专利名称：一种根围金黄杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，特别是涉及一种能产生纤维素酶的新的细菌-根围 金黄杆菌及其应用。
背景技术：
自从在蜗牛消化道中发现纤维素酶以来，纤维素的微生物降解问题引起了业界足 够的关注。现在纤维素酶的应用已扩展到食品发酵、医药、纺织、日用化工、造纸、工业洗涤、 烟草、石油开采、废水处理及饲料等各个领域，其应用前景十分广阔。随着能源问题日益突出，各国逐渐把对纤维素的降解研究作为一项重要的研究课 题。而纤维素的酶降解是利用纤维素的一个有效途径。目前主要对真菌纤维素酶的研究已 经非常成熟，且真菌纤维素酶的活性比较高，例如里氏木霉、绿色木霉、康氏木霉等。对细菌 纤维素酶方面的研究近几年也有很多报道，但普遍认为细菌纤维素酶活性比真菌纤维素酶 的活性低。而细菌作为世界分布最广的生物具有非常大的开发价值空间，对于筛选一系列 产纤维素酶细菌菌群，得到高产而且具较好稳定性纤维素酶新的菌群也是一个研究热点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能够产纤维素酶的新的细菌——根围金黄杆菌 (Chryseoba cterium rhizosphaerae)GIMN1. 005，该菌于 2009 年 10 月 20 日保藏于中国典 型培养物保藏中心(CCTCC)Jiyi 中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO :M209230。本发明的根围金黄杆菌是从越南采集的根际土壤中分离培养获得的。该菌培养 条件为培养基采用营养琼脂培养基(NA)，具体配方为蛋白胨10. 0g，酵母膏5g，氯化钠 5g，琼脂 20. 0g,7jC 1000ml ；pH6. 8 7. 0。培养温度:30°C。其形态特征该根围金黄杆菌在平板上培养24h后的菌落呈金黄色，圆形或不规 则形，表面光滑半透明，边缘整齐；革兰氏染色为阴性，菌体杆状，具有周身纤毛，不运动，无 荚膜，不形成芽孢。本发明根围金黄杆菌(Chryseobacteriumrhizosphaerae) GIMN1. 005 的分子分类 地位的确定。常规方法提取根围金黄杆菌的16SrDNA，其序列如SEQ ID NO :1所示，该序 列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的 16SrDNA序列，构建系统发育树，见于图2。经比较分析发现，本发明的根围金黄杆菌与菌 株(Chryseobacterium aquifrigidense KCTC 12894τ)亲缘关系最近，根围金黄杆菌的 16SrDNA 基因序列只与 Chryseobacterium aquifrigidense KCTC 12894τ 有 98. 6% 的同 源性，但通过DNA-DNA杂交显示，根围金黄杆菌与金黄杆菌模式菌株Chryseobacterium soli KACC12502T, C. jejuense KACC12501T, and C. taiwanense KACC12985T 分别只有 20. 3士0. 8%, 28. 6士0. 6%和 18. 1 士0. 的同源性。将本发明的根围金黄杆菌与其同源性最高的金黄杆菌菌株进行微生物学特性分析，具体结果见于表1。表1根围金黄杆菌与其同源性最高的金黄杆菌菌株微生物学特性比较 注+，阳性；-，阴性；+/_，弱阳性；NA，无可取数据由表1可以看出，本发明的根围金黄杆菌，其接触酶试验为阳性；能水解明胶、淀粉和酪蛋白；吲哚为阴性；不利用柠檬酸盐，在L-海藻糖、D-甘露醇、甘露糖、麦芽糖中产 酸，不能利用纤维二糖、蔗糖、松三糖、棉子糖、木糖、蜜二糖、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、 赖氨酸脱羧酶，在糖类中生长不产气；ONPG为阳性，尿素为阴性。生长温度范围5-37°C， 以及生长PH值范围为5. 0-9.0，其甲基萘醌主要类型为MK-6。与其同源性最高的菌株 C. aquifrigidense KCTC 12894τ在生理生化特征、G+Cmol%,以及细胞壁脂肪酸种类和含 量等各方面都存在差异。C.aquifrigidense KCTC 12894τ的生理生化特征是在麦康凯琼脂 上不生长，不产H2S,不利用海藻糖，生长范围为15-35°C，pH范围为6. 0-9. 0，硝酸盐还原为 阳性，G+Cmol %为35. 6mol % ；而根围金黄杆菌能在麦康凯琼脂上生长，产H2S，利用海藻糖， 生长范围为5-37°C, pH范围为5. 0-9. 0，硝酸盐还原为阴性，G+Cmol%为42. Imol%0除此 以外，C. aquifrigidense KCTC 12894τ的脂肪酸主要种类和含量分别为iso-C15:(1 (45. 5% )， ISO-L17. lv9c (14. 4%) ？ iso—C17.Q3-OH (13. O% ) and summed feature 3 (comprising iso_C15:02—0H and/or C16llv7c ；8. 8% )，而根围金黄杆菌为 iso-C17:(13_QH (22. 41% ), iso-C17:lw9c (19. 20% ) 和iso-C15:Q(18. 3%)。而且根围金黄杆菌的16SrDNA基因序列只与C. aquifrigidense KCTC 1289#有98. 6%的同源性，综合上述数据，可以证明它们不是同一个种。综合16SrDNA序列分析、微生物学特性分析和DNA-DNA杂交结果(1987年国际系 统细菌学委员会ICSB规定，DNA同源性小于70%或杂交分子的热解链温度差小于或等于 2°C为细菌种的界线，Wayne et al，1987)，表明本发明的芽孢杆菌是一种新的细菌，命名为 根围金黄杆菌(Chryseobacterium rhizosphaerae) GIMN1. 005，该菌于 2009 年 10 月 20 日 保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO :M209230。经实验发现，本发明的根围金黄杆菌具有产生纤维素酶的能力。因此本发明的另外一个目的是提供根围金黄杆菌(Chryseobacterium rhizosphaerae)GIMN1. 005在产纤维素酶上的应用。由于本发明的根围金黄杆菌具有产生纤维素酶的能力，可用于生产纤维素酶，因 此对纤维素酶的生产和利用纤维素酶降解纤维素的研究和利用具有重要的价值。本发明的根围金黄杆菌(Chryseobacterium rhizosphaerae)GIMN1. 005 已于 2009年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学， 保藏编号为 CCTCC NO :M209230。
图1是本发明的根围金黄杆菌的透射电子显微镜照片(A，6000倍；B 超薄切片 7000 倍)；图2是本发明的根围金黄杆菌及部分相关菌株依据16S rDNA序列构建的系统发育树。
具体实施例方式以下是对本发明做进一步的说明，而不是对本发明的限制。实施例1 ―、卞艮Iimff胃(Chryseobacterium rhizosphaerae) GIMN 1.005 的^>畠。
从越南根际0-30cm土样，取IOg土壤放入装有90mL无菌水的三角瓶中(带玻珠)， 在ISOrpm转速下振荡30分钟，静置10分钟后取上层液稀释10倍后取0. ImL均勻涂布在 NA琼脂培养基板上，翻转平板置于30°C培养箱中培养7天，即可获得本发明所述的根围金 黄杆菌(Chryseobacterium rhizosphaerae)GIMNL 005。所述的营养琼脂培养基的配方为蛋白胨10. Og,酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂 20. Og,水 IOOOml ；ρΗ6· 8 7. 0。本发明的根围金黄杆菌(Chryseobacteriumrhizosphaerae) GIMN1. 005 具有下述 特征1、形态特征根围金黄杆菌在电镜下的形态见于图1的A和B，该菌在平板上培养24h后的菌落 呈金黄色，圆形或不规则形，表面光滑半透明，边缘整齐；革兰氏染色为阴性，菌体杆状，具 有周身纤毛，不运动，无荚膜，不形成芽孢。2、生理生化特征经生理生化测定，本发明的根围金黄杆菌的接触酶试验为阳性；能水解明胶、淀粉 和酪蛋白；喷哚为阴性；不利用柠檬酸盐，在L-海藻糖、D-甘露醇、甘露糖、麦芽糖中产酸， 不能利用纤维二糖、蔗糖、松三糖、棉子糖、木糖、蜜二糖、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、赖 氨酸脱羧酶，在糖类中生长不产气；ONPG为阳性，尿素为阴性。生长温度范围5-37°C，以及 生长PH值范围为5. 0-9.0。3、其他性质甲基萘醌的主要类型为MK-6，细胞壁脂肪酸种类和含量如表2。表2根围金黄杆菌与其同源性高的金黄杆菌菌株的细胞壁脂肪酸种类和含量比 较 *表示有两到三组脂肪酸不能用气相液谱MIDI系统所分离。3包括isO-C15:(12-0H 和 / 或 C16:lv7。；4 包括 iso-C17: II 和 / 或 anteiso-C17:1B.二、根围金黄杆菌16SrDNA的序列测定与分析1、PCR模板DNA的快速制备将根围金黄杆菌划线接种在NA培养基的平板上，30°C培养过夜。取单一菌落悬浮 于10 μ 1无菌蒸馏水中，于沸水中加热5min，离心，取上清作为PCR模板DNA.2、16SrRNA 基因 PCR 扩增PCR引物由上海英骏公司合成。PrimerA :5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，PrimerB :5’ -AAGGAGGTGATCCACCCCCA-3’PCR 反应体系(总体积 50 μ 1) :10 倍缓冲液 5μ 1，dNTP (2 謹 ol/l) 4 μ 1， PrimerAdOpmo 1/1) 1 μ 1，PrimerB (IOpmo 1/1) 1 μ 1，Taq 酶(2U/1)0. 4μ 1，DNA 模板 1 μ 1, 灭菌 ddH20 37. 4 μ I0PCR 扩增条件-MV 5min ；94°C lmin，56°C lmin，72°C 2min，30 个循环；72°C 7min。3、序列测定PCR产物纯化后，送上海英骏公司用3730全自动测序仪测序，其序列如SEQ ID N0:1所示。该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库 获得相关种属的16SrDNA序列，构建系统发育树，见于图2。经比较分析发现，本发明的 根围金黄杆菌与菌株(Chryseobacterium aquifrigidense KCTC 12894τ)亲缘关系最 近，根围金黄杆菌的16SrDNA基因序列只与Chryseobacterium aquifrigidense KCTC12894τ有98. 6 %的同源性，但通过DNA-DNA杂交显示，根围金黄杆菌与金黄杆菌模式菌 株 Chryseobacterium soli KACC12502T, C. jejuense KACC12501T, and C. taiwanense KACC12985T 分别只有 20. 3士0. 8%,28. 6士0. 6%和 18. 1 士0. 的同源性。将本发明的根围金黄杆菌与其同源性最高的金黄杆菌菌株进行微生物学特性分 析，具体结果见于表1。由表1可以看出，本发明的根围金黄杆菌与其同源性最高的菌株 C. aquifrigidense KCTC12894T在在生理生化特征、G+Cmol %等方面都存在差异。 C. aquifrigidense KCTC 12894τ在麦康凯琼脂上不生长，不产H2S,不利用海藻糖，生长范围 为15-35°C，pH范围为6. 0-9.0，硝酸盐还原为阳性，G+Cmol %为35. 6mol% ；而根围金黄杆 菌能在麦康凯琼脂上生长，产H2S,利用海藻糖，生长范围为5-37°C，pH范围为5. 0-9. 0，硝 酸盐还原为阴性，G+Cmol %为42. Imol %。综合16SrDNA序列分析、微生物学特性分析和DNA-DNA杂交结果(1987年国际系 统细菌学委员会ICSB规定，DNA同源性小于70%或杂交分子的热解链温度差小于或等于 2°C为细菌种的界线，Wayne et al，1987)，本发明的芽孢杆菌是一种新的细菌，命名为根围 金黄杆菌(Chryseobacterium rhizosphaerae) GIMN1. 005，该菌于 2009 年 10 月 20 日保藏 于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC N0 M209230。三、根围金黄杆菌产生的纤维素酶产生测定挑取本发明的根围金黄杆菌的单菌落，接种至羧甲基纤维素(CMC)的选择性平板 培养基，在30°C的培养箱中培养1-2天，lmg/mL的刚果红溶液，10-15分钟后，倒去刚果红溶 液，加入物质的量浓度为lmol/L的NaCl溶液，15分钟后倒掉NaCl溶液，观察在平板上是否 出现透明圈。测试结果发现，平板上出现了透明圈，由此表明本发明的根围金黄杆菌具有产生 纤维素酶的能力，可用于纤维素降解研究和利用。
权利要求
一种根围金黄杆菌(Chryseobacterium rhizosphaerae)GIMN1.005，其保藏编号为CCTCCNOM209230。
2.权利要求1所述的根围金黄杆菌在产纤维素酶上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种根围金黄杆菌及其应用。本发明分离得到了一种能够产纤维素酶的新的细菌——根围金黄杆菌(Chryseobacterium rhizosphaerae)GIMN1.005，该菌于2009年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NOM209230。因为本发明的根围金黄杆菌能够产生纤维素酶，可用于产纤维素酶的应用上，因此对纤维素酶的生产和利用纤维素酶降解纤维素的研究和利用具有重要的价值。
文档编号C12N9/42GK101921723SQ20101026916
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月25日 优先权日2010年8月25日
发明者冯广达, 朱红惠, 王永红, 羊宋贞, 陈美标, 黎志坤 申请人:广东省微生物研究所