQ IDNO 167,SEQ ID NO 169,SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 175、SEQID NO: 177、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO :183、SEQ ID NO :185、SEQ ID NO :187、SEQ ID NO :189、SEQ ID NO :191、 SEQ ID NO193,SEQ IDNO 195,SEQ ID NO197,SEQ ID NO 199,SEQ ID N0:201、SEQ ID NO :203,SEQID NO :205、SEQ ID NO :207、SEQ ID NO :209、SEQ ID NO :211、SEQ ID NO :213、 SEQ ID N0:215、SEQ ID N0:217、SEQ ID N0:219、SEQ ID N0:221、SEQ IDNO 223, SEQ ID NO 225,SEQ ID NO :227、SEQ ID NO :229、SEQ ID NO :231、SEQID NO :233、SEQ ID NO :235、 SEQ ID NO 237,SEQ ID NO :239、SEQ ID NO :24USEQ ID NO 243,SEQ ID NO 245,SEQ ID NO 247,SEQ ID NO :249、SEQ IDNO :251、SEQ ID NO :253、SEQ ID NO :255、SEQ ID NO :257、 SEQ ID NO :259、SEQID N0:261、SEQ ID NO 263,SEQ ID NO :265、SEQ ID NO267,SEQ ID NO269,SEQ ID N0:271、SEQ ID NO 273,SEQ ID NO275,SEQ ID NO :277、SEQ ID
NO: 279、SEQ ID NO 281、SEQ ID NO 283、SEQ ID NO 285、SEQ ID NO 287、SEQID NO :289、SEQ ID NO :291、SEQ ID NO :293、SEQ ID NO :295、SEQ ID NO :297、SEQ ID NO 299、SEQ ID NO 301、SEQ ID NO :303、SEQ ID NO :305、SEQ IDNO :307、SEQ ID NO :309、 SEQ ID N0:311、SEQ ID N0:313、SEQ ID NO :315、SEQID N0:317、SEQ ID N0:319、SEQ ID NO :321、SEQ ID NO :323、SEQ ID NO :325、SEQ ID NO :327、SEQ ID NO :329、SEQ ID NO 33USEQ ID NO 333,SEQ IDNO :335,SEQ ID NO 337,SEQ ID NO 339,SEQ ID NO :34USEQ ID NO343,SEQID NO : 345、SEQ ID NO347,SEQ ID NO : 349、SEQ ID N0:351、SEQ ID NO: 353、SEQ ID NO :355、SEQ ID NO :357、SEQ ID NO :359、SEQ ID NO :361、SEQ IDNO :363、 SEQ ID NO: 365、SEQ ID NO: 367、SEQ ID NO: 369、SEQ ID NO: 371、SEQID NO: 373、SEQ ID NO 375,SEQ ID N0:377 或 SEQ ID NO :379 在至少大约 10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、 100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、 1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、 1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500 或更多残 基的范围内具有至少大约 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%, 61 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81%, 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多或完全(100%)的序列同一性 (identity)的核酸序列，编码至少一个具有木聚糖酶活性的多肽，所述的序列同一性是通 过采用序列比较算法的分析或通过观察检验(visual inspection)来确定的。本发明的示例性核酸也包括编码具有如SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ IDNO 6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ IDNO : 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ IDNO :26、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34、SEQ IDNO :36、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :44、SEQ IDNO :46、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :52、 SEQ ID NO :54、SEQ IDNO :56、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO 64,SEQ IDNO 66,SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :74、SEQ IDNO 76、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :84、SEQ IDNO :86、SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :90、SEQ ID NO :92、SEQ ID NO :94、SEQ IDNO :96、SEQ ID NO :98、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 104、SEQID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO :112、SEQ ID NO :114、SEQ ID NO :116、SEQ ID NO :118、SEQ ID NO :120、 SEQ ID NO: 122、SEQ IDNO : 124、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO 132,SEQID NO 134,SEQ ID NO :136、SEQ ID NO 138,SEQ ID NO 140,SEQ ID N0:142、 SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 150、SEQ IDNO : 152、SEQ ID NO 154,SEQ ID NO 156,SEQ ID NO :158、SEQ ID NO 160,SEQID NO 162,SEQ ID NO : 164、 SEQ ID NO 166,SEQ ID NO 168,SEQ ID NO 170,SEQ ID NO 172,SEQ ID NO 174,SEQ ID NO 176,SEQ ID NO 178,SEQ IDNO : 180、SEQ ID NO 182,SEQ ID NO 184,SEQ ID N0:186、 SEQ ID NO 188, SEQID NO 190, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 194, SEQ ID NO 196, SEQ ID NO 198,SEQ ID NO :200、SEQ ID NO :202、SEQ ID NO :204、SEQ ID NO :206、SEQ IDNO :208、 SEQ ID N0:210、SEQ ID NO :212、SEQ ID N0:214、SEQ ID NO :216、SEQID N0:218、SEQ IDNO :220、SEQ ID NO :222、SEQ ID NO :224、SEQ ID NO :226、SEQ ID NO :228、SEQ ID NO 230,SEQ ID N0:232、SEQ ID NO 234、SEQ IDNO 236、SEQ ID NO 238、SEQ ID NO 240、SEQ ID NO 242,SEQ ID NO :244、SEQID NO246,SEQ ID NO 248,SEQ ID NO250,SEQ ID NO: 252、SEQ ID NO :254、SEQ ID NO :256、SEQ ID NO :258、SEQ ID NO :260、SEQ ID NO :262、 SEQ IDNO :264、SEQ ID NO :266、SEQ ID NO :268、SEQ ID NO :270、SEQ ID NO :272、SEQID NO :274、SEQ ID NO :276、SEQ ID NO :278、SEQ ID NO :280、SEQ ID NO :282、SEQ ID NO 284,SEQ ID NO 286、SEQ ID NO 288、SEQ ID NO 290、SEQ IDNO 292、SEQ ID NO 294、SEQ ID NO 296,SEQ ID NO 298,SEQ ID NO 300,SEQ ID NO 302,SEQ ID NO 304,SEQ ID NO: 306、SEQ ID NO :308、SEQ ID NO :310、SEQ ID NO :312、SEQ ID NO :314、SEQ ID NO :316、 SEQ ID N0:318、SEQ IDNO 320,SEQ ID NO 322,SEQ ID NO 324,SEQ ID NO326,SEQ ID N0:328、SEQID NO 330、SEQ ID NO 332、SEQ ID NO 334、SEQ ID NO 336、SEQ ID NO 338、 SEQ ID NO 340, SEQ ID NO 342, SEQ ID NO 344, SEQ ID NO 346, SEQ IDNO 348, SEQ ID NO 350,SEQ ID NO 352、SEQ ID NO 354、SEQ ID NO :356、SEQID NO 358、SEQ ID NO 360、 SEQ ID NO 362,SEQ ID NO 364、SEQ ID NO 366、SEQ ID NO 368、SEQ ID NO 370、SEQ ID NO :372、SEQ ID NO :374、SEQ IDNO :376、SEQ ID NO 378 或 SEQ ID NO 380 所示序列及其 子序列(subsequences)和其变异体的多肽的分离出的或重组的核酸。一个方面，所述多肽 具有木聚糖酶活性。 在一个方面，本发明也提供了具有共同的新颖性的编码木聚糖酶的核酸，因为它 们都来自混合培养物。本发明提供了从混合培养物中分离出的编码木聚糖酶的核酸，其包 括与本发明的示例性核酸例如 SEQ ID NO =USEQ ID NO :3、SEQ IDNO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 13,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 17,SEQ ID NO 19,SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、 SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO :4U SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :77、 SEQ ID NO 79, SEQ ID N0:81、SEQ ID NO 83, SEQ ID NO 85, SEQ ID NO 87, SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO :91、SEQ ID NO :93、SEQ ID NO :95、SEQ ID NO :97、SEQ ID NO :99、SEQ ID NO 101,SEQ ID NO : 103、SEQ ID NO : 105、SEQ ID NO : 107、SEQ ID NO 109,SEQ ID NO :111、 SEQ ID NO: 113、SEQ IDNO : 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO 123,SEQID NO 125,SEQ ID NO 127,SEQ ID NO :129、SEQ ID NO :131、SEQ ID N0:133、 SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 141、SEQ IDNO : 143、SEQ ID NO 145,SEQ ID NO 147,SEQ ID NO 149,SEQ ID NO :151、SEQID NO 153,SEQ ID N0:155、 SEQ ID NO 157,SEQ ID NO 159,SEQ ID NO 161,SEQ ID NO 163,SEQ ID NO 165,SEQ ID NO 167,SEQ ID NO : 169、SEQ IDNO :171、SEQ ID NO 173,SEQ ID NO 175,SEQ ID N0:177、 SEQ ID NO: 179、SEQID NO: 181、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO 189,SEQ ID N0:191、SEQ ID NO : 193、SEQ ID NO : 195、SEQ ID NO 197,SEQ IDNO :199、 SEQ ID NO :20USEQ ID NO :203、SEQ ID NO 205, SEQ ID NO :207、SEQID NO 209, SEQ ID NO :211、SEQ ID NO :213、SEQ ID NO :215、SEQ ID NO :217、SEQ ID NO :219、SEQ ID NO 22USEQ ID NO 223,SEQ ID NO :225、SEQ IDNO 227,SEQ ID NO 229,SEQ ID NO :23USEQ ID NO233,SEQ ID NO :235、SEQID NO237,SEQ ID NO 239、SEQ ID N0:241、SEQ ID NO: 243,SEQ ID NO 245、SEQ ID NO 247、SEQ ID NO :249、SEQ ID NO :251、SEQ ID NO :253、SEQ IDNO :255、SEQ ID NO :257、SEQ ID NO :259、SEQ ID NO : 261、SEQ ID NO :263、SEQID NO 265、SEQ ID NO :267、SEQ ID NO :269、SEQ ID NO :271、SEQ ID NO :273、SEQ ID NO :275、 SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 281、SEQ IDNO : 283、SEQ ID NO: 285、SEQ ID NO 287,SEQ ID NO :289、SEQ ID NO :291、SEQID NO :293、SEQ ID NO :295、SEQ ID NO :297、 SEQ ID NO 299,SEQ ID NO :30USEQ ID NO 303,SEQ ID NO :305,SEQ ID NO 307,SEQ ID NO 309,SEQ IDN0:311、SEQ ID NO :313、SEQ ID NO :315、SEQ ID NO :317、SEQ ID NO :319、 SEQID N0:321、SEQ ID NO:323、SEQ ID NO325,SEQ ID NO :327、SEQ ID NO329,SEQ ID NO :33USEQ ID NO :333、SEQ ID NO :335、SEQ ID NO :337、SEQ IDNO :339、SEQ ID NO :341、 SEQ ID NO: 343、SEQ ID NO: 345、SEQ ID NO: 347、SEQID NO: 349、SEQ ID NO: 351、SEQ ID NO 353,SEQ ID NO :355、SEQ ID NO :357、SEQ ID NO :359、SEQ ID NO :361、SEQ ID NO :363、 SEQ ID NO 365,SEQ IDNO :367、SEQ ID NO 369,SEQ ID NO :37U SEQ ID NO373,SEQ ID NO :375、SEQID NO :377 或 SEQ ID NO :379 在至少大约 50、75、100、150、200、250、300、350、 400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150 或更多个残 基的范围内具有至少大约 10、15、20、25、30、35、40、45、50%、51%、52%、53%、54%、55%、 56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%, 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多或 完全(100% )的序列同一性的核酸序列。在一个方面，本发明也提供了具有共同的新颖性的编码木聚糖酶的核酸，因为它 们都来自于环境来源，例如混合的环境来源、细菌来源和/或古细菌来源，见下面的表3。 在一个方面，本发明提供了从环境来源例如混合的环境来源、细菌来源和/或古细菌来源 分离出的编码木聚糖酶的核酸，其包括与本发明的示例性核酸在至少大约50、75、100、150、 200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、 1100,1150,1200或更多个残基的范围内具有至少大约10、15、20、25、30、35、40、45、50%、 51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 62%,63%,64%,65%, 66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%, 81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%或更多或完全(100%)的序列同一性的核酸序列，其中所述的核酸 编码至少一种具有木聚糖酶活性的多肽，所述的序列同一性是通过采用序列比较算法的分 析或通过观察检验来确定的。在一个方面，本发明也提供了具有共同的新颖性的编码木聚糖酶的核酸，因为它 们来自一个公同的糖苷酶家族，例如在下面图5中所示的家族5、6、8、10、11、26或30。在一个方面，所述的序列比较算法是BLAST 2. 2. 2版算法，其中过滤设置设为 blastall-p blastp-d "nr pataa”_F F，其它所有选项都设为默认值。本发明的另一个方面是分离出的或重组的核酸，其包括本发明的核酸序列的至少 10个连续碱基，与其实质上相同的(substantially identical)序列和与其互补的序列。
在一个方面，所述木聚糖酶活性包括催化内部β-1，4_木糖苷键(internal ^-l,4-xylosidic linkages)的水解。在一个方面，所述木聚糖酶活性包括内_1，4_β -木 聚糖酶(endo-0-l，4-xylanase)活性。在一个方面，所述木聚糖酶活性包括水解木聚糖以产生更小分子量的木糖和木糖 寡聚体。在一个方面，木聚糖包括阿拉伯糖基木聚糖，如水溶性阿拉伯糖基木聚糖。水溶性 阿拉伯糖基木聚糖可以构成面团或面包制品。在一个方面，所述木聚糖酶活性包括水解含有1，4_β _糖苷连接的D-吡喃木糖的 多糖。在一个方面，所述木聚糖酶活性包括水解半纤维素。在一个方面，所述木聚糖酶活性 包括水解在木材或纸浆或纸制品中的半纤维素。在一个方面，本发明提供了减少木材或木 制品中木素的方法，包括将木材或木制品与本发明的多肽接触。在一个方面，所述木聚糖酶活性包括催化饮料或饲料或食品中木聚糖的水解。饲 料或食品包括基于谷类的动物饲料、麦芽汁或啤酒、乳或乳制品、水果或蔬菜。在一个方面， 本发明提供了包含本发明的多肽的食物、饲料或饮料或饮料前体。食物可以是面团或面包 制品。饮料或饮料前体可以是啤酒或麦芽汁。在一个方面，本发明提供了面团改良的方法，包括将面团或面包制品与本发明的 至少一种多肽在足以改良面团的条件下接触。在一个方面，本发明提供了生产饮料的方法， 包括在足以降低饮料粘度的条件下将本发明的至少一种多肽应用于饮料或饮料前体中。在一个方面，所述木聚糖酶活性包括在细胞例如植物细胞或微生物细胞中催化木 聚糖的水解。在一个方面，所述的分离出的或重组的核酸编码具有热稳定的木聚糖酶活性的多 肽。所述多肽在一定条件下可保留木聚糖酶活性，所述条件包括大约37°C至大约95°C、大 约55°C至大约85°C、大约70°C至大约95°C或大约90°C至大约95°C的温度范围。另一个方面，所述的分离出的或重组的核酸编码具有耐热的木聚糖酶活性的多 肽。在暴露于超过37°C至大约95°C的温度或超过55°C至大约85°C的任何温度后，所述多 肽仍可保留木聚糖酶活性。在暴露于大约1°C至大约5°C、大约5°C至大约15°C、大约15°C 至大约25°C、大约25°C至大约37°C、大约37°C至大约95°C、大约55°C至大约85°C、大约 70°C至大约75°C、或大约90°C至大约95°C或更多范围的温度后，所述多肽仍保留木聚糖酶 活性。在一个方面，在暴露于超过90°C至大约95°C的温度后，在pH 4. 5的多肽仍保留木聚 糖酶活性。本发明提供了分离出的或重组的核酸，其包括在严紧条件(stringent conditions)下可与含有本发明序列的核酸杂交的序列，所述的本发明序列例如在SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:19、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :35、 SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO :4U SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO -JrJ、SEQ ID NO :79、SEQ ID NO :81、 SEQ ID NO 83,SEQ ID NO85,SEQ ID NO 87,SEQ ID NO 89,SEQ ID N0:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO :95、SEQ ID NO :97、SEQ ID NO :99、SEQ ID NO :101、SEQ ID NO :103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 109、SEQ IDNO 111、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115,SEQ ID NO 117,SEQ ID NO : 119、SEQID NO 121,SEQ ID NO 123,SEQ ID NO : 125、SEQ ID NO 127,SEQ ID NO 129,SEQ ID NO 131,SEQ ID NO 133,SEQ ID NO 135,SEQ ID NO: 137、SEQ IDNO :139、SEQ ID NO :141、SEQ ID NO :143、SEQ ID NO :145、SEQ ID NO :147、 SEQID NO: 149、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO 159,SEQ ID N0:161、SEQ ID NO :163、SEQ ID NO 165,SEQ IDNO 167,SEQ ID N0:169、 SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 175、SEQID NO: 177、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO :181、SEQ ID NO :183、SEQ ID NO :185、SEQ ID NO :187、SEQ ID NO :189、SEQ ID NO 19USEQ ID NO 193,SEQ IDNO 195,SEQ ID NO 197,SEQ ID NO 199,SEQ ID NO :20USEQ ID NO:203、SEQID NO 205,SEQ ID NO207,SEQ ID NO 209,SEQ ID N0:211、SEQ ID NO: 213,SEQ ID N0:215、SEQ ID NO :217、SEQ ID NO :219、SEQ ID NO :221、SEQ IDNO :223、SEQ ID NO225,SEQ ID NO :227、SEQ ID NO229,SEQ ID NO :231、SEQID NO 233,SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO :237、SEQ ID NO :239、SEQ ID NO :241、SEQ ID NO :243、SEQ ID NO :245、 SEQ ID NO 247,SEQ ID NO 249,SEQ IDNO 25U SEQ ID N0:253、SEQ ID NO255,SEQ ID NO 257,SEQ ID NO :259、SEQID NO :261、SEQ ID NO :263、SEQ ID NO :265、SEQ ID NO :267、 SEQ ID NO :269、SEQ ID NO :271、SEQ ID NO :273、SEQ ID NO :275、SEQ ID NO :277、SEQ IDNO :279、SEQ ID NO : 281、SEQ ID NO :283、SEQ ID NO :285、SEQ ID NO :287、SEQID NO 289、SEQ ID NO :291、SEQ ID NO :293、SEQ ID NO :295、SEQ ID NO :297、SEQ ID NO :299、 SEQ ID NO :30USEQ ID NO 303, SEQ ID NO 305, SEQ IDNO :307、SEQ ID NO 309, SEQ ID N0:311、SEQ ID NO :313、SEQ ID NO :315、SEQID NO :317、SEQ ID NO :319、SEQ ID NO :321、 SEQ ID NO :323、SEQ ID NO :325、SEQ ID NO :327、SEQ ID NO :329、SEQ ID NO :331、SEQ ID NO :333,SEQ IDNO335,SEQ ID NO :337,SEQ ID NO 339,SEQ ID NO 34U SEQ ID NO: 343,SEQID NO :345、SEQ ID NO :347、SEQ ID NO :349、SEQ ID NO :351、SEQ ID NO :353、SEQ ID NO355,SEQ ID NO 357,SEQ ID NO: 359、SEQ ID NO: 361、SEQ IDNO 363,SEQ ID NO: 365,SEQ ID NO :367、SEQ ID NO :369、SEQ ID NO :371、SEQID NO :373、SEQ ID NO :375、SEQ ID N0:377或SEQ ID NO :379中所示的序列，或其片段或其子序列。在一个方面，所述核酸 编码具有木聚糖酶活性的多肽。所述核酸的长度可以是至少大约10、15、20、25、30、35、40、 45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、 950、1000、1050、1100、1150、1200或更多个残基或基因或转录物的全长。在一个方面，所述 严紧条件包括清洗步骤，其包括在大约65°C的温度用0. 2 X SSC清洗大约15分钟。本发明提供了可用于鉴定编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸的核酸探针，其中 所述的探针包括一个序列的至少大约 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、 950,1000或更多个连续的碱基，所述序列包括本发明的序列或其片段或其子序列，其中通 过所述探针的结合或杂交可鉴定所述核酸。所述探针可以包括含有一个序列的至少大约10 至50、大约20至60、大约30至70、大约40至80、或大约60至100个连续碱基的寡聚核苷 酸，所述的序列包括本发明的序列，或其片段或其子序列。本发明提供了可用于鉴定编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸的核酸探针，其中所述的探针包括含有与本发明的核酸在至少大约10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、 150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000 或 更多个残基的范围内具有至少大约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、 59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多或完全(100% )的 序列同一性的序列的核酸，其中所述的序列同一性是通过采用序列比较算法的分析或通过 观察检验来确定的。所述探针可以包括含有本发明核酸序列或其子序列的至少大约10至50、大约20 至60、大约30至70、大约40至80、大约60至100个连续碱基的寡聚核苷酸。本发明提供了可用于扩增编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸的扩增引物对，其 中所述的引物对能够扩增包括本发明的序列或其片段或其子序列在内的核酸。所述扩增引 物序列对的一个成员或每一个成员可以包括寡聚核苷酸，其含有序列的至少大约10至50 个连续碱基，或序列的大约 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30或更多个连续碱基。本发明提供了扩增引物对，其中所述的引物对所包含的第一个成员具有的序列 显示为本发明核酸的大约前(5 ‘ )12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30或更多个残基，第二个成员具有的序列显示为第一个成员的互补链的大约前 (5' ) 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或更多个残基。本发明提供了利用本发明的扩增引物对通过扩增例如通过聚合酶链式反应(PCR) 所产生的编码木聚糖酶的核酸。本发明提供了利用本发明的扩增引物对通过扩增例如通过 聚合酶链式反应(PCR)所产生的木聚糖酶。本发明提供了利用本发明的扩增引物对通过扩 增例如通过聚合酶链式反应(PCR)制备木聚糖酶的方法。在一个方面，所述扩增引物对可 从文库例如基因文库，如环境文库中扩增核酸。本发明提供了扩增编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸的方法，包括使用能够扩 增本发明的核酸序列或其片段或其子序列的扩增引物序列对来扩增模板核酸。本发明提供了包括本发明的核酸或其子序列的表达序列盒(expression cassette) 0在一个方面，所述的表达序列盒可以含有与启动子有效连接的(operably linked)核酸。所述启动子可以是病毒、细菌、哺乳动物或植物启动子。在一个方面，植物启 动子可以是马铃薯、水稻、玉米、小麦、烟草或大麦启动子。启动子可以是组成型启动子。所 述组成型启动子可以包括CaMV35S。在另一个方面，启动子可以是诱导型启动子。在一个方 面，启动子可以是组织特异性启动子或受环境调节或受发育调节的启动子。因此，启动子可 以是例如种子特异性、叶特异性、根特异性、茎特异性或脱落诱导的(abscission-induced) 启动子。在一个方面，所述表达序列盒可以进一步包括植物或植物病毒表达载体。本发明提供了包括本发明的表达序列盒(如载体)或本发明的核酸的克隆媒介 物(vehicles)。所述克隆媒介物可以是病毒载体、质粒、噬菌体、噬粒(phagemid)、粘粒 (cosmid)、fos-质粒(fosmid)、细菌噬菌体或人工染色体。所述病毒载体可以包括腺病 毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体。所述克隆媒介物可以包括细菌人工染色体 (BAC)、质粒、细菌噬菌体Pl衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)。本发明提供了含有本发明的核酸或本发明的表达序列盒(例如载体)或本发明 的克隆媒介物的转化细胞。在一个方面，所述转化细胞可以是细菌细胞、哺乳动物细胞、真 菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一个方面，植物细胞可以是谷类、马铃薯、小麦、 水稻、玉米、烟草或大麦细胞。本发明提供了含有本发明的核酸或本发明的表达序列盒(例如载体)的转基因非 人动物。在一个方面，所述动物是鼠。本发明提供了含有本发明的核酸或本发明的表达序列盒(例如载体)的转基因植 物。所述转基因植物可以是谷类植物、玉米植物、马铃薯植物、番茄植物、小麦植物、油籽植 物、油菜籽植物、大豆植物、水稻植物、大麦植物或烟草植物。本发明提供了含有本发明的核酸或本发明的表达序列盒(例如载体)的转基因种 子。所述的转基因种子可以是谷类植物、玉米种子、小麦种子、含油种子、油菜籽、大豆种子、 棕榈仁、向日葵籽、芝麻籽、花生或烟草植物种子。本发明提供了反义寡聚核苷酸，其包含了与本发明核酸互补或者能够在严紧条件 下与本发明核酸杂交的核酸序列。本发明提供了在细胞中抑制木聚糖酶信息的翻译的方 法，包括将反义寡聚核苷酸给予细胞或在细胞中表达反义寡聚核苷酸，所述反义寡聚核苷 酸含有与本发明核酸互补的或者能够在严紧条件下与本发明核酸杂交的核酸序列。本发明 提供了含有本发明的序列的子序列的双链抑制性RNA(RNAi)分子。在一个方面，所述RNAi 的长度大约为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链核苷酸。本发明提供了 抑制木聚糖酶在细胞中表达的方法，包括将双链抑制性RNA(RNAi)给予细胞或在细胞中表 达双链抑制性RNA(RNAi)，其中所述的RNA含有本发明序列的子序列。本发明提供了分离出的或重组的多肽，包括与本发明的示例性多肽或肽在至少大 约 25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350 或更多个残基或全长多月太 的范围内具有至少大约 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%, 61 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多或完全(100%)的序列同一性 的氨基酸序列，所述的序列同一性是通过采用序列比较算法的分析或通过观察检验来确定 的。所述的本发明的示例性多肽或肽序列包括SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4、SEQID NO :6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ IDNO : 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO 20,SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ IDNO :26、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 32,SEQ ID NO :34、SEQ IDNO :36、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO 44,SEQ IDNO :46、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :54、SEQ IDNO 56,SEQ ID NO58,SEQ ID NO60,SEQ ID NO 62,SEQ ID NO64,SEQ IDNO 66,SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :74、SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :78、 SEQ ID NO 80,SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :84、SEQ IDNO :86、SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :90、 SEQ ID NO 92,SEQ ID NO:94、SEQ IDNO 96,SEQ ID NO:98、SEQ ID NO 100,SEQ ID NO: 102,SEQ ID NO 104,SEQID NO 106,SEQ ID NO : 108、SEQ ID NO 110,SEQ ID NO 112,SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 122、SEQ IDNO 124,SEQ ID NO 126,SEQ ID NO 128、SEQ ID NO 130、SEQ ID NO 132,SEQID NO 134,SEQ ID NO 136,SEQ ID NO 138、SEQ ID NO 140,SEQ ID NO 142、SEQ ID NO 144,SEQ ID NO: 146,SEQ ID NO 148,SEQ ID NO 150,SEQ IDNO 152,SEQ ID NO 154,SEQ ID NO 156,SEQ ID NO 158, SEQ ID NO :160、SEQID NO 162, SEQ ID N0:164、SEQ ID NO 166, SEQ ID NO: 168,SEQ ID N0:170、SEQ ID NO :172、SEQ ID NO : 174、SEQ ID NO : 176、SEQ ID NO 178,SEQ IDNO :180、SEQ ID NO :182、SEQ ID NO :184、SEQ ID NO :186、SEQ ID NO :188、SEQID NO 190、SEQ ID NO :192、SEQ ID NO :194、SEQ ID NO :196、SEQ ID NO :198、SEQ ID NO :200、 SEQ ID NO 202,SEQ ID NO 204,SEQ ID NO 206,SEQ IDNO 208,SEQ ID N0:210、SEQ ID N0:212、SEQ ID NO :214、SEQ ID NO :216、SEQID NO :218、SEQ ID NO :220、SEQ ID NO :222、 SEQ ID NO 224,SEQ ID NO 226,SEQ ID NO 228,SEQ ID NO 230,SEQ ID NO 232,SEQ ID NO 234,SEQ IDNO :236、SEQ ID NO :238、SEQ ID NO :240、SEQ ID NO :242、SEQ ID NO :244、 SEQID NO 246, SEQ ID NO 248, SEQ ID NO 250, SEQ ID NO 252, SEQ ID NO 254, SEQ ID NO 256,SEQ ID NO :258、SEQ ID NO :260、SEQ ID NO :262、SEQ IDNO :264、SEQ ID NO :266、 SEQ ID NO268,SEQ ID N0:270、SEQ ID NO:272、SEQID NO 274,SEQ ID NO276,SEQ ID NO 278,SEQ ID NO :280、SEQ ID NO :282、SEQ ID NO :284、SEQ ID NO :286、SEQ ID NO :288、 SEQ ID NO 290, SEQ IDNO :292、SEQ ID NO 294, SEQ ID NO 296, SEQ ID NO 298, SEQ ID NO 300,SEQID NO :302、SEQ ID NO :304、SEQ ID NO :306、SEQ ID NO :308、SEQ ID NO :310、 SEQ ID N0:312、SEQ ID N0:314、SEQ ID N0:316、SEQ ID N0:318、SEQ IDNO 320, SEQ ID NO 322,SEQ ID NO :324、SEQ ID NO :326、SEQ ID NO :328、SEQID NO :330、SEQ ID NO :332、 SEQ ID NO 334,SEQ ID NO :336、SEQ ID NO :338、SEQ ID NO :340、SEQ ID NO :342、SEQ ID NO 344,SEQ ID NO :346、SEQ IDNO :348、SEQ ID NO :350、SEQ ID NO :352、SEQ ID NO :354、 SEQ ID NO :356、SEQID NO 358, SEQ ID NO 360, SEQ ID NO 362, SEQ ID NO 364, SEQ ID NO 366,SEQ ID NO :368、SEQ ID NO :370、SEQ ID NO :372、SEQ ID NO :374、SEQ IDNO :376、 SEQ ID N0:378或SEQ ID NO :380，及其子序列和其变异体。示例性的多肽也包括长度为至 少大约 10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、 600或更多个残基的片段，或酶的全长。本发明的示例性多肽或肽序列包括由本发明的核 酸编码的序列。本发明的示例性多肽或肽序列包括特异地结合本发明的抗体的多肽或肽。 在一个方面，本发明的多肽具有至少一种木聚糖酶活性。本发明的另一个方面提供了分离出的或重组的多肽或肽，包括本发明的多肽或肽 序列的至少 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100 或更多个
连续碱基，与其实质上相同的序列，和与其互补的序列。所述肽可以是例如一种免疫原性片 段、一种基序(例如结合位点)、一种信号序列、一种前体序列(Pr印ro sequence)或活性位
点ο本发明提供了分离出的或重组的核酸，其包含编码具有木聚糖酶活性的多肽的序 列和信号序列，其中所述的核酸包括本发明的序列。所述信号序列来自另一种木聚糖酶或 非木聚糖酶的(异源)酶。本发明提供了分离出的或重组的核酸，其包含编码具有木聚糖 酶活性的多肽的序列，其中所述的序列不含有信号序列，所述核酸包括本发明的序列。在一个方面，木聚糖酶活性包括催化内部β -1，4_木糖苷键的水解。在一个方面， 木聚糖酶活性包括内_1，4-β -木聚糖酶活性。在一个方面，木聚糖酶活性包括水解木聚糖产生更小分子量的木糖和木糖寡聚物。在一个方面，木聚糖包括阿拉伯糖基木聚糖，如水溶 性阿拉伯糖基木聚糖。水溶性阿拉伯糖基木聚糖可以构成面团或面包制品。在一个方面，木聚糖酶活性包括水解含有1，4-β-糖苷连接的D-吡喃木糖。在一 个方面，木聚糖酶活性包括水解半纤维素。在一个方面，木聚糖酶活性包括水解木材或纸浆 或纸制品中的半纤维素。在一个方面，木聚糖酶活性包括水解饲料或食品中的木聚糖。饲料或食品可以包 括基于谷类的动物饲料、麦芽汁或啤酒、牛奶或乳制品、水果或蔬菜。在一个方面，木聚糖酶活性包括在细胞例如植物细胞或微生物细胞中催化木聚糖 的水解。在一个方面，木聚糖酶活性是热稳定的。所述多肽在下面的条件下可保留木聚糖 酶活性，所述条件包括大约l°c至大约5°C之间、大约5°C至大约15°C之间、大约15°C至大约 25 °C之间、大约25 °C至大约37 °C之间、大约37 °C至大约95 °C之间、大约55 °C至大约85 °C之 间、大约70°C至大约75°C之间、或大约90°C至大约95°C之间，或更多的温度范围。在另一 个方面，木聚糖酶活性是耐热的。所述多肽在暴露于超过37°C至大约95°C、或超过55°C至 大约85°C范围的温度后仍保留木聚糖酶活性。在一个方面，所述多肽在暴露于超过90°C至 大约95°C范围的温度后，在pH 4. 5仍保留木聚糖酶活性。在一个方面，所述分离出的或重组的多肽可以包括缺少信号序列的本发明的多 肽。在一个方面，所述分离出的或重组的多肽可以包括含有异源信号序列的本发明多肽，所 述异源信号序列如异源木聚糖酶或非木聚糖酶的信号序列。在一个方面，本发明提供了嵌合蛋白，其包含含有本发明的信号序列的第一结构 域和至少一个第二结构域。所述蛋白可以是融合蛋白。所述第二结构域可以包含一种酶。 所述酶可以是木聚糖酶。本发明提供了嵌合多肽，其包含含有本发明的信号肽(SP)、前体序列和/或催化 结构域(CD)的至少第一结构域，和含有异源多肽或肽的至少第二结构域，其中所述的异源 多肽或肽与信号肽(SP)、前体序列和/或催化结构域(CD)不是天然相关的。在一个方面， 所述异源多肽或肽不是木聚糖酶。所述异源多肽或肽可以位于信号肽(SP)、前体序列和/ 或催化结构域(CD)的氨基末端、羧基末端或位于两个末端。本发明提供了分离出的或重组的编码嵌合多肽的核酸，其中所述的嵌合多肽包含 含有本发明的信号肽(SP)、前体结构域(pr印ro domain)和/或催化结构域(CD)的至少 第一结构域和含有异源多肽或肽的至少第二结构域，其中所述的异源多肽或肽与信号肽 (SP)、前体结构域和/或催化结构域(CD)不是天然相关的。本发明提供了分离出的或重组的信号序列(例如信号肽)，其由本发明的多肽的 残基 1 至 14、1 至 15、1 至 16、1 至 17、1 至 18、1 至 19、1 至 20、1 至 21、1 至 22、1 至 23、1 至 24、1 至 25、1 至 26、1 至 27、1 至 28、1 至 29、1 至 30、1 至 31、1 至 32、1 至 33、1 至 34、1 至 35、1至36、1至37、1至38、1至40、1至41、1至42、1至43或1至44中所示的序列组成， 所述的本发明的多肽例如 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:12、SEQ ID NO 14,SEQID NO 16,SEQ ID NO 18,SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 22,SEQ ID NO :24、SEQID NO :26、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34、SEQID NO 36, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO :44、SEQIDNO 46,SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 50、SEQ ID NO 52、SEQ ID NO :54、SEQID NO 56、SEQ ID NO 58,SEQ ID NO 60、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO :64、SEQID NO 66、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 70,SEQ ID NO 72、SEQ ID NO :74、SEQID NO 76、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 82,SEQ ID NO :84、SEQID NO 86、SEQ ID NO :88、SEQ ID NO 90、SEQ ID NO 92、SEQ ID N0:94、SEQID NO 96、SEQ ID NO 98、SEQ ID NO 100、SEQ ID NO 102,SEQ ID NO 104、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112、SEQ IDNO : 114、SEQ ID NO: 116,SEQ ID NO 118,SEQ ID NO : 120、SEQ ID NO : 122、SEQID NO 124,SEQ ID NO 126,SEQ ID NO 128,SEQ ID NO 130,SEQ ID NO 132,SEQ ID NO 134,SEQ ID NO 136,SEQ ID NO: 138,SEQ ID NO 140,SEQ IDNO : 142、SEQ ID NO : 144、SEQ ID NO 146,SEQ ID NO 148,SEQ ID NO 150, SEQID N0:152、SEQ ID NO 154, SEQ ID N0:156、SEQ ID NO 158, SEQ ID NO: 160,SEQ ID NO 162,SEQ ID NO 164,SEQ ID NO 166,SEQ ID NO 168,SEQ IDNO 170,SEQ ID NO172,SEQ ID NO 174,SEQ ID NO176,SEQ ID NO 178,SEQID NO 180,SEQ ID NO: 182、SEQ ID N0:184、SEQ ID N0:186、SEQ ID N0:188、SEQ ID N0:190、SEQ ID N0:192、 SEQ ID NO 194, SEQ ID NO 196, SEQ IDNO 198, SEQ ID NO 200, SEQ ID NO 202, SEQ ID NO 204,SEQ ID NO :206、SEQID NO :208、SEQ ID NO :210、SEQ ID NO :212、SEQ ID NO :214、 SEQ ID NO :216、SEQ ID NO :218、SEQ ID NO :220、SEQ ID NO :222、SEQ ID NO :224、SEQ IDNO :226、SEQ ID NO :228、SEQ ID NO :230、SEQ ID NO :232、SEQ ID NO :234、SEQID NO 236、SEQ ID NO :238、SEQ ID NO :240、SEQ ID NO :242、SEQ ID NO :244、SEQ ID NO :246、 SEQ ID NO 248, SEQ ID NO 250, SEQ ID NO 252, SEQ IDNO :254、SEQ ID NO 256, SEQ ID NO 258,SEQ ID NO :260、SEQ ID NO :262、SEQID NO :264、SEQ ID NO :266、SEQ ID NO :268、 SEQ ID NO 270,SEQ ID NO :272、SEQ ID NO :274、SEQ ID NO :276、SEQ ID NO :278、SEQ ID NO 280,SEQ IDNO 282,SEQ ID NO :284、SEQ ID NO :286、SEQ ID NO :288、SEQ ID NO :290、 SEQID NO 292, SEQ ID NO :294、SEQ ID NO 296, SEQ ID NO 298, SEQ ID NO 300, SEQ ID NO 302,SEQ ID NO :304、SEQ ID NO :306、SEQ ID NO :308、SEQ IDNO :310、SEQ ID NO :312、 SEQ ID N0:314、SEQ ID NO :316、SEQ ID NO :318、SEQID NO :320、SEQ ID NO322,SEQ ID NO 324,SEQ ID NO :326、SEQ ID NO :328、SEQ ID NO :330、SEQ ID NO :332、SEQ ID NO :334、 SEQ ID NO 336, SEQ IDNO 338, SEQ ID NO 340, SEQ ID NO 342, SEQ ID NO 344, SEQ ID NO 346,SEQID NO :348、SEQ ID NO :350、SEQ ID NO :352、SEQ ID NO :354、SEQ ID NO :356、 SEQ ID NO 358, SEQ ID NO 360, SEQ ID NO 362, SEQ ID NO :364、SEQ IDNO 366, SEQ ID NO368,SEQ ID NO370,SEQ ID N0:372、SEQ ID NO :374、SEQID NO 376,SEQ ID NO :378 或 SEQ ID NO :380o 在一个方面，木聚糖酶活性包括在大约37°C时的比活(specific activity)为每 毫克蛋白大约1至大约1200个单位，或每毫克蛋白大约100至大约1000个单位。在另一 个方面，木聚糖酶活性包括比活为每毫克蛋白大约100至大约1000个单位，或每毫克蛋白 大约500至大约750个单位。可选择地，木聚糖酶活性包括37°C时的比活为每毫克蛋白大 约1至大约750个单位，或每毫克蛋白大约500至大约1200个单位。在一个方面，木聚糖 酶活性包括37°C时的比活为每毫克蛋白大约1至大约500单位，或每毫克蛋白大约750至 大约1000个单位。在另一个方面，木聚糖酶活性包括37°C时的比活为每毫克蛋白大约1至 大约250个单位。可选择地，木聚糖酶活性包括在37°C时的比活为每毫克蛋白大约1至大约100个单位。在另一个方面，耐热性包括在被加热至高温后，仍能保留木聚糖酶在37°C的 比活的至少一半。可选择地，耐热性可以包括在加热至高温后，可以保留在37°C的范围为每 毫克蛋白大约1至大约1200个单位或每毫克蛋白大约500至大约1000个单位的比活。在 另一个方面，耐热性可以包括在加热至高温后保留在37°C的范围为每毫克蛋白大约1至大 约500个单位的比活。本发明提供了分离出的或重组的本发明的多肽，其中所述的多肽含有至少一个 糖基化位点。在一个方面，糖基化可以是N-连接糖基化。在一个方面，多肽可以在毕赤酵 母(P.pastoris)或裂变酵母(S. pombe)中被表达后被糖基化。在一个方面，所述多肽可以在包括大约pH 6. 5、pH 6、pH 5. 5、pH 5、pH 4. 5或pH 4的条件下保留木聚糖酶活性。在另一个方面，所述多肽可以在包括大约pH 7、pH 7.5、pH 8. 0、ρΗ 8. 5、pH 9、pH 9. 5、pH 10、pH 10. 5或pH 11的条件下保留木聚糖酶活性。在一个 方面，所述多肽可以在暴露于包括大约PH 6. 5、pH 6、pH 5. 5、pH 5、pH 4. 5或pH 4的条件 后保留木聚糖酶活性。在另一个方面，所述多肽可以在暴露于包括大约PH 7、pH 7.5、pH 8. 0、ρΗ 8. 5、pH 9、pH 9. 5、pH 10、pH 10. 5或pH 11的条件后保留木聚糖酶活性。本发明提供了含有本发明的多肽的蛋白制剂，其中所述的蛋白制剂包括液体、固 体或凝胶。本发明提供了含有本发明的多肽和第二蛋白或结构域的杂二聚体。杂二聚体的第 二个成员是可以是一个不同的磷脂酶、不同的酶或其它的蛋白。在一个方面，第二结构域可 以是一个多肽，杂二聚体可以是一个融合蛋白。在一个方面，第二结构域可以是一个表位 (epitope，抗原结合部位)或标记(tag)。在一个方面，本发明提供了含有本发明的多肽的 同型二聚体。本发明提供了具有木聚糖酶活性的固定化多肽，其中所述的多肽包括本发明的多 肽、由本发明核酸编码的多肽、或含有本发明多肽和第二结构域的多肽。在一个方面，所述 多肽可固定在细胞、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、珠子、凝胶、平板、阵 列或毛细管上。本发明提供了含有本发明的固定化核酸的阵列。本发明提供了含有本发明的抗体 的阵列。本发明提供了分离出的或重组的可与本发明多肽或本发明核酸编码的多肽特异 结合的抗体。所述抗体可以是单克隆或多克隆抗体。本发明提供了含有本发明的抗体的 杂交瘤，所述的本发明的抗体例如可与本发明多肽或本发明核酸编码的多肽特异结合的抗 体。本发明提供了分离或鉴定具有木聚糖酶活性的多肽的方法，包括以下步骤(a) 提供本发明的抗体；(b)提供含有多肽的样品；和(c)将步骤(b)的样品与步骤(a)的抗体 在一定的条件下接触，其中所述的抗体可与多肽特异结合，因此可分离或鉴定具有木聚糖 酶活性的多肽。本发明提供了制备抗木聚糖酶抗体的方法，包括将本发明的核酸或本发明的多肽 或其子序列给予一种非人动物，其量足以产生体液免疫反应，由此制备出抗木聚糖酶抗体。 本发明提供了进行抗木聚糖酶免疫的方法，包括将本发明的核酸或本发明的多肽或其子序 列给予一种非人动物，其量足以产生免疫反应。
本发明提供了产生重组多肽的方法，包括以下步骤(a)提供与启动子有效连接 的本发明的核酸，和(b)在允许多肽表达的条件下表达步骤(a)的核酸，由此产生重组多 肽。在一个方面，该方法可进一步包括用步骤(a)的核酸转化宿主细胞，然后表达步骤(a) 的核酸，由此在转化细胞中产生重组的多肽。本发明提供了鉴定具有木聚糖酶活性的多肽的方法，包括以下步骤(a)提供本 发明的多肽或由本发明核酸编码的多肽；(b)提供木聚糖酶的底物；和(c)将步骤(a)的 多肽或其片段或其变异体与步骤(b)的底物接触，并检测底物量的减少或反应产物量的增 加，其中通过所述的底物量的减少或反应产物量的增加可检测出具有木聚糖酶活性的多 肽。本发明提供了鉴定木聚糖酶底物的方法，包括以下步骤(a)提供本发明的多肽 或由本发明核酸编码的多肽；(b)提供受测底物；和(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的受 测底物接触，并检测底物量的减少或反应产物量的增加，其中通过所述的底物量的减少或 反应产物量的增加可确定受测底物为木聚糖酶底物。本发明提供了确定受测化合物是否可与多肽特异结合的方法，包括以下步骤(a) 在允许核酸翻译为多肽的条件下表达核酸或含有核酸的载体，其中所述的核酸包括本发明 的核酸，或提供本发明的多肽；(b)提供受测化合物；(C)将多肽与受测化合物接触；和(d) 确定步骤(b)的受测化合物是否与多肽特异结合。本发明提供了鉴定木聚糖酶活性调节物的方法，包括以下步骤(a)提供本发明 的多肽或由本发明核酸编码的多肽；(b)提供受测化合物；(C)将步骤(a)的多肽与步骤 (b)的受测化合物接触，测定木聚糖酶的活性，其中与缺少该受测化合物时的活性相比，在 存在该受测化合物时测定的木聚糖酶活性的变化可以用来确定该受测化合物是否可调节 木聚糖酶活性。在一个方面，通过提供木聚糖酶底物和检测底物量的减少或反应产物量的 增加，或底物量的增加或反应产物量的减少来测定木聚糖酶的活性。与没有该受测化合物 时的底物或反应产物的量相比，有该受测化合物时的底物量的减少或反应产物量的增加可 确定该受测化合物为木聚糖酶活性的激活物。与没有该受测化合物时的底物量或反应产物 的量相比，有检测化合物时的底物量的增加或反应产物量的减少可确定该受测化合物为木 聚糖酶活性的抑制物。本发明提供了包括处理器和数据存储装置的计算机系统，其中所述的数据存储装 置中已经储存了本发明的多肽序列或核酸序列(例如，由本发明核酸编码的多肽)。在一 个方面，计算机系统可以进一步包括序列比较算法和其中储存有至少一条参考序列的数据 存储装置。在另一个方面，序列比较算法包括可指示多态性的计算机程序。在一个方面，计 算机系统可以进一步包括可鉴定所述序列中一种或多种特征的标识符(identifier，识别 器)。本发明提供了已经储存了本发明的多肽序列或核酸序列的计算机可读介质。本发明 提供了鉴定序列中特征的方法，包括以下步骤(a)使用可鉴别序列中的一种或更多特征 的计算机程序读取序列，其中所述的序列包括本发明的多肽序列或核酸序列；和(b)用计 算机程序鉴定序列中的一种或更多特征。本发明提供了比较第一序列和第二序列的方法， 包括以下步骤(a)通过使用可比较序列的计算机程序读取第一序列和第二序列，其中所 述的第一序列包括本发明的多肽序列或核酸序列；和(b)用计算机程序测定第一序列和第 二序列之间的差异。测定第一序列和第二序列之间差异的步骤可以进一步包括鉴定多态性的步骤。在一个方面，该方法可以进一步包括可鉴别序列中一种或更多特征的标识符。在 另一个方面，该方法可以包括使用计算机程序读取第一序列，并鉴别序列中的一种或更多 特征。本发明提供了从环境样品中分离或回收编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸的 方法，包括以下的步骤(a)提供可扩增编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸的扩增引物 序列对，其中所述的引物对能够扩增本发明的核酸；(b)从环境样品中分离核酸或处理环 境样品以便样品中的核酸能易与扩增引物对杂交；和(C)将步骤(b)的核酸与步骤(a)的 扩增引物对组合，从环境样品中扩增核酸，由此可从环境样品中分离或回收编码具有木聚 糖酶活性的多肽的核酸。扩增引物序列对的一个成员或每一个成员可以包括含有本发明序 列的至少大约10至50个连续碱基的寡聚核苷酸。在一个方面，扩增引物序列对是本发明 的扩增对。本发明提供了从环境样品中分离或回收编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸的 方法，包括以下步骤(a)提供含有本发明核酸或其子序列的多聚核苷酸探针；(b)从环境 样品中分离核酸或处理环境样品以便样品中的核酸能够与步骤(a)的多聚核苷酸探针杂 交；(c)将步骤(b)的分离出的核酸或已处理的环境样品与步骤(a)的多聚核苷酸探针组 合；和(d)分离出能与步骤(a)的多聚核苷酸探针特异杂交的核酸，由此可从环境样品中分 离或回收编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸。环境样品可以包括水样品、液体样品、土壤 样品、空气样品或生物样品。在一个方面，生物样品可以来自细菌细胞、原生动物细胞、昆虫 细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。本发明提供了产生编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸的变异体的方法，包括以 下步骤(a)提供包括本发明核酸的模板核酸；和(b)在模板序列中修改、删除或添加一个 或更多个核苷酸或进行以上处理的组合，产生模板核酸的变异体。在一个方面，该方法可以 进一步包括表达所述的变异体核酸以产生木聚糖酶多肽变异体。可以通过如下的方法进 行修改、添加或删除，包括易错PCR、重排(shuffling)、寡聚核苷酸诱导的定点突变、装配 PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体诱变、位点专一性诱变、 基因重装配(例如，GeneReassembly ，参见例如美国专利6，537，776)、基因位点饱和诱变 (GSSM )、合成连接重装配(SLR)和它们的组合。在另一个方面，可通过如下的方法进行修 改、添加或删除，包括重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含有尿嘧啶的模板 诱变、缺口二重诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失 诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体生成和它们 的组合。在一个方面，本方法可迭代重复，直至从模板核酸编码的多肽中产生具有改变的 或不同的活性或改变的或不同的稳定性的木聚糖酶。在一个方面，所述木聚糖酶多肽变异 体是耐热的，在暴露于较高温度后仍保留一些活性。在另一个方面，所述的木聚糖酶多肽变 异体与由模板核酸编码的木聚糖酶相比，糖基化作用增加。可选择地，所述木聚糖酶多肽变 异体在较高的温度具有木聚糖酶活性，其中由模板核酸编码的木聚糖酶在该较高的温度是 没有活性的。在一个方面，本方法可迭代重复，直至从模板核酸中产生具有改变的密码子使 用的木聚糖酶编码序列。在另一个方面，本方法可迭代重复，直至从模板核酸中产生具有更 高或更低水平的信息表达或稳定性的木聚糖酶基因。
在一个方面，本发明提供了分离出的或重组的核酸，其含有在SEQ ID N0:189中 所示的序列，其中所述的SEQ ID NO 189含有以下突变中的一种或多种位置22至24的 核苷酸是TTC，位置31至33的核苷酸是CAC，位置34至36的核苷酸是TTG，位置49至51 的核苷酸是ATA，位置31至33的核苷酸是CAT，位置67至69的核苷酸是ACG，位置178至 180的核苷酸是CAC，位置190至192的核苷酸是TGT，位置190至192的核苷酸是GTAji 置190至192的核苷酸是GTT，位置193至195的核苷酸是GTG，位置202至204的核苷酸 是GCT，位置235至237的核苷酸是CCA，或位置235至237的核苷酸是CCC。在一个方面， 本发明提供了制备含有这条序列的核酸的方法，其中所述的在SEQ ID N0:189中的突变可 通过基因位点饱和诱变(GSSM )来获得。在一个方面，本发明提供了构成SEQ ID NO :190的分离出的或重组的核酸，其中所 述的SEQ ID NO 190含有下面的一种或多种突变在氨基酸位置8上的天冬氨酸成为苯丙 氨酸，在氨基酸位置11上的谷氨酰胺成为组氨酸，在氨基酸位置12上的天冬酰胺成为亮氨 酸，氨基酸位置17上的甘氨酸成为异亮氨酸，氨基酸位置23上的苏氨酸成为由非野生型密 码子编码的苏氨酸，氨基酸位置60上的甘氨酸成为组氨酸，氨基酸64上的脯氨酸成为半胱 氨酸，氨基酸位置64上的脯氨酸成为缬氨酸，氨基酸位置65上的丝氨酸成为缬氨酸，氨基 酸位置68上的甘氨酸成为异亮氨酸，氨基酸位置68上的甘氨酸成为丙氨酸，或氨基酸位置 79上的缬氨酸成为脯氨酸。本发明提供了修饰编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸中的密码子以增加其在 宿主细胞中表达的方法，该方法包括下面的步骤(a)提供本发明的编码具有木聚糖酶活 性的多肽的核酸；和(b)鉴别步骤(a)的核酸中不优选或不太优选的密码子，并将其替换以 优选的或中度使用(neutrally used)的与被替换的密码子编码相同氨基酸的密码子，其中 所述的优选密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中出现频率较多的密码子，非优选或不 太优选的密码子是在宿主细胞基因的编码序列中出现频率较低的密码子，由此可修饰核酸 以增加其在宿主细胞中的表达。本发明提供了修饰编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸中的密码子的方法，该 方法包括以下步骤(a)提供本发明的核酸；和(b)鉴别步骤(a)的核酸中的密码子，并将 其替换以与被替换的密码子编码相同氨基酸的不同密码子，由此可修饰编码木聚糖酶的核 酸中的密码子。本发明提供了修饰编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸中的密码子以增加其在 宿主细胞中表达的方法，该方法包括以下的步骤(a)提供本发明的编码木聚糖酶多肽的 核酸，和(b)鉴别步骤(a)的核酸中非优选或不太优选的密码子，并将其替换以优选的或中 度使用的与被替换密码子编码相同氨基酸的密码子，其中所述的优选密码子是在宿主细胞 基因的编码序列中出现频率较多的密码子，非优选或不太优选的密码子是在宿主细胞基因 的编码序列中出现频率较少的密码子，由此可修饰核酸以增加其在宿主细胞中的表达。本发明提供了修饰编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸中的密码子以减少其在 宿主细胞中的表达的方法，该方法包括以下步骤(a)提供本发明的核酸；和(b)鉴别步骤 (a)的核酸中的至少一个优选的密码子，并将其替换以与被替换密码子编码相同氨基酸的 非优选的或不太优选的密码子，其中所述的优选密码子是在宿主细胞基因的编码序列中出 现频率较多的密码子，非优选或不太优选的密码子是在宿主细胞基因的编码序列中出现频率较低的密码子，由此可修饰核酸以减少其在宿主细胞中的表达。在一个方面，宿主细胞可 以是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。本发明提供了产生核酸文库的方法，所述核酸文库编码多个已修饰的木聚糖酶活 性位点或底物结合位点，其中所述的已修饰的活性位点或底物结合位点衍生自含有编码第 一活性位点或第一底物结合位点的序列的第一核酸，该方法包括以下步骤(a)提供编码 第一活性位点或第一底物结合位点的第一核酸，其中所述的第一核酸序列包括在严紧条件 下可与本发明的核酸杂交的序列，所述核酸编码木聚糖酶活性位点或木聚糖酶底物结合位 点；(b)提供一组诱变寡聚核苷酸，它们在第一核酸中的多个靶向密码子处编码天然发生 氨基酸的变异体；和(c)使用该组诱变寡聚核苷酸以产生一组编码活性位点或编码底物结 合位点的核酸变异体，它们在被诱变的各个氨基酸密码子处编码一定范围的氨基酸变异， 由此可产生编码多个被修饰的木聚糖酶活性位点或底物结合位点的核酸文库。在一个方 面，本方法包括通过下列的方法诱变步骤(a)的第一核酸，所述方法包括优化的定向进化 系统、基因位点饱和诱变(GSSM )、合成连接重装配(SLR)、易错PCR、重排、寡聚核苷酸诱导 的定点突变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体诱变、 位点专一性诱变、基因重装配(GeneReassembly ，美国专利6，537，776)、基因位点饱和诱 变(GSSM )、合成连接重装配(SLR)及其组合。在另一个方面，本方法包括通过以下的方 法诱变步骤(a)的第一核酸或变异体，所述方法包括重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰 的DNA诱变、含有尿嘧啶的模板诱变、缺口二重诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主株 诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、整体诱 变、嵌合核酸多聚体生成和它们的组合。本发明提供了制备小分子的方法，包括以下步骤(a)提供多个能够合成或修饰 小分子的生物合成酶，其中所述的酶之一包括由本发明核酸编码的木聚糖酶；(b)为步骤 (a)中的至少一种酶提供底物；和(c)将步骤(b)中的底物与所述酶在可促进多个生物催 化反应的条件下进行反应，通过一系列生物催化反应产生小分子。本发明提供了修饰小分 子的方法，包括以下步骤(a)提供木聚糖酶，其中所述的酶包括本发明的多肽，或由本发 明的核酸或其子序列编码的多肽；(b)提供小分子，和(c)将步骤(a)的酶与步骤(b)的小 分子在可促进由木聚糖酶催化的酶促反应的条件下反应，由此通过木聚糖酶酶促反应修饰 小分子。在一个方面，本方法可以包含步骤(a)的酶的多个小分子底物，由此通过木聚糖酶 催化的至少一个酶促反应产生被修饰小分子的文库。在一个方面，本方法可以包括多种其 它的酶，在一定条件下可通过这些酶促进多个生物催化反应，形成由多个酶促反应产生的 被修饰小分子的文库。在另一个方面，本方法可以进一步包括检测文库的步骤，以确定一种 显示所需活性的特定的修饰小分子是否存在于文库中。检测文库的步骤可以进一步包括在 文库内系统性去除用来产生一部分多个修饰小分子的生物催化反应中的一个反应之外的 所有反应，通过检测一部分修饰小分子中是否存在具有所需活性的特定的修饰小分子，鉴 定产生具有所需活性的特定修饰小分子的至少一个特定的生物催化反应。本发明提供了确定木聚糖酶的功能片段的方法，包括以下步骤(a)提供木聚糖 酶，其中所述的酶包括本发明的多肽，或由本发明核酸或其子序列编码的多肽；和(b)从步 骤(a)的序列中删除多个氨基酸残基，检测剩余子序列的木聚糖酶活性，由此可确定木聚 糖酶的功能片段。在一个方面，木聚糖酶活性的测定是通过提供木聚糖酶底物，并检测底物量的减少或反应产物量的增加来完成的。本发明提供了通过应用实时代谢流分析(real-time metabolic flux analysis) 对新的或修饰的表现型进行全细胞工程改造的方法，该方法包括以下步骤(a)通过修饰 细胞的遗传组成，产生修饰的细胞，其中所述遗传组成通过往所述细胞中添加本发明的核 酸而被修饰；(b)培养所述修饰的细胞，产生多个修饰的细胞；(c)通过以实时方式监控步 骤(b)的细胞培养物，测量所述细胞的至少一种代谢参数；(d)分析步骤(C)的数据，确定 测量到的参数是否与在相似条件下的未修饰细胞有所不同，从而应用实时代谢流分析确定 所述细胞中工程化的表型。一方面，所述细胞的遗传组成可以通过包括删除细胞中的序列 或修饰细胞中的序列，或者敲除基因的表达的方法而被修饰。一方面，所述方法可以进一步 包括选择含有新的工程化表型的细胞。另一方面，所述方法可以进一步包括培养被选择的 细胞，由此产生含有新的工程化表型的细胞株。本发明提供了增加木聚糖酶多肽的耐热性或热稳定性的方法，该方法包括糖基 化木聚糖酶多肽，其中所述的多肽含有本发明多肽的至少30个连续氨基酸；或由本发明核 酸序列编码的多肽，由此增加木聚糖酶多肽的耐热性或热稳定性。在一个方面，木聚糖酶的 比活在超过大约37°C至大约95°C的范围内的温度可以是热稳定或耐热的。本发明提供了在细胞中过量表达重组的木聚糖酶多肽的方法，包括表达含有核酸 的载体，所述核酸包括本发明的核酸，或者表达本发明的核酸序列，其中序列同一性是通过 采用序列比较算法的分析或通过观察检验来确定的，其中所述的过量表达受高活性启动子 的应用、双顺反子载体的应用或载体的基因扩增的影响。本发明提供了制备转基因植物的方法，包括以下步骤(a)将异源核酸序列导入 进细胞中，其中所述的异源核酸序列包括本发明的核酸序列，由此可产生转化的植物细胞； 和(b)从转化的细胞中产生转基因植物。在一个方面，步骤(a)可以进一步包括通过电穿孔 或微注射植物细胞原生质体来导入异源核酸序列。在另一个方面，步骤(a)可以进一步包 括通过DNA微粒轰击(DNA particle bombardment)直接将异源核酸序列导入进植物组织 中。可选择地是，步骤(a)可以进一步包括采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 宿主将异源核酸序列导入进植物细胞DNA中。在一个方面，植物细胞可以是马铃薯、玉米、 水稻、小麦、烟草或大麦细胞。本发明提供了在植物细胞中表达异源核酸序列的方法，包括以下步骤(a)用与 启动子有效连接的异源核酸序列转化植物细胞，其中所述的异源核酸序列包括本发明的核 酸；(b)在一定条件下使植物生长，其中所述的异源核酸序列在植物细胞中表达。本发明提 供了在植物细胞中表达异源核酸序列的方法，包括以下步骤(a)用与启动子有效连接的 异源核酸序列转化植物细胞，其中所述的异源核酸序列包括本发明的序列；(b)在一定条 件下使植物生长，其中所述的异源核酸序列在植物细胞中表达。本发明提供了水解、降解或破坏含有木聚糖的组合物的方法，包括以下步骤(a) 提供本发明的具有木聚糖酶活性的多肽，或由本发明核酸编码的多肽；(b)提供含有木聚 糖的组合物；和(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物在一定条件下接触，其中所述 的木聚糖酶可水解、降解或破坏含有木聚糖的组合物。在一个方面，所述组合物包括植物细 胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。因此，所述组合物可以包括任何植物或植物 部分、任何含木聚糖的食物或饲料、废物或类似物。本发明提供了液化或去除含木聚糖的组合物的方法，包括以下步骤(a)提供具有木聚糖酶活性的本发明的多肽，或由本发明核酸 编码的多肽；(b)提供含有木聚糖的组合物；和(C)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物 在一定条件下接触，其中所述的木聚糖酶可去除、软化或液化含木聚糖的组合物。本发明提供了含有本发明的多肽或由本发明核酸编码的多肽的去垢剂组合物， 其中所述的多肽具有木聚糖酶活性。木聚糖酶可以是一种非表面活性的木聚糖酶或表面活 性木聚糖酶。木聚糖酶可配制成非水的液体组合物、铸型固体、颗粒形式、微粒形式、压缩片 剂、凝胶形式、糊剂或膏剂形式。本发明提供了清洗物体的方法，包括以下步骤(a)提供包 含具有木聚糖酶活性的本发明多肽或由本发明核酸编码的多肽的组合物；(b)提供物体； 和(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的物体在一定条件下接触，其中所述的组合物可清洗 该物体。本发明提供了纺织品或织物，包括例如线，其包含本发明的多肽或由本发明核酸 编码的多肽。在一个方面，纺织品或织物包括含木聚糖的纤维。本发明提供了处理纺织品 或织物(例如，从组合物中去除染料)的方法，包括以下步骤(a)提供包含具有木聚糖酶 活性的本发明多肽或由本发明核酸编码的多肽的组合物；(b)提供含有木聚糖的纺织品或 织物；和(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物在一定条件下接触，其中所述的木聚糖 酶可处理纺织品或织物(例如，去除染料)。本发明提供了改善织物光洁度的方法，包括以 下步骤(a)提供包含具有木聚糖酶活性的本发明多肽或由本发明核酸编码的多肽的组合 物；(b)提供织物；和(c)将步骤(a)的多肽和步骤(b)的织物在一定条件下接触，其中所 述的多肽可处理织物，由此可改善织物的光洁度。在一个方面，织物是毛料或丝绸。本发明提供了含有本发明多肽或由本发明核酸编码的多肽的饲料或食品。本发明 提供了在动物食用前水解饲料或食物中木聚糖的方法，包括以下步骤(a)获得含有本发 明的木聚糖酶或由本发明核酸编码的木聚糖酶的饲料原料；和(b)将步骤(a)的多肽加入 至饲料或食物原料中，其量足以在足够的时间内引起木聚糖的水解，形成被处理的食物或 饲料，由此可以在被动物食用之前水解食物或饲料中的木聚糖。在一个方面，本发明提供了 在动物食用之后水解饲料或食物中木聚糖的方法，包括以下步骤(a)获得含有本发明的 木聚糖酶或由本发明核酸编码的木聚糖酶的饲料原料；(b)将步骤(a)的多肽加入至饲料 或食物原料中；和(c)将饲料或食物原料给予动物，其中在被食用后，木聚糖酶可在动物的 消化道中水解饲料或食物中的木聚糖。食物或饲料可以是，例如谷类食物、谷粒、玉米和类 似物。本发明提供了动物的食物或营养添加剂，其含有本发明的多肽，例如由本发明核 酸编码的多肽。在一个方面，食物或营养添加剂中的多肽可被糖基化。本发明提供了可食 用的酶输送基质，其含有本发明的多肽，例如由本发明核酸编码的多肽。在一个方面，输送 基质包括小丸。在一个方面，多肽可被糖基化。在一个方面，木聚糖酶活性是耐热的。在另 一个方面，木聚糖酶活性是热稳定的。本发明提供了含有本发明多肽的食物、饲料或营养添加剂。本发明提供了使用木 聚糖酶作为动物饮食中的营养添加剂的方法，该方法包括制备含有木聚糖酶的营养添加 剂，所述木聚糖酶含有本发明多肽的至少30个连续氨基酸；将该营养添加剂给予动物以 增加动物摄入的饲料或食物中所包含的木聚糖的利用。动物可以是人、反刍动物或单胃动 物。木聚糖酶的制备可通过在生物体中表达编码木聚糖酶的多聚核苷酸来完成，所述生物体包括细菌、酵母、植物、昆虫、真菌和动物。所述生物体可选自裂变酵母(S.pombe)、啤酒 酵母(S. Cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、假单胞菌属(Pseudomonas sp·)、大 肠杆菌(E. coli)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、杆菌属(Bacillus sp.)和乳酸杆菌属 (Lactobacillus sp.)。本发明提供了可食用的酶输送基质，其含有热稳定的重组木聚糖酶，例如本发明 的多肽。本发明提供了将木聚糖酶添加剂输送至动物的方法，该方法包括以丸的形式制备 可食用的酶输送基质，其含有粒状的可食用载剂和热稳定的重组木聚糖酶，其中所述的丸 可很容易地将包含在其中的木聚糖酶分散进入水介质中，并将可食用的酶输送基质施用于 动物。重组木聚糖酶可以包含本发明的多肽。粒状的可食用载剂可以包括选自谷物胚芽、 去油的谷物胚芽、干草、苜蓿、梯牧草、大豆壳、向日葵籽粉和小麦粗粉的载剂。可食用的载 剂包括去油的谷物胚芽。木聚糖酶可被糖基化以便在制丸条件下提供热稳定性。输送基质 可通过将含有谷物胚芽和木聚糖酶的混合物制成丸剂而形成。制丸的条件可以包括使用蒸 汽。制丸条件可以包括应用的温度为超过大约80°C，进行大约5分钟，酶保留的比活为每毫 克酶至少350至大约900个单位。本发明提供了改善乳制品的质地和味道的方法，包括以下步骤(a)提供具有木 聚糖酶活性的本发明多肽，或由本发明核酸编码的木聚糖酶；(b)提供乳制品；和(C)将步 骤(a)的多肽与步骤(b)的乳制品在一定的条件下接触，其中所述的木聚糖酶可改善乳制 品的质地或味道。在一个方面，乳制品包括干酪或乳酪。本发明提供了含有本发明的木聚 糖酶或由本发明核酸编码的木聚糖酶的乳制品。本发明提供了改进从富含油的植物原料中提取油的方法，包括以下步骤(a)提 供具有木聚糖酶活性的本发明多肽，或由本发明核酸编码的木聚糖酶；(b)提供富含油的 植物原料；和(c)将步骤(a)的多肽与富含油的植物原料接触。在一个方面，富含油的植物 原料包括富含油的种子。油可以是豆油、橄榄油、菜籽(canola)油或向日葵油。本发明提供了制备水果或蔬菜汁、果汁、酱或提取物的方法，包括以下步骤(a) 提供具有木聚糖酶活性的本发明多肽，或由本发明核酸编码的木聚糖酶；(b)提供含有水 果或蔬菜原料的组合物或液体；和(c)将步骤(a)的多肽和组合物接触，由此制备水果或蔬 菜汁、果汁、酱或提取物。本发明提供了含有本发明的木聚糖酶，或由本发明核酸编码的多肽的纸或纸制品 或纸浆。本发明提供了处理纸或纸浆或木浆的方法，包括以下步骤(a)提供具有木聚糖酶 活性的本发明的多肽，或由本发明的核酸编码的木聚糖酶；(b)提供含有纸或纸浆或木浆 的组合物；和(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物在一定条件下接触，其中所述的木 聚糖酶可处理纸或纸浆或木浆。在一个方面，药物组合物可用作一种消化助剂或一种抗微 生物剂(例如，抗沙门氏菌)。在一个方面，处理是预防性的。在一个方面，本发明提供了 口腔护理产品，其含有具有木聚糖酶活性的本发明多肽，或由本发明核酸编码的木聚糖酶。 口腔护理产品可以包括牙膏、牙用乳剂、凝胶或牙粉、牙齿用品、漱口剂、刷牙前或后的清洗 剂、口香糖、止咳糖或冰糖。本发明提供了隐形眼镜清洗组合物，其含有具有木聚糖酶活性 的本发明多肽，或由本发明核酸编码的木聚糖酶。在一个方面，本发明提供了保护动物免受含有木聚糖的微生物的影响的方法，其 包括施用本发明的多肽。所述微生物可以是含有木聚糖的细菌，例如，沙门氏菌。
本发明提供了分离出的核酸，其具有如SEQ ID NO :189中所示的序列，并提供了与 SEQ ID NO :189具有至少50%的序列同一性、编码具有木聚糖酶活性的多肽的变异体。在 一个方面，所述多肽具有木聚糖酶活性，例如热稳定的木聚糖酶活性。本发明提供了含有SEQ ID NO :189的分离出或重组的核酸，其中SEQ IDN0:189包 括下列序列变异中的一个或多个或全部位置22至24上的核苷酸是TTC、位置22至24上 的核苷酸是TTT、位置31至33上的核苷酸是CAC、位置31至33上的核苷酸是CAT、位置34 至36上的核苷酸是TTG、位置34至36上的核苷酸是TTA、位置34至36上的核苷酸是CTC、 位置34至36上的核苷酸是CTT、位置34至36上的核苷酸是CTA、位置34至36上的核苷 酸是CTG、位置49至51上的核苷酸是ΑΤΑ、位置49至51上的核苷酸是ΑΤΤ、位置49至51 上的核苷酸是ATC、位置178至180上的核苷酸是CAC、位置178至180上的核苷酸是CAT、 位置190至192上的核苷酸是TGT、位置190至192上的核苷酸是TGC、位置190至192上 的核苷酸是GTA、位置190至192上的核苷酸是GTT、位置190至192上的核苷酸是GTC、位 置190至192上的核苷酸是GTG、位置193至195上的核苷酸是GTG、位置193至195上的 核苷酸是GTC、位置193至195上的核苷酸是GTA、位置193至195上的核苷酸是GTT、位置 202至204上的核苷酸是ΑΤΑ、位置202至204上的核苷酸是ΑΤΤ、位置202至204上的核苷 酸是ATC、位置202至204上的核苷酸是GCT、位置202至204上的核苷酸是GCG、位置202 至204上的核苷酸是GCC、位置202至204上的核苷酸是GCA、位置235至237上的核苷酸 是CCA、位置235至237上的核苷酸是CCC、或位置235至237上的核苷酸是CCG。本发明提供了分离出或重组的多肽，其包括含有SEQ ID Ν0:190的氨基酸序列， 其中SEQ ID NO 190包括下列序列变异中的一个或多个或全部氨基酸位置8上的天冬氨 酸是苯丙氨酸，氨基酸位置11上的谷氨酰胺是组氨酸，氨基酸位置12上的天冬酰胺是亮氨 酸，氨基酸位置17上的甘氨酸是异亮氨酸，氨基酸位置23上的苏氨酸是由非野生型密码子 的密码子编码的苏氨酸，氨基酸位置60上的甘氨酸是组氨酸，氨基酸位置64上的脯氨酸 是半胱氨酸，氨基酸位置64上的脯氨酸是缬氨酸，氨基酸位置65上的丝氨酸是缬氨酸，氨 基酸位置68上的甘氨酸是异亮氨酸，氨基酸位置68上的甘氨酸是丙氨酸，或氨基酸位置79 上的丝氨酸是脯氨酸。在一个方面，多肽具有木聚糖酶活性，例如热稳定的木聚糖酶活性。本发明提供了分离出的或重组的核酸，其含有SEQ ID Ν0:189，其中SEQ IDNO 189 包括在表1或表2中所示的序列变异中的一个或多个或全部。本发明提供了由含有SEQ ID NO 189的核酸编码的分离出的或重组的多肽，其中SEQ ID NO 189包括表1或表2中所示 的序列变异中的一个或多个或全部。在一个方面，多肽具有木聚糖酶活性，例如热稳定的木 聚糖酶活性。本发明提供了含有SEQ ID NO :379的分离出的或重组的核酸，其中SEQ IDNO 379 包括下列序列变异中的一个或多个或全部在位置22至24上的核苷酸是TTC、在位置31至 33上的核苷酸是CAC、在位置49至51上的核苷酸是ΑΤΑ、在位置178至180上的核苷酸是 CAC、在位置193至195上的核苷酸是GTG、在位置202至204上的核苷酸是GCT。本发明提供了含有SEQ ID NO :380的分离出的或重组的多肽，其中SEQ IDNO 380 包括以下序列变异的一个或多个或全部D8F、Q11H、G17I、G60H、S65V和/或G68A。在一个 方面，多肽具有木聚糖酶活性，例如热稳定的木聚糖酶活性。本发明的分离出的或重组的核酸也被称为“A组核酸序列”。本发明提供了分离出的核酸，其包括在A组核酸序列中所示序列的至少10个连续碱基，与其实质上相同的序列 和与其互补的序列。本发明的分离出的或重组的多肽——包括本发明的示例性序列的功能片段在 内——也被称为“B组氨基酸序列”。本发明的另一个方面是分离出的或重组的核酸，其编 码的多肽具有B组氨基酸序列中所示序列和与其实质上相同的序列的至少10个连续氨基 酸。仍然在另一个方面，本发明提供了纯化的多肽，其具有B组氨基酸序列中所示的序列和 与其实质上相同的序列。本发明的另一个方面是分离出的或纯化的抗体，其可与具有B组 氨基酸序列中所示序列和与其实质上相同的序列的多肽特异结合。本发明的另一个方面是分离出的或纯化的抗体或其结合片段(binding fragment)，其可与具有B组氨基酸序列和与其实质上相同的序列中的一种多肽的至少10 个连续氨基酸的多肽特异结合。本发明的另一个方面是制备多肽的方法，所述多肽具有B组氨基酸序列中所示的 序列和与其实质上相同的序列。该方法包括将编码所述多肽的核酸导入进宿主细胞中，其 中所述的核酸可与启动子有效连接，并在允许核酸表达的条件下培养宿主细胞。本发明的 另一个方面是制备多肽的方法，所述多肽具有B组氨基酸序列中所示序列和与其实质上相 同的序列的至少10个氨基酸。该方法包括将编码所述多肽的核酸导入进宿主细胞中，其中 所述的核酸可与启动子有效连接，并在允许核酸表达的条件下培养宿主细胞，由此可产生 多肽。本发明的另一个方面是产生变异体的方法，包括获得核酸，其具有A组核酸序列 中所示序列、与其实质上相同的序列、与A组核酸序列中的序列互补的序列、含有前述序列 的至少30个连续核苷酸的片段，将序列中的一个或多个核苷酸改变为别的核苷酸、删除序 列中的一个或多个核苷酸或向序列中加入一个或多个核苷酸。本发明的另一个方面是计算机可读介质，在其上储存了 A组核酸序列中所示的序 列和与其实质上相同的序列，或B组氨基酸序列中所示的多肽序列和与其实质上相同的序 列。本发明的另一个方面是计算机系统，其包括处理器和数据存储装置，其中所述的 数据存储装置上面已经存储了A组核酸序列中所示的序列和与其实质上相同的序列，或B 组氨基酸序列中所示的多肽序列和与其实质上相同的序列。本发明的另一个方面是比较第一序列和参考序列的方法，其中所述的第一序列是 具有A组核酸序列中所示序列和与其实质上相同的序列的核酸，或B组氨基酸序列和与其 实质上相同序列的多肽代码。该方法包括通过使用比较序列的计算机程序读取第一序列和 参考序列；并使用计算机程序确定第一序列和参考序列之间的差异。本发明的另一个方面是鉴定在A组核酸序列所示的序列和与其实质上相同的序 列中，或具有B组氨基酸序列所示的序列和与其实质上相同序列的多肽中的特征的方法， 包括通过使用可鉴定序列中特征的计算机程序来读取序列；并用计算机程序来鉴别序列中 的特征。本发明的又另一方面是催化木聚糖或其衍生物分解的方法，包括以下步骤将含 有木聚糖或其衍生物的样品与具有B组氨基酸序列和与其实质上相同的序列的多肽在可 促进木聚糖分解的条件下接触。
本发明的另一个方面是鉴定B组氨基酸序列和与其实质上相同的序列的片段或 变异体的分析方法，所述片段或变异体保留了具有B组氨基酸序列和与其实质上相同的序 列的多肽的酶功能。该分析方法包括将具有B组氨基酸序列、与其实质上相同的序列的多 肽，或多肽片段或变异体与底物分子在可使多肽片段或变异体发挥作用的条件下接触，检 测底物水平的减少或多肽和底物之间的反应的特异反应产物水平的增加，由此可鉴定这样 的序列的片段或变异体。本发明的另一个方面是长度为大约10至50个核苷酸的寡聚核苷酸核酸探针，其 具有的至少10个连续核苷酸的片段与选自A组核酸序列中的核酸序列的核酸靶区域有至 少50%的互补性；其与核酸靶区域在中度至高度严紧条件下杂交，形成可检测的靶探针 双链体。本发明的另一个方面是用于分离或鉴定木聚糖酶基因的多聚核苷酸探针，其具有 与A组核酸序列之一的至少一个片段相同的或完全互补的序列。仍然在另一个方面，本发明提供了蛋白制剂，其含有的多肽具有选自B组氨基酸 序列的氨基酸序列和与其实质上相同的序列，其中所述的蛋白制剂是液体。仍然在本发明的另一个方面，提供了蛋白制剂，其含有的多肽具有选自B组氨基 酸序列的氨基酸序列和与其实质上相同的序列，其中所述的多肽是固体。还是在本发明的另一个方面，提供了修饰小分子的方法，包括以下步骤将由选自 A组核酸序列、与其实质上相同的序列和与其互补的序列的多聚核苷酸编码的至少一种多 肽与至少一种小分子混合，通过至少一个生物催化反应产生至少一种修饰的小分子，其中 所述的至少一种多肽具有木聚糖酶活性。本发明的另一个方面是含有编码具有木聚糖酶活性的多肽的序列的克隆载体，所 述的序列选自A组核酸序列、与其实质上相同的序列和与其互补的序列。本发明的另一个方面是含有编码具有木聚糖酶活性的多肽的序列的宿主细胞，所 述的序列选自A组核酸序列、与其实质上相同的序列和与其互补的序列。仍然在另一个方面，本发明提供了能够在宿主细胞中复制的表达载体，该载体包 含多聚核苷酸，该多聚核苷酸具有的序列选自A组核酸序列、与其实质上相同的序列、与其 互补的序列和在低、中度和高度严紧条件下与具有任何前述序列的核酸杂交的分离核酸。在另一个方面，本发明提供了改进面团的方法，包括将面团与B组氨基酸序列和 与其实质上相同的序列中的至少一种多肽在足以改进面团的条件下接触。本发明的另一个方面是生产饮料的方法，包括在足以降低麦芽汁或啤酒粘度的条 件下施用B组氨基酸序列和与其实质上相同的序列中的至少一种多肽。本发明的木聚糖酶可用于破坏动物饲料中的高分子量阿拉伯糖基木聚糖。本发明 的木聚糖酶的加入可通过改善消化率刺激生长速率，也可改善动物幼仔的质量。木聚糖酶 可通过胃肠道发挥作用，降低肠的粘度和增加胰腺酶的扩散。另外，本发明的木聚糖酶可用 于处理饲料谷类的胚乳细胞壁和蔬菜蛋白。在本发明的一个方面，本发明的新型的木聚糖 酶可给予动物以便增加食物中木聚糖的利用。本发明的木聚糖酶的这种活性可用于破坏不 溶的细胞壁材料，释放细胞壁中的营养物质，然后使其可被动物利用。它也可将半纤维素变 化为营养糖类，这样可释放原来被包裹在细胞壁中的营养物质。木聚糖酶也可产生可以成 为反刍动物微生物菌群的营养源的化合物。
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本发明的另一个方面提供了在动物饮食中使用木聚糖酶作为营养添加剂的方法， 包括制备含有重组木聚糖酶的营养添加剂，该酶含有B组氨基酸序列和与其实质上相同的 序列的至少30个连续氨基酸，并将该营养添加剂给予动物以增加被动物摄取的食物中所 包含的木聚糖的利用。在本发明的另一个方面，提供了将木聚糖酶添加剂输送给动物的方法，其中该方 法包括以丸的形式制备可食用的酶输送基质，该丸中含有颗粒状的可食用载剂和热稳定的 重组木聚糖酶，其中所述的颗粒很容易将包含在其中的木聚糖酶分散进水介质中，并将这 种可食用的酶输送基质给予动物。颗粒状的可食用载剂可以包括选自去油的谷物胚芽、干 草、苜蓿、梯牧草、大豆壳、向日葵籽粉和小麦粗粉的载剂。所述木聚糖酶可以具有B组氨基 酸序列中所示的氨基酸序列和与其实质上相同的序列。在另一个方面，本发明提供了含有编码具有木聚糖酶活性的多肽的序列的分离出 的核酸，其中所述的序列选自A组核酸序列、与其实质上相同的序列和与其互补的序列，其 中所述的序列含有信号序列。本发明也提供了含有编码具有木聚糖酶活性的多肽的序列的 分离出的核酸，其中所述的序列选自A组核酸序列、与其实质上相同的序列和与其互补的 序列，其中所述的序列含有来自别的木聚糖酶的信号序列。另外，本发明提供了含有编码具 有木聚糖酶活性的多肽的序列的分离出的核酸，其中所述的序列选自A组核酸序列、与其 实质上相同的序列和与其互补的序列，其中所述的序列不含有信号序列。仍然是本发明的另一个方面，提供了分离出的核酸，它是SEQ ID N0:189的突变 体。另一个方面还提供了氨基酸序列，它是SEQ ID N0:190的突变体。本发明的一个或多个实施方案的细节在下面的附图和描述中被显示。本发明的其 他特征、目的和优势将显现在这些描述、附图和权利要求书中。在此引用的所有出版物、专利、专利申请、GenBank序列和ATCC保藏物均在此明确 引入，可用作所有目的的参考。
下面的图是为了说明本发明的一些方面，不能被认为是限制由权利要求书所包含 的发明范围。本专利或申请文件包含至少一个以彩色绘制的绘图。带有彩色绘图的本专利或专 利申请出版物的复件将根据需要和支付必要费用后由专利局提供。图1是计算机系统的框图。图2是流程图，说明了将新的核酸或蛋白序列与序列数据库进行比较，以确定新 序列与数据库中的序列之间的同源性水平的过程的一个方面。图3是流程图，说明了计算机中确定两条序列是否同源的过程的一个方面。图4是流程图，说明了用于检测序列中特征的存在的标识符过程300的一个方面。图 5 是野生型序列(SEQ ID NO 189 和 190)与 8x 突变体(SEQ ID NO :375， 376)——表1中突变体D、F、H、I、S、V、X和AA的组合——的活性比较图(野生型木聚糖酶 (SEQ ID NOs 189和190)和8x突变体的耐热性)。图6A显示了通过SEQ ID N0:190(由SEQ ID N0:189编码)的基因位点饱和诱变 (GSSM )产生的SEQ ID NO 378 (由SEQ ID NO 377编码)的9个氨基酸突变位点，如在下面实施例5中所详述的。图6B显示了在熔化温度转变中点(melting temperature transition midpoint, Tm)试验中SEQ ID N0:190和SEQ ID NO :378的去折叠，这是通过DSC对各种酶进行测定 得出的，如在下面实施例5中所详述的。图7A显示了酶SEQ ID NO 190和SEQ ID NO 378的pH和温度活性曲线，如在下 面实施例5中所详述的。图7B显示了对酶SEQ ID NO: 190和SEQ ID NO 378最佳的速率/温度活性，如在 下面实施例5中所详述的。图7C显示了酶SEQ ID N0:190和SEQ ID NO :378的耐热性/残留活性，如下面实 施例5中所详述的。图8A例示了由9个GSSM 点突变的所有可能组合构成的GeneReassembly 文库， 它被构建并用于筛选具有改善的耐热性和活性的变异体，如在下面实施例5中所详述的。图8B显示了在最佳温度和pH 6.0下，与SEQ ID NO 190 (“野生型”)相比，“6X-2” 变异体和“9X”变异体(SEQ ID NO 378)的相对活性，如下面实施例5中所详述的。图9A 显示了在用 SEQ ID NO 190( “野生型”)和 “9X” 变异体(SEQ ID NO 378) 酶水解寡聚木糖(Xyl) 3、(Xyl) 4、(Xyl) 5和(Xyl) 6后获得的指纹，如在下面实施例5中所 详述的。图9B 显示了在用 SEQ ID NO 190( “野生型”)和 “9X” 变异体(SEQ ID NO 378) 酶水解山毛榉材木聚糖后获得的指纹，如在下面实施例5中所详述的。图IOA是显示了通过GSSM 进化所获得的优于SEQ ID NO 190 ( “野生型”)的热 稳定性(由Tm表示)改进水平的示意图，如在下面实施例5中所详述的。图10B显示了通过GSSM 和GeneReassembly 技术的结合所获得的SEQ IDNO 378 和SEQ ID NO :380形式的酶改良“适合度图(fitness diagram) ”，如下面实施例5中所详 述的。图11是用于确定本发明的木聚糖酶是否可用于预处理纸浆的一个示例性的常规 筛选方案的流程示意图(戴弗萨应用实验室生物漂白流程)，如在下面实施例6中所详述 的。在不同的图表中同样的参考标记表示同样的元素。发明详述本发明涉及木聚糖酶和编码它们的多聚核苷酸，以及制备和应用它们的方法。本 发明的多肽的木聚糖酶活性包括具有水解酶活性的酶，例如能够水解木聚糖中存在的糖苷 键的酶，例如催化水解内β-1，4-木糖苷键的酶。本发明的木聚糖酶可用来制备和/或加 工食物、饲料、营养添加剂、纺织品、洗涤剂和类似物。本发明的木聚糖酶可用于药学组合物 中和饮食助剂中。本发明的木聚糖酶可特别用于焙烤、动物饲料、饮料和造纸工艺中。定义术语“抗体”包括来源于(derived from)、出自于(modeled after)或大体 上编码于(substantially encoded by) 一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因的 肽或多肽或者其片断，它们能特异地结合于抗原或抗原决定部位，见例如，Fundamental Immunology，第三版，W.E.Paul，ed.，Raven Press, N. Y. (1993) ；Wilson (1994) J. Immunol.
29Methods 175 267-273 ；Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97。术语抗体 包括结合抗原的部分，即，具有与抗原结合的能力的“抗原结合位点”(例如，片断、序列、互 补性决定区(CDRs))，包括(土汗油片断，由乂！^乂札卬和⑶丄结构域组成的单价片断；(ii) F (ab’)2片断，包括在铰链区由二硫键连接的两个Fab片断的二价片断；(iii)由VH和CHl 结构域组成的Fd片断；(iv)由抗体单臂(a single arm)的VL和VH结构域组成的Fv片 断；(ν)由 VH 结构域组成的 dAb 片断(Ward 等，(1989) Nature 341 :544_546)，禾口 (vi)分离 出的互补性决定区(⑶R)。单链抗体也被包括在术语“抗体”中。在此使用的术语“阵列，，或“微阵列，，或“生物芯片，，或“芯片，，是多个靶元素，每
个靶元素包括固定在基底表面的确定区域上的确定量的一种或多种多肽(包括抗体)或核 酸，以下进一步详细描述。正如在此使用的，术语“计算机”、“计算机程序”和“处理器”使用的是它们最广泛 的一般内容，并可与所有设备结合，细节在以下详细描述。特定的多肽或蛋白的“编码序列” 或“序列编码”是指当置于合适的调控序列的控制之下时，可转录和翻译成为多肽或蛋白的 核酸序列。在此使用的短语“核酸”或“核酸序列”是指寡聚核苷酸、核苷酸、多聚核苷酸，或 它们的片段，基因组DNA或RNA，或合成的起点，它们可以是单链或双链，可以代表正义链或 反义链，它们可以是肽核酸(PNA)或任何DNA样或RNA样材料，可以是天然或合成的。短语 “核酸”或“核酸序列”包括寡聚核苷酸、核苷酸、多聚核苷酸，或它们的片段，基因组DNA或 RNA (例如，mRNA、rRNA、tRNA、iRNA)，或合成的起点，它们可以是单链或双链，可以代表正义 链或反义链，可以是肽核酸(PNA)，或任何DNA样或RNA样材料，可以具有天然或合成的起 始点，包括例如iRNA、核糖核蛋白(例如，双链iRNA，例如，iRNPs)。该术语包含了含有天 然核苷酸的已知类似物的核酸，寡聚核苷酸。该术语也包含了具有合成的骨架的核酸样结 构，见例如，Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144 189-197 ；Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36 :8692_8698 ；Samstag(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6 153-156。“寡核苷酸”包括可以用化学合成的或者单链的多脱氧核苷酸或者双链的互补多 脱氧核苷酸。这样合成的寡核苷酸没有5’磷酸，所以在没有激酶利用ATP增加磷酸基团的 情况下，它不会与另外的寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸可以与没有脱磷酸化的片断连接。特定多肽或蛋白的“编码序列”或编码特定多肽或蛋白的“核苷酸序列”，是当被置 于合适调控序列的控制之下时被转录和翻译成多肽或蛋白的核酸序列。术语“基因”是指涉及产生多肽链的DNA片段；它包括在编码区域前面和后面的 区域(引导序列(leader)和尾部序列(trailer))，并且有时，个别的编码片段(外显子) 之间有插入序列(内含子)。在此使用的“有效连接(operably linked) ”是指两个或多个 核酸(例如，DNA)片段之间的功能关系。典型的，它是指转录调控序列与被转录序列的功 能关系。例如，启动子有效连接到编码序列，例如本发明的核酸，假如它刺激或调控该编码 序列在合适的宿主细胞或别的表达系统中的转录的话。一般地，与被转录序列有效连接的 启动子转录调控序列与该被转录序列是物理上邻接的，即，它们是顺式作用。然而，一些转 录调控序列，例如增强子，并不需要物理邻接于或位置上靠近于转录被其增强的编码序列。在此所用的术语“表达序列盒”指的是可以影响结构基因(即，蛋白编码序列，例 如本发明的木聚糖酶编码序列)在与这些序列相容的宿主中表达的核苷酸序列。表达序列盒至少包括与多肽编码序列有效连接的启动子；可选择地，也可以与例如转录终止信号的 其它序列有效连接。必须的或有助于影响表达的其它要素也可以被使用，例如，增强子。所 以，表达序列盒也包括质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸DNA”载体，以及类似 物。“载体”包括能够感染细胞、转染细胞、短期或永久地转导细胞的核酸。可以认识到的 是，载体可以是裸露的核酸或与蛋白或脂构成复合物的核酸。载体可选择地包括病毒的或 细菌的核酸和/或蛋白质，和/或膜(例如，细胞膜、病毒脂质被膜等等)。载体包括，但不 局限于复制子(例如，RNA复制子、噬菌体)，DNA片段可以与复制子相连，而变得可以复制。 载体包括，但不局限于RNA、自动地自我复制的环状或线状DNA或RNA(例如，质粒、病毒，以 及类似物，见，例如美国专利5，217，879)，并且包括表达质粒和非表达质粒。当重组微生物 或细胞培养物被描述作为“表达载体”的宿主时，这包括染色体外的环状和线状DNA，以及已 经整入到宿主染色体的DNA。当载体被宿主细胞保持时，载体或者可以在细胞有丝分裂期间 作为自主结构稳定复制，或者整入到宿主基因组中。如在此使用的，术语“启动子”包括所有可以驱动在细胞例如植物细胞中编码序列 的转录的序列。所以，本发明的构建物中使用的启动子包括顺式作用转录控制元件和调控 序列，它们涉及调控或调节基因转录的时间和/或速率。例如，启动子可以是顺式作用转录 控制元件，包括增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5’和3’不翻译区， 或涉及转录调控的内含子序列。这些顺式作用序列一般与蛋白质或别的生物分子相互作用 (启动/关闭、调节、调控，等等)来进行转录。“组成型”的启动子是在多数环境条件和发 育或细胞分化状态下持续驱动表达的启动子。“诱导型”或“调控型”启动子在环境条件或 发育条件的影响下指导本发明的核酸的表达。可以影响诱导型启动子进行转录的环境条件 的例子包括厌氧条件、提高的温度、干旱或有光。“组织特异性”启动子是只在特定细胞或组织或器官，例如植物或动物中，有活性 的转录控制元件。组织特异性调控可以通过某些内在因子实现，内在因子可以确保编码某 种组织特异性蛋白的基因的表达。已知这样的因子存在于哺乳动物和植物中，以允许特异 性的组织发育。术语“植物”包括整个植物、植物的部分(例如，叶、茎、花、根等等)、植物原生质 体、种子和植物细胞和其后代。一般地，可以在本发明的方法中使用的植物种类宽泛至可适 于转化技术的高等植物，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)，还有裸子植物。它包 括多种倍体型的植物，包括多倍体、二倍体、单倍体和半合子。如在此使用的，术语“转基因 植物”包括这样的植物或植物细胞，其中插入有异源核酸序列，例如本发明的核酸和各种重 组构建物(例如，表达序列盒)。“质粒”可以从商业上获得、在自由基础上从公众获得、或者根据公开的程序由可 获得的质粒构建。与在此描述的质粒等效的质粒在本领域是已知的，并且对本领域技术人 员来说是很显然的。在此所使用的“氨基酸”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白序列，或这些 的片断、部分或亚基，天然发生的或合成的分子。“氨基酸”或“氨基酸序列”包括寡肽、肽、多肽或蛋白序列，或这些的片断、部分或 亚基，天然发生的或合成的分子。在此所使用的术语“多肽”是指通过肽键或修饰的肽键彼 此连接的氨基酸，后者即肽等配物，并且可以包含不同于编码基因的20个氨基酸的修饰的氨基酸。可以通过天然过程，如翻译后加工，或通过本领域中为人所熟知的化学修饰技术来 修饰多肽。修饰作用可发生在多肽中的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基 末端。要理解的是，相同类型的修饰作用可以相同或不同的程度发生在指定多肽的几个位 置上。指定的多肽也可发生多种类型的修饰作用。修饰作用包括乙酰化、酰化、ADP-核糖 基化、酰胺化、核黄素的共价附着、血红素基团的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价 附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联的环化作用、二硫键形 成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、Y “羧化、糖基化、形成 GPI锚着(anchor)、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、木聚糖水解酶加 工、磷酸化、异戊二烯化、消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸盐化和转运RNA介导的向蛋 白中添加氨基酸如精氨酰化。(见 Creighton，T. E. ,Proteins-Structures and Molecular Properties,第 二 版，W. H. Freeman 禾口 Company, New York(1993) ；Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson 主编，Academic Press, New York, 1-12页(1983))。本发明的肽和多肽也包括所有“模拟(mimetic)，，和“肽模拟物 (P印tidomimetic) ”形式，如在下面进一步所详述的。如在此所使用的，术语“分离的”是指从其原始环境(例如，如果它是天然发生的， 那么就指自然环境)中取出的材料。例如，存在于活的动物中的天然发生的多核苷酸或多 肽就不是分离的，但是从天然系统中的一些或全部共存材料分离到的同样的多核苷酸或 多肽就是分离的。这些多核苷酸可以成为载体的一部分，和/或这些多核苷酸或多肽可以 成为组合物的一部分，而它们仍然是分离的，因为这些载体或组合物不是天然环境的一部 分。如在此所使用的，术语“纯化的”不要求绝对的纯净；相反，它是一个相对的定义。从文 库中获得的单种核酸可以照惯例提纯到电泳同质。从这些克隆中获得的序列不能直接从文 库中获得，或从人总DNA中获得。本发明的纯化核酸已经相对于生物体中基因组DNA的剩 余部分纯化了至少IO4-IO6倍。但是，术语“纯化的”也包括已经从基因组DNA或文库中或别 的环境中的别的序列中提纯的核酸，其纯度提高至少一个数量级，通常是二或三个数量级， 更多的情况是四或五个数量级。如在此所使用的，术语“重组”的含义是核酸与在其自然环境中并不邻接的“骨架 (backbone)”核酸相邻。另外，为了成为“被富集的(enriched) ”，核酸要在核酸骨架分子 的群体中占到核酸插入物数量的5%或更多。根据本发明的骨架分子所包括的核酸如表达 载体、自我复制的核酸、病毒、整合核酸和其它载体或用来保留或操作感兴趣的核酸插入物 的核酸。一般，被富集的核酸在重组的骨架分子的群体中占到核酸插入物数量的15%或更 多。更典型的，被富集的核酸在重组的骨架分子的群体中占到核酸插入物数量的50%或更 多。在一个方面，被富集的核酸在重组的骨架分子的群体中占到核酸插入物数量的90%或 更多。“重组”多肽或蛋白是指通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白；即从用编码所需 多肽或蛋白的外源DNA构建物转化的细胞产生的多肽或蛋白。“合成的”多肽或蛋白是 通过化学合成制备的多肽或蛋白。固相化学肽合成方法也可用来合成本发明的多肽或 片段。自从二十世纪60年代早期在本领域中这种方法就是为人所熟知的(Merrifield， R. B.，J. Am. Chem. Soc. ,85 :2149_2154，1963)(也见 Stewart，J. Μ.和 Young，J. D.，Solid Phase Peptide Synthesis,第二版，Pierce Chemical Co. , Rockford, 111. , 11-12 页))并已经在最近被用于商业上可获得的实验室肽设计和合成试剂盒(Cambridge Research Biochemicals)。这样的商业可获得的实验室试剂盒通常应用了 H. M. Geysen等在Proc. Natl. Acad. Sci. , USA,81 =3998(1984)中的教导，它们可在联系于单个板的多个“杆”或 “钉”的尖端上合成多肽。当使用这样的系统时，一整板的杆或钉被倒转，并插入进第二个 板的对应孔或容器中，其中含有可将一种合适的氨基酸附着或锚着到钉或杆的尖端上的溶 液。通过重复这样的过程，即倒转和将杆和钉的尖端插入到合适的溶液中，氨基酸可被构建 成为所需的肽。另外，许多现有的FMOC肽合成系统可以使用。例如，多肽或片段的组装可 在固体支持物上使用Applied Biosystems公司的431A型自动肽合成仪来进行。这样的装 置为本发明肽的合成提供了简便途径，它们通过直接合成或通过合成一系列可使用其它已 知技术连接在一起的片段。启动子序列可“有效连接于”编码序列，此时可在启动子处启动转录的RNA聚合酶 将编码序列转录为mRNA。“质粒”标注为前面为小写的"ρ"，后面为大写字母和/或数字。起始的质粒可 以是市售的，可以不受限制地从公共获得，或可根据已发表的方法从现有的质粒构建出来。 另外，与在此所述的质粒相当的质粒在本领域中是已知的，对普通技术人员是很明显的。DNA的“消化”是指使用仅可在DNA中某些序列上作用的限制性酶对DNA进行的 催化切割。在此使用的各种限制型酶是商业渠道中可购得的，其使用的反应条件、辅助因子 和其他必要条件是普通技术人员已知的。为了进行分析，一般1 μ g质粒或DNA片段在大约 20 μ 1缓冲溶液中使用大约2单位酶。为了分离DNA片段进行质粒构建，一般5至50 μ g的 DNA用20至250单位酶在更大的体积中进行消化。特定的限制性酶的合适缓冲液和底物量 由制造商说明。通常使用的孵育时间为在37°C大约1小时，但根据供应商的使用说明可以 变化。在消化后，可以进行凝胶电泳以分离所需的片段。短语“实质上相同的(substantially identical) ”就两个核酸或多肽而言，是指 两条或多条序列被比较和比对(aligned)以确定最大一致性(maxium correspondence) 时，具有例如至少大约 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 61 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的核苷酸或氨基酸残基(序列) 同一性，所述的最大一致性可以通过使用任何一种已知的序列比较算法进行测量，或者通 过观察检验得出。一般，实质上的同一性存在于至少大约100个残基的区域中，最普遍的 是，在至少大约150-200个残基的区域中序列是实质上相同的。在一些方面，序列在编码区 的整个长度上是实质上相同的。另外，“实质上相同的”氨基酸序列是通过一个或多个保守或非保守氨基酸的取 代、删除或插入而与参考序列有差异的序列，特别是当这样的取代发生在分子的非活性位 点上时，只要该多肽基本上保留其功能特性。保守的氨基酸取代例如将一个氨基酸取代为 相同类型的另一个氨基酸(例如，用一种疏水氨基酸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨 酸取代另一种疏水氨基酸，或用一种极性氨基酸替代另一种极性氨基酸，如用精氨酸取代 赖氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或用谷氨酰胺取代天冬酰胺)。可以从例如木聚糖酶多肽 中删除一个或多个氨基酸，产生多肽结构的修饰，而又不明显地改变其生物学活性。例如，对木聚糖酶生物学活性并不是必需的氨基或羧基末端氨基酸可被去掉。本发明的修饰的多 肽序列可以通过任何方法来分析木聚糖酶生物学活性，包括将修饰的多肽序列与木聚糖酶 底物接触，确定在该分析中修饰的多肽是否可降低特异底物的量或增加功能性木聚糖酶多 肽与底物的酶反应的生物产物的量。如在此所使用的，“片段”是自然发生的蛋白的一部分，它可以以至少两种不同的 构象存在。片段可以具有与自然发生的蛋白相同的或基本上相同的氨基酸序列。“基本上 相同”的含义是很大程度上但不是完全的相同，但又保留了与其相关的序列的至少一种功 能活性。通常，如果至少大约85%是相同的，两个氨基酸序列就是“基本上相同的”或“实质 上同源的”。也包括具有与自然发生的蛋白不同的三维结构的片段。这样的一个实例是“前 体形式(pro-form) ”分子，如低活性的蛋白原(proprotein)，它可通过切割而被修饰，从而 产生具有明显更高活性的成熟酶。“杂交”是指核酸链与互补链通过碱基配对联结的过程。杂交反应可以是灵敏的 和选择性的，感兴趣的特定序列甚至可以在以非常低的浓度存在于样品中时仍可被识别出 来。合适的严紧条件可以通过例如预杂交和杂交溶液中盐或甲酰胺的浓度，或者通过杂交 温度被限定，这是在本领域广为人知的。例如，严紧性(stringency)可以通过降低盐浓度、 增加甲酰胺的浓度、或者提高杂交温度而增加。在可替代的方面，本发明的核酸可以根据它 们在不同严紧条件(例如，高、中、低)下杂交的能力而进行定义，如在此阐明的。例如，在高严紧性条件下的杂交可发生在大约50%甲酰胺、大约37°C至42°C。在 降低的严紧性条件下的杂交可发生在大约35%至25%甲酰胺、大约30°C至35°C。特别地， 在高严紧性条件下的杂交可发生在42°C、在50%甲酰胺、5XSSPE、0. 3% SDS和200n/ml的 剪切和变性的鲑鱼精DNA中。杂交可如上所述发生在降低的严紧性条件下，但在35%甲酰 胺中、在降低的温度35°C。与特定水平的严紧性对应的温度范围可通过计算感兴趣的核酸 中嘌呤和嘧啶的比例而进一步缩小，并相应地调整温度。对上述范围和条件的改变在本领 域中是为人所熟知的。术语“变异体”是指在一个或多个碱基对、密码子、内含子、外显子或氨基酸残基 处(分别)被修饰，但仍保留本发明的木聚糖酶生物学活性的本发明的多聚核苷酸或多肽。 可通过任何方法来产生变异体，包括的方法如易错PCR、重排、寡核苷酸诱导的定点突变、 装配PCR (assembly PCR)、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变(recursive ensemble mutagenesis)、指数整体诱变(exponential ensemble mutagenesis)、位点专一 性诱变、基因重装配(例如GeneReassembly ，见，例如美国专利6，537，776)、GSSM 及其任 何组合。表1和表2列举了通过GSSM 突变SEQ ID N0:189(编码SEQ ID NO 190)获得 的变异体。本发明提供了具有表1和表2中所示序列的1个或多个或所有的核酸，即具有 SEQ ID N0:189的变异序列的核酸，其中变异如表1和表2所示，本发明还提供了由这些变 异体编码的多肽。检测这些GSSM 变异体(在表1和2中所示)的耐热性(见下面的实施例)。突 变体D、F、G、H、I、J、K、S、T、U、V、W、X、Y、Z、AA、DD和EE被发现在表1中的突变体中具有 最高的耐热性。突变体也可以被组合以形成一个更大的突变体。例如，表1中的突变体D、 F、H、I、S、V、X和AA被组合形成一个命名为“8x”的更大的突变体，其具有SEQ ID NO
34375 (编码多肽的核酸)和SEQ IDNO :376(氨基酸序列)中所示的序列。图5是野生型序 列(SEQ ID NO 189和190)与8x突变体(SEQ ID NO 259和260)的活性比较的图表。在 野生型和8x突变体的比较中，发现两者的最佳温度为65°C，两者的最佳pH为5. 5。发现野 生型序列在65°C保持其稳定性少于1分钟，而8x突变体(SEQ ID NO :375，376)被发现在 85°C可保留其稳定性超过10分钟。使用的底物为AZO-AZO-木聚糖。在一个方面，8x突变 体(SEQ ID N0:375,376)通过GSSM 被进化。在另一个方面，野生型是用于耐热性进化的 GSSM 亲代。表 权利要求
分离出的、合成的或重组的核酸，包括(a)，编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸，其中该核酸由SEQ ID NO189组成；(b)，编码具有木聚糖酶活性的多肽的核酸，其中所述多肽由SEQ ID NO190的氨基酸序列组成；或(c)，(a)或(b)的核酸，其编码木聚糖酶但是缺少信号序列或碳水化合物结合模块。
2.表达序列盒、载体或克隆载体，包含含有权利要求1的核酸序列的核酸。
3.转化的细胞，其包含(a)权利要求1的核酸序列；(b)权利要求2的表达序列盒、载体或克隆载体；或(c)编码权利要求7的多肽的核酸。
4.下列(a)-(c)中任一项在制备转基因非人动物或转基因植物或转基因种子中的用途，(a)权利要求1的核酸序列；(b)权利要求2的表达序列盒、载体或克隆载体；或(c)编码权利要求7的多肽的核酸。
5.在细胞中抑制木聚糖酶mRNA转录体的翻译的方法，包括给予所述细胞或在所述细 胞中表达反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸含有与权利要求1的核酸序列互补的核酸序 列，或者能够在严紧性条件下与权利要求1的核酸序列杂交的核酸序列。
6.在细胞中抑制木聚糖酶表达的方法，包括给予所述细胞或在所述细胞中表达双链抑 制性RNA，其中所述的RNA含有权利要求1的核酸序列的子序列。
7.分离出的、合成的或重组的多肽，其具有木聚糖酶活性，其中该多肽的由如下序列组成(a)，SEQID NO 190的氨基酸序列；(b)，由具有权利要求1所述的序列的核酸编码的氨基酸序列；或(c)，(a)或(b)的多肽，但其缺少信号序列或碳水化合物结合模块。
8.蛋白制剂，包含(a)由权利要求1的核酸序列编码的多肽；(b)权利要求2的表达序列盒、载体或克隆载体；或(c)权利要求7所述的多肽。
9.同型二聚体，包括由权利要求1的核酸序列编码的多肽；或权利要求7所述的多肽。
10.固定化的多肽，其中所述的多肽包括(a)由权利要求1的核酸序列编码的多肽；或(b)权利要求7所述的多肽。
11.阵列、微阵列、生物芯片或芯片，包含在权利要求10中所示的固定化的多肽，或者 固定化的核酸，所述核酸包括权利要求1的核酸序列。
12.分离出的、合成的或重组的抗体，其可与下述的多肽特异结合(a)由权利要求1的核酸序列编码的多肽；或(b)权利要求7所述的多肽。
13.杂交瘤，其包含可与下述的多肽特异结合的抗体(a)由权利要求1的核酸序列编码的多肽；或(b)权利要求7所述的多肽。
14.制备抗木聚糖酶抗体的方法，包括给予非人动物(a)权利要求1的核酸或其子序 列，其量足以产生体液免疫反应，由此制备抗木聚糖酶抗体；或(b)权利要求7所述的多肽， 其量足以产生体液免疫反应，由此产生抗木聚糖酶抗体。
15.产生重组多肽的方法，包括步骤(a)提供与启动子有效连接的核酸，其中所述的 核酸包括权利要求1的核酸序列；和(b)在允许表达多肽的条件下表达步骤(a)的核酸，由 此产生重组的多肽。
16.鉴定具有木聚糖酶活性的多肽的方法，包括步骤(a)提供权利要求7所述的多肽，或由权利要求1的核酸序列编码的多肽；(b)提供木聚糖酶底物；和(c)将所述多肽与步骤(b)的底物接触，检测底物量的减少或反应产物量的增加，其中 所述的底物量的减少或反应产物量的增加检测出具有木聚糖酶活性的多肽。
17.鉴定木聚糖酶底物的方法，包括步骤(a)提供权利要求7所述的多肽，或由权利要求1的核酸序列编码的多肽；(b)提供被测底物；和(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的被测底物接触，检测底物量的减少或反应产物量的 增加，其中所述的底物量的减少或反应产物量的增加鉴定被测底物为木聚糖酶的底物。
18.确定被测化合物是否与多肽特异结合的方法，包括步骤(A)(a)在允许核酸翻译为多肽的条件下表达核酸或含有核酸的载体，其中所述的核 酸具有权利要求1的核酸序列；(b)提供被测化合物；(c)将所述多肽与所述被测化合物接 触；和(d)确定步骤(b)的被测化合物是否与所述多肽特异结合；或(B)(a)提供权利要求7所述的多肽；(b)提供被测化合物；(c)将所述多肽与所述被测 化合物接触；和(d)确定步骤(b)的被测化合物是否与所述多肽特异结合。
19.鉴定木聚糖酶活性的调节物的方法，包括步骤(a)提供权利要求7所述的多肽；(b)提供被测化合物；(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的被测化合物接触，并测量木聚糖酶的活性，将在所 述的被测化合物存在的情况下测量的木聚糖酶活性与缺少所述的被测化合物时的活性作 比较，通过其中的变化确定所述的被测化合物调节木聚糖酶的活性。
20.增加木聚糖酶的耐热性或热稳定性的方法，所述方法包括对木聚糖酶进行糖基化， 其中所述的木聚糖酶包括权利要求7的氨基酸序列，由此增加所述木聚糖酶的耐热性或热 稳定性。
全文摘要
本发明涉及木聚糖酶和编码木聚糖酶的多聚核苷酸。另外，也提供了设计新的木聚糖酶和应用它们的方法。所述木聚糖酶在升高的pH和温度下具有增加的活性和稳定性。
文档编号C12N9/42GK101967490SQ20101026891
公开日2011年2月9日 申请日期2003年6月16日 优先权日2002年6月14日
发明者A·埃斯特拉利安, B·斯蒂尔, D·吴, D·布卢姆, G·黑尔伍德, S·希利, W·卡伦 申请人:先正达公司