专利名称：用于治疗性干预的y2选择性受体激动剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及相对于Y1和Y4受体而言，可作为Y2选择性激动剂的肽或肽化合物，和它们在治疗因Y2受体激活所致反应疾病中的应用，例如治疗肥胖和超重与认为这些是影响因素的和诱导血管生成的疾病。
背景技术：
肽的PP-折叠家族-NPY(神经肽Y)(人序列-SEQ ID.No1)、PYY(肽YY)(人序列-SEQ ID.No2)和PP(胰腺多肽)(人序列-SEQ ID.No3)是天然分泌的同源性，36个氨基酸，C-末端酰胺化的肽，这些肽的特征为有共同的三维结构-PP-折叠，该结构即使在稀释的水溶液中也出人意料地稳定并且对这些肽的受体识别很重要。
首先，通过下调分辨率至0.98的X-射线晶体图分析和该肽获得名称的独特结构详细鉴定了禽类PP的X-射线结构特征(Blundell等，1981Proc.Natl.Acad.Sci.USA 784175-79；Glover等，1984，Eur.J.Biochem.142379-85)。然后，特别通过NMR图谱分析分析了该家族其它成员的PP-折叠结构。X-射线和NMR分析显然要在高度浓缩的或固体条件下进行；然而，详细的圆二色性分析提示NPY和PP即使在水溶液中仍采取PP-折叠结构，这对此种小肽是罕见的(Fuhlendorff等，1990 J.Biol.Chem.26511706-12)。重要的是，对这些肽以及它们的片段和类似物的蛋白酶水解稳定性分析表明，例如全长PP1-36即使为稀释的水溶液也保持折叠构型从而保护其免遭某些酶的降解，所述酶能容易且快速地降解因少许取代而不能采取PP-折叠结构的类似物(Schwartz等，1990 Annals NY Acad.Sci.61135-47)。
NPY、PYY和PP共有的PP-折叠结构由以下部分组成1)N-末端聚脯氨酸样螺旋(对应于含Pro2、Pro5和Pro8的残基1-8)，其后是2)I型β-转角区(对应于残基9-12)，然后是3)与聚脯氨酸螺旋反平行的具有152°角度的两亲性α-螺旋(残基13-30)，和4)C-末端六肽(残基31-36)。与3个疏水性脯氨酸残基紧密相互交叉的两亲性α-螺旋侧链之间的疏水相互作用稳定了此折叠结构(Schwartz等，1990)。除了受体识别C-末端六肽中的关键残基外，稳定PP-折叠结构的核心疏水残基在PP-折叠肽家族中也是保守的。
图1A描述了NPY、PYY和PP中保守的NPY序列和残基，以黑底白字表示。图1A也说明了上述PP-折叠结构的元件。通常认为，对受体识别重要的C-末端六肽是非结构性的(unstructured)，但PP折叠提供了将C-末端六肽提供给受体的稳定支架(见图1B描述)，就变化程度而言，这些受体也依赖于或不依赖于这些肽的N-末端部分。NMR图谱分析证明，例如NPY的远处C-末端和N-末端部分颇可移动，这意味着PP-折叠经常处于游离末端被“拉开”的危险中。
NPY是在中枢和外周神经系统各部分中具有多种作用的分布极广的神经肽，通过人体中许多不同的受体亚型，Y1、Y2、Y4和Y5起作用。主要的NPY受体是Y1受体和Y2受体，Y1受体一般是传输NPY神经元“冲动”的突触后受体，Y2受体一般是突触前抑制性受体。该情况也见于下丘脑，下丘脑中也表达黑皮素受体拮抗剂/反向激动剂AgRP(野灰相关肽)的NPY神经元在弓形核的刺激(传入)支中起基础“传感”神经元作用。因此，在该控制食欲和能量消耗的“传感核”中，NPY/AgRP神经元与抑制性POMC/CART神经元一起监控机体的激素和营养状态，因为这些神经元是长期调节剂如瘦蛋白和胰岛素，和短期调节剂如生长素释放肽和PYY(见下文)的靶点。刺激性NPY/AgRP神经元也凸入例如下丘脑的室旁核中，认为该处其突触后靶受体是Y1和Y5受体。就增进食物摄入而言，NPY是已知最强效化合物，因为啮齿类动物经脑室内(ICV)注射NPY后将不断进食直至饱撑。NPY/AgRP神经元的AgRP作用主要是作为4型黑皮素受体(MC-4)的拮抗剂，能阻断POMC衍生肽(主要是aMSH)对该受体的作用。由于MC4受体信号起到进食抑制剂作用，AgRP的作用与NPY的一样是一种进食刺激信号(即，对抑制作用的抑制)。在NPY/AGRP神经元上发现了抑制性突触前Y2受体，该受体是局部释放的NPY以及肠激素PYY(另一种PP-折叠肽)的靶点。
PYY在进食期间从小肠末端和结肠部位的肠道-内分泌细胞释放(与食物中的卡路里含量成比例)，作用于胃肠道外周(神经)功能和中枢(神经)，是一种饱食信号。就外周(神经)而言，认为PYY的功能是上部胃肠道运动性、胃酸和胰腺外分泌的抑制剂(回肠中断(illeal break))。就中枢(神经)而言，认为PYY主要作用于弓形核NPY/AgRP神经元的突触前抑制性Y2受体，认为其可通过血液接近该受体(Batterham等，2002 Nature 418650-4)。该肽以PYY1-36释放，但是其一部分(约50％)以PYY3-36在血中循环，PYY3-36是二肽基肽酶-IV的降解产物，该酶切除此肽的N-末端二肽，前提是如所有三种PP-折叠肽-PP、PYY和NPY那样，在二位发现Pro或Ala(Eberlein等，1989 Peptides 10797-803)。因此，血循环中的PYY是作用于Y1和Y2受体的PYY1-36和对Y1、Y4和Y5受体的亲和力低于Y2受体的PYY3-36的混合物。
PP是一种胰岛内分泌细胞释放的激素，几乎完全受特别是食物摄入引起的迷走神经胆碱能刺激的控制(Schwartz 1983 Gastroenterology 851411-25)。PP对胃肠道有各种作用，但是在大多数分离的细胞和器官中未观察到PP，并且似乎依赖于完整的迷走神经供应(supply)(Schwartz 1983 Gastroenterology851411-25)。鉴于此，称为Y4受体的PP受体位于脑干中，在迷走神经运动神经元(vagal motor neurones)(其激活导致PP的外周作用)和单生核束(NTS)(其激活导致PP作为饱食激素的作用)中有强烈表达(Whitecomb等，1990Am.J.Physiol.259G687-91，Larsen & Kristensen 1997 Brain Res.Mol.Brain Res481-6)。应理解，由于在血脑屏障的感觉性外周(神经)区域各种激素对该区域是“可渗入的”，血液中的PP可进入大脑的该区域。近年来，有争论说PP对食物摄入的部分作用是通过对神经元，特别是弓形核中的POMC/CRAT神经元起作用而介导的(Batterham等，“Coimbra国际NPY研讨会2004摘要3.3”(2004Abstract 3.3 International NPY Symposium in Coimbra)，葡萄牙)。PP通过Y4受体起作用，与PYY和NPY对Y4受体的亲和力为纳摩尔(nanomolar)级，PP对该受体的亲和力为亚纳摩尔(subnanomolar)级(Michel等，1998 Pharmacol.Rev.50143-150)。PP对Y5受体也具有相应的亲和力，但由于无法接近CNS中专门表达该受体的细胞和(该受体)对PP的亲和力较低，PP的生理学重要性不可能与循环PP有相关。
PP-折叠肽受体熟知人体中有四种类型以相似亲和力识别NPY1-36和PYY1-36的PP-折叠肽受体Y1、Y2、Y4和Y5。曾提出过对NPY的亲和力超过PYY的Y3受体类型，但现在不接受其为真正的受体亚型(Michel等，1998 Pharmacol.Rev.50143-150)。Y6受体亚型已得到克隆，然而它在人体内表达为缺乏TM-VII以及受体尾部的截短形式，因此看来至少其本身不能形成功能性受体分子。
Y1受体-亲和力研究提示Y1能同样良好地结合NPY和PYY，但基本上不结合PP。对Y1的亲和力取决于PP-折叠分子(NPY/PYY)的两末端序列(例如，残基Try1和Pro2是必须的)和此肽两末端能否以正确方式呈递。在含几个必需残基侧链的C-末端，Y1受体(像Y4和Y5受体而不是Y2受体那样)可耐受34位(通常是Gln)的某些取代，例如Pro(Fuhlendorff等，1990 J.Biol.Chem.26511706-12；Schwartz等，1990 Annals NY Acad.Sci.6135-47)。关于Y1和Y2受体必须的某些结构-功能研究已见报道(Beck-Sickinger等，1994Eur.J.Biochem.225947-58；Beck-Sickinger和Jung，1995 Biopolymers 37123-42；Sll等，2001 Eur.J.Biochem.2682828-37)。
Y2受体-亲和力研究提示Y2受体能同样良好地结合NPY和PYY，但基本上不结合PP。该受体特别需要PP-折叠肽(NPY/PYY)的C-末端。因此，长的C-末端片段(下至例如NPY13-36(整个α螺旋加上C-末端六肽))识别亲和力较高，即该全长肽的亲和力的10倍之内(Sheikh等，1989 FEBS Lett.245209-14；Sheikh等，1989 J.Biol.Chem.2646648-54)。所以，各种不能结合Y1受体的N-末端缺失(片段)在一定程度上仍能结合Y2受体。然而，即使较长的C-末端片段的亲和力与NPY/PYY相比降低了约10倍。NPY和PYY的34位Gln残基对Y2受体的配体识别极其重要(Schwartz等，1990 AnnalsNY Acad.Sci.61135-47)。
Y4受体-亲和力研究提示对应于血浆中发现的浓度，Y4以亚纳摩尔亲和力结合PP，而以低得多的亲和力结合NPY和PYY。这种研究提示Y4受体高度依赖于PP-折叠肽的C-末端，较短的N-末端缺失将损伤对配体的亲和力。关于Y4受体的几项结构活性研究已见报道(Gehlert等，1996 Mol.Pharmacol.50112-18；Walker等，1997 Peptides 18609-12)。
Y5受体-亲和力研究提示Y5能同样良好地结合NPY和PYY，也以较低的亲和力结合PP，然而亲和力低于该激素的正常血循环水平。Y5受体也能良好地识别PYY3-36，然而该受体在CNS中也有很大程度的表达，当将PYY3-36施用于外周(神经)中时，不易接近CNS中的此受体。
根据这些肽中的某些在动物模型和人体中所显示的作用和肥胖人的PYY和PP基础水平低以及对这些肽的进食反应较低，已提出PP-折叠肽及其类似物可用于治疗肥胖和相关疾病，包括例如普-韦综合征(Holst JJ等，1983Int.J.Obes.7529-38；Batterham等，1990 Nature)。给普-韦综合征患者输注PP早已显示能降低食物摄入(Berntson等，1993 Peptide 14497-503)，该作用通过在正常人对象中输注PP得到证实(Batterham等，Clin.Endocrinol.Metab.883989-92)。也有人提出PP-折叠肽可用于例如治疗新血管生成(Zukowska等，2003 Trends Cardiovasc Med.1386-92)和炎性肠病(参见，例如WO 03/105763)。
然而，天然PP-折叠肽用作生物药物不是最佳。例如，全长肽PYY1-36和NPY1-36肽与所有的Y2受体类型有广泛反应，因此会导致心血管副作用，例如呕吐。此外，天然肽的蛋白质稳定性未经优化，因为它们作为神经肽或神经激素的作用时间通常较短。例如，天然产生的Y2选择性更强的肽PYY3-36的缺点在于其PP-折叠结构因缺乏聚脯氨酸螺旋的重要Pro2残基而受损，因为在全长肽中Pro2与该分子两亲性螺旋区域中的Tyr27相互作用。
因此，为治疗对Y受体调节起反应的疾病，需要采用Y受体PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物，这些肽或模拟物对选作靶点的Y受体应是特异性的并稳定地保留了对受体结合很重要的PP-折叠结构元件。特别是更需要采用对Y2受体的选择性超过Y1和Y4受体的这类药物。Y2受体是用于治疗肥胖、代谢综合征等对例如食物摄入和能量消耗具有有益作用的受体，并且Y2受体对诸如外周血管病或冠状血管病患者获得治疗性血管生成也具有有益作用。然而，用作Y2受体激动剂的药物并非都适用于这种治疗，除非它对Y2受体的选择性超过Y1和Y4受体。例如，对Y1受体的激动作用在心血管系统(血压升高)以及肾脏系统(尿钠排泄)中将诱导严重的副作用。类似地，需要对Y2的选择性超过Y4受体，因为两种天然的Y2和Y4激动剂，PYY和PP各自对例如胃肠道具有许多类似的作用，其中一些作用有益而一些可能导致有害副作用。例如，Y2和Y4分别通过神经元和直接上皮作用方式促进小肠和大肠的抗分泌作用(Cox等，2002 Br.J.Pharmacol.1351505-12)。因此，通过Y2和Y4受体联合刺激可能获得叠加的或者甚至可能协同的抗分泌作用，这可能导致便秘。
本说明书中所用的一些共同术语亲和力肽与特异性受体的亲和力以例如IC50值或Kj或Kd值给出，在具体的非限制性例子中，这些值可用试验，例如竞争性结合试验测定。IC50值对应于取代所用的与给定受体相关的放射性配体50％的肽浓度，其用量远低于该放射性配体的Kd。
食欲对食物的自然欲望或渴求。食欲增加通常导致进食行为的增加。
食欲抑制剂能降低对食物需求的化合物。
结合两种分子之间的特异性相互作用，可使得该两种分子相互作用。与受体的结合可以是特异性和选择性的，所以与另一种分子相比，可优先结合某种分子。可通过解离常数(Kd)鉴定特异性结合。其值取决于对测试化合物的选择性。例如，通常认为Kd小于10nM的化合物是优秀的候选药物。然而，亲和力较低但对具体受体具有选择性的化合物也可以是良好的候选药物。
体重指数(BMI)一种衡量体重的数学式，有时也称为Quetelet指数。通过体重(以kg计)除以身高2(以米计)来计算BMI。目前，所接受的男性和女性的“正常”标准为BMI约20kg/m2。在一个实施方案中，超过25kg/m2的BMI可用于鉴定肥胖对象。I级肥胖对应的BMI是25kg/m2。II级肥胖对应的BMI是30-40kg/m2；III级肥胖对应的BMI是40kg/m2以上(Jequier 1987 Ain.JClin.Nutr.451035-47)。按照身高、身体构成、骨结构和性别，不同人种和个体的理想体重有所不同。
热量摄入或卡路里摄入个体所消耗的卡路里(能量)数量。在本文中该术语等同于“能量摄入”。
美容治疗该术语表示不是为医学目的，而是为改善对象的幸福程度，例如与对象外貌有关的治疗。该术语包括治疗想要降低体重，但不一定是超重或肥胖的对象。
食物摄入个体消耗的食物量。食物摄入可通过体积或重量来衡测。包括I)食物摄入是个体消耗的食物总量，和ii)食物摄入指个体的蛋白质、脂肪、碳水化合物、胆固醇、维生素、矿物质或其它食物成分的摄入量。因此，本文使用的术语食物摄入类似于术语“能量摄入”。
每日正常饮食给定人种的个体平均食物摄入。每日正常饮食可以卡路里摄入、蛋白质摄入、碳水化合物摄入和/或脂肪摄入表达。人的每日正常饮食一般含有约2,000、约2,400或约2,800到明显更多的卡路里。此外，人的每日正常饮食一般含有约12g-45g蛋白质、约120g-610g碳水化合物和约11g-90g脂肪。低卡路里饮食的卡路里摄入不超过个人的正常卡路里摄入的约85％、优选不超过约70％。在动物中，卡路里和营养需求随动物的种类和体积而不同。例如，在猫中，每kg的总卡路里摄入以及蛋白质、碳水化合物和脂肪的分布百分比随猫的年龄和生殖状态而不同。
肥胖过多的身体脂肪使人们处于健康危险之中的状况(参见Barlow和Dietz，Pediatrics 102E29，1998；国家卫生研究院，国家心脏、肺和血液研究所(NHLBI)，Obes.Res.6(增刊2)59 S209S，1998)。过多的身体脂肪是能量摄入和能量消耗失衡的结果。在一个实施方案中，用体重指数(BMI)评估肥胖。在一个实施方案中，BMI为约22kg/m2(即，高于正常值约10％)-约30kg/m2，特别是约25.0kg/m2-30kg/m2认为是超重，BMI为30kg/m2或更高是肥胖。
超重体重超过其理想体重的个体。超重的个体可以是肥胖，但不一定是肥胖。在一个实施方案中，超重的个体是需要降低他们体重的任何个体。在另一实施方案中，认为超重个体是BMI约为22kg/m2(即，高于正常值约10％)-约30kg/m2，特别是从约25.0kg/m2-30kg/m2的个体。应注意BMI略微高于正常值的个体(例如约22kg/m2-25kg/m2)经常想减轻体重，虽然仅是为美容目的。
效力化合物的体外效力定义为EC50值，即在给定受体相关的信号转导试验中测定的导致最大可达到作用的50％的浓度。
对象对象可以是任何对象，包括人和兽医哺乳动物对象。因此，所述对象可以是人或者可以是非人灵长类，农业动物，例如猪、牛、绵羊和家禽，运动动物(sport animal)或宠物，例如狗、猫、马、仓鼠和啮齿类动物。
治疗有效量足以预防、治疗或缓解特定病症或疾病和/或缓解特定病症或疾病的特定体征或症状的剂量。该术语包括足够的或能预防疾病发展，或导致疾病衰退，或能减轻疾病的体征或症状，或能实现所需结果的剂量。在涉及美容治疗或超重或肥胖治疗的实施方案中，受体激动剂的治疗有效量是足以抑制或停止体重的增加，或足以降低食欲的量，或足以减少能量或食物摄入或增加能量消耗的量。术语“美容有效量”指足以治疗对象以实现所需效果的剂量。
发明详述在最广义方面，本发明提供了除PYY3-36以外的Y受体激动剂在制备用于激活Y2受体的组合物中的应用，该激动剂对Y2受体的选择性超过Y1和Y4受体，(a)所述激动剂是选自PYY、NPY、PYY模拟物和NPY模拟物的PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物，这些肽或肽模拟物不具有对应于NPY的Tyr1的酪氨酸残基和/或不具有对应于NPY的Pro2的脯氨酸残基和/或不具有对应于NPY的Ser3的丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸残基不具有对应于NPY的Lys4的赖氨酸或精氨酸残基和/或在对应于NPY的Leu24位具有除亮氨酸以外的残基和/或在对应于NPY的Arg25位具有除精氨酸以外的残基和/或在对应于NPY的His26位具有除组氨酸以外的残基和/或在对应于NPY的Ile28位具有除异亮氨酸以外的残基和/或在对应于NPY的Asn29位具有除天冬酰胺以外的残基和/或在对应于NPY的Leu30位具有除亮氨酸或甲硫氨酸以外的残基；或(b)所述激动剂是选自PP和PP-模拟物的PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物，这些肽和肽模拟物具有C-末端Y2受体识别氨基酸序列以及在对应于PP的Pro2位不具有脯氨酸残基和/或在对应于PP的Leu3位不具有亮氨酸残基和/或在对应于PP的Glu4位不具有谷氨酸残基；或(c)所述激动剂(i)具有C-末端Y2受体识别氨基酸序列，该序列在N-末端与在毗邻所述Y2受体识别序列N-末端处具有至少一个α螺旋转角的两亲性氨基酸序列结构域融合，所述转角因分子内共价键而束缚于螺旋构型中，和(ii)，如果该激动剂具有类似于NPY或PYY的N-末端结构，其具有一个或多个以上(a)所列出的修饰，以及如果所述激动剂具有类似于PP的N-末端结构，其具有一个或多个以上(b)所列出的修饰。
发明相关的特定术语本发明所考虑的激动剂是对Y2受体的选择性超过Y1和Y4受体的激动剂。在本文中，当激动剂用本文所述亲和力试验测定时，对Y2的IC50值比对Y1和Y4受体的至少低10倍，则符合该条件。总体上，就效力而言，本发明的激动剂用本文所述效力试验测定时，对Y2的EC50值比对Y1和Y4受体的至少低10倍。许多本发明优选的激动剂对Y2受体的亲和力和效力比对Y1和Y4受体的至少高100倍，这与用天然肽PYY3-36所获得的相比有较大差异。一些本发明优选的激动剂对Y2受体的亲和力和效力比对Y1和Y4受体的至少高1000倍。
出于本说明书的目的，PP-折叠肽是具有3-D结构的分子，当用X-射线晶体图测定禽类PP的原始3-D结构(Blundell等，1981 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 784175-79；Glover等，1984，Eur.J Biochem.142379-85)作图时，该结构的结构域相当于(和基本上这样排列的)所述NPY、PYY和/或PP的N-末端聚脯氨酸样螺旋、I型β转角区域、两亲性α-螺旋和C-末端六肽结构域(图1)。因此，本文所用的PP-折叠肽不同结构域的描述可参见禽类PP的原始X-射线结构(Blundell等，1981 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 784175-79；Glover等，1984，Eur.J.Biochem.142379-85；Schwartz等，1990)。
出于本说明书的目的，PP-折叠肽模拟物是具有3-D结构的分子，当对禽类PP的原始3-D结构作图时，该结构的结构域相当于(和基本上这样排列的)所述PP两亲性α-螺旋最后一个转角和C-末端六肽结构域。当如上述作图时，PP-折叠肽模拟物的结构域也相当于两亲性α螺旋的一个或多个其余的转角(remaining turn)、N-末端聚脯氨酸样螺旋和I型β转角区域。肽模拟物无需完全由经典肽键相连的α氨基酸序列构成。这种序列中的一个或多个键可被肽模拟物键，例如反酰胺(reverse amide)和还原的肽键替代，因而可将该肽模拟物视为拟肽序列。这类键替代能赋予该分子抵抗内肽酶的降解和改善其药代动力学特性。
可根据原子坐标通过构建比较分子模型，或利用一种或多种计算机程序来比较以上“PP-折叠肽”和“PP-折叠肽模拟物”定义的3-D结构，所述原子坐标可通过例如X-射线衍射方法测定，所述计算机程序可购得以便从其分子结构式目测其预期的3-D结构，例如Schrodinger Inc(1500 S.W.，First Avenue，Suite 1180，Portland，OR 97201)的“Maestro Modelling Environment”，；AccelrysInc.(San Diego)的“InsightII Modeling Environment”，Release 4.0；和TriposInc.(1699 South Hanley Rd.，St.Louis，Missouri，63144，USA)的“SYBYL7.0”。应注意本发明的PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物的3-D结构与天然的NPY、POY或PP无需和一般不具有精确的对应关系。PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物的表观3-D结构视用于研究该结构的实验条件而不同，特别是较小的肽在某些条件下可呈现或多或少的非折叠结构。然而，以下条件是充分的PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物应具有对应于上述那些PP-折叠结构域的结构域，具有使之采取类似于天然肽总体形状的结构元件，其中C-末端序列和N-末端序列(如果存在的话)是正常取向。
如本发明考虑的激动剂的用途一样，C-末端Y2受体识别序列是位于该激动剂C-末端的通常约5-7个残基长的序列，特别是六肽序列，当存在于PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物中时，它能结合Y2受体和通过此结合作用而激活该受体。在天然NPY或PYY肽中发现了此种典型的C-末端Y2受体识别序列，但本文将说明，这些典型序列可经修饰，例如保留Y2识别(能力)但降低Y1识别(能力)。如果在本文所述的亲和力和/或效力试验中所述PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物与Y2受体相互作用，存在于任何具体激动剂中的C-末端序列是Y2受体识别序列，当该识别序列被删除，C-末端序列虽存在但不能(相互作用)(或程度不明显)。
在本说明书中，诸如“对应于NPY的Ser3的残基”术语指该激动剂的3-D结构对NPY的3-D结构作图时，图中最接近NPY的Ser3的氨基酸残基。类似地，诸如“在对应于PP的Glu4的位”的术语指该激动剂的3-D结构对PP的3-D结构作图时，该激动剂在图中最接近NPY的Glu4的氨基酸残基位置。由于其天然肽中可能发生例如缺失，特定肽中具体残基的实际编号可能与此不同。
总体上，本发明考虑的PP-折叠或PP-折叠模拟物激动剂通常具有肽骨架或部分是肽的骨架，至少具有C-末端氨基酸序列和经常具有N-末端氨基酸序列，虽然骨架的其余部分可以是非肽接头基团，例如直链或支链亚烷基链。存在于该激动剂的肽(peptidic)部分，特别是与Y2受体相互作用的C-和N-末端序列中的氨基酸通常是天然产生的，但也可存在保留了PP-折叠但不阻止Y2受体结合的非天然α氨基酸。
当本发明考虑的激动剂具有C-或N-末端氨基酸序列时，可以酰胺化C-末端和/或可以酰化N-末端以赋予对羧肽酶和/或氨肽酶的抗性。事实上，天然NPY、PYY和PP肽的C-末端是酰胺化的，所以本发明激动剂的C-末端氨基酸也可酰胺化。
在本说明书中，提及氨基酸时可用其通用名或缩写，例如缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)和脯氨酸(Pro)。当用通用名或缩写提到氨基酸而未明确说明其立体异构形式时，应理解所述氨基酸是L-形。在提到D-形时会特别指明D-形氨基酸。有时，在本文想要这样做时，特指L-形而非推断。
本文所用的术语“保守取代”表示一个或多个氨基酸被另一个生物学类似的残基取代。例子包括用性质相似的氨基酸残基，例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸取代。适用于本发明的保守氨基酸取代的非限制性例子包括用下表中性质相似的非天然α氨基酸的原来残基进行类似取代。例如，在本发明优选的实施方案中，Met残基可用正亮氨酸(Nle)取代，正亮氨酸是Met的生物等构物但(与Met相反)不易氧化。用通常在哺乳动物内源性肽和蛋白质中未发现的残基进行保守性取代的另一例子是用例如鸟氨酸、刀豆氨酸、氨基乙基半胱氨酸或其它碱性氨基酸保守性取代Arg或Lys。关于肽和蛋白质中表型沉默取代的其它信息可参见，例如Bowie等，Science 247，1306-1310，1990。
除非本文另有指明，应用于本文任何部分的术语“取代的”指用多达4个相容性取代基取代，其中每个独立为，例如(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、羟基、羟基(C1-C6)烷基、巯基、巯基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷硫基、卤素(包括氟、溴和氯)、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、腈基(-CN)、氧代、苯基、-COOH、-COORA、-CORA、-SO2RA、-CONH2、-SO2NH2、-CONHRA、-SO2NHRA、-CONRARB、-SO2NRARB、-NH2、-NHRA、-NRARB、-OCONH2、-OCONHRA、-OCONRARB、-NHCORA、-NHCOORA、-NRBCOORA、-NHSO2ORA、-NRBSO2OH、-NRBSO2ORA、-NHCONH2、-NRACONH2、-NHCONHRB、-NRACONHRB、-NHCONRARB或-NRACONRARB，其中RA和RB独立为(C1-C6)烷基。“任选的取代基”可以是任一上述取代基团。
除非本文另有规定，本文提及的NPY、PYY和PP肽和它们的序列涉及那些肽的人形式和它们的序列。然而，如本文所用的那些术语一样，其它哺乳动物的NPY、PYY和PP常可构成人NPY、PYY和PP的PP-折叠肽模拟物，或保守取代的人NPY、PYY或PP。
本发明所用的(a)型激动剂总体上，(a)型激动剂是NPY或PYY的PP-折叠类似物，或NPY或PYY的PP-折叠模拟物，其含有修饰而大大降低了它们对Y1受体的效力。这种PP-折叠类似物和模拟物包括具有PP-折叠性质的完全互补序列的肽(N-末端聚脯氨酸样螺旋、β转角、两亲性α螺旋和C-末端六肽)、部分骨架(例如β转角残基和毗邻的残基)用非肽间隔链替代的肽类似物，和拥有C-末端六肽和两亲α螺旋最后一个转角但缺乏所有或部分聚脯氨酸样螺旋和/或β转角的截短的肽。
一组特别优选的本发明上述(a)型Y2-选择性激动剂在对应于NPY的Tyr1位具有除Tyr、Trp或Phe以外的残基和/或在对应于NPY的Pro2位具有除Pro以外的残基和/或在对应于NPY的Ser3位具有除Ile、Leu、Val、Phe、Trp、Tyr、Ser、Thr和Asn以外的残基和/或在对应于NPY的Lys4位具有除赖氨酸或精氨酸以外的残基。
该类激动剂的特别优选亚组由含有与人NPY相同序列的肽构成，除了其1位残基不是Tyr、Trp或Phe和/或2位残基不是Pro和/或3位残基不是Ile、Leu、Val、Phe、Trp、Tyr、Ser、Thr和Asn和/或4位残基不是赖氨酸或精氨酸。虽然优选这些激动剂与天然序列之间基本相同(除1-4位是上述任一特定改变之外)，天然序列其它残基，特别是远离C-末端六肽序列的保守性取代也可耐受。
本发明所用的(b)型激动剂总体上，(b)型激动剂是PP的PP-折叠类似物，或PP的PP-折叠模拟物，其含有修饰而大大降低了它们对Y4受体的效力并提高了对Y2受体的效力。与(a)型激动剂的情况一样，该类激动剂包括具有PP-折叠性质的完全互补序列的肽(N-末端聚脯氨酸样螺旋、β转角、两亲性α螺旋和C-末端六肽)、部分骨架(例如β转角残基和毗邻的残基)用非肽间隔链替代的肽类似物，和拥有C-末端六肽和两亲α螺旋最后一个转角但缺乏所有或部分聚脯氨酸样螺旋和/或β转角的截短的肽。
一组优选的本发明上述(b)型Y2-选择性激动剂在34位具有Gln或结构类似的残基，和在对应于PP的Pro2位具有除Pro、Tyr、Phe和Trp以外的残基和/或在对应于PP的Leu3位具有除Ile、Leu、Met和Val以外的残基和/或在对应于PP的Glu4位具有除Glu或Asp以外的残基。
该类激动剂的特别优选亚组由含有与人PP相同序列的肽构成，除了其34位具有Gln，2位残基不是Pro、Tyr、Phe和Trp和/或3位残基不是Ile、Leu、Met和Val和/或4位残基不是Glu或Asp。虽然优选这些激动剂和天然序列之间基本相同(除2-4位是上述任一特定改变之外)，天然序列的其它残基，特别是远离C-末端六肽序列的保守性取代也可耐受。
本发明所用的(c)型激动剂总体上，(c)型激动剂可认为是(a)和(b)型PP-折叠肽类似物或PP-折叠模拟物，它们最小的PP-折叠特征结构(C-末端六肽和α螺旋的最后一个转角)通过特定的分子内共价键连接而稳定。
该型激动剂的特征在于分子内连接键，这些键或在天然NPY、PYY或PP肽中无等价物，或对应于或用共价键替代非共价相互作用，例如在禽类PP的X-射线结构中观察到[Cys2，DCys27]PYY(SEQ ID No13)中Cys2和D-Cys27之间的共价二硫键，模拟了Pro2和Tyr27的侧链之间的非共价疏水相互作用。如上所述，这种键可用于稳定PP-折叠结构的基本元件，特别是可活动的C-末端Y2识别序列和α螺旋的最后一个转角，和/或提供N-末端。在全长或接近全长的肽中，这种键可稳定此类天然PP-折叠结构。这有利于两方面，首先，可稳定两亲性α螺旋的C-末端部分从而可以最佳方式提供C-末端Y2识别氨基酸序列进而提高对Y2受体的效力；第二，通过稳定整个PP-折叠结构使这类肽不易受蛋白酶解降解，因为这种酶往往需要它们的靶序列为非折叠形式(Schwartz等，1990)。分子内连接键也能使Y2-选择性激动剂相对于天然肽的结构有更多修饰，例如激动剂可缺乏天然肽中发现的一个或多个结构域或部分结构域。
一组类型(c)的激动剂具有PP-折叠结构，此结构中束缚螺旋转角的分子内连接键从两亲性结构域的一个氨基酸残基延伸至该激动剂的N-末端部分的连接点，该N-末端部分对应于反平行延伸至两亲性结构域的PP-折叠肽的聚脯氨酸结构域。当这种激动剂具有类似于NPY或PYY的N-末端结构，例如具有肽图中NPY或PYY的最后几个残基的N-末端结构域时，该激动剂应该没有对应于NPY的Tyr1位置的酪氨酸残基和/或没有对应于NPY的Pro2位置的脯氨酸残基和/或没有对应于NPY的Ser3位置的丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸残基和/或没有对应于NPY的Lys4位置的赖氨酸或精氨酸残基。当这种激动剂具有类似于PP的N-末端结构，例如具有肽图中PP的最后几个残基的N-末端结构域时，该激动剂应该没有对应于PP的Pro2位置的脯氨酸和/或没有对应于PP的Leu3位置的亮氨酸和/或没有对应于PP的Glu4位置的谷氨酸。在上述情况中的束缚螺旋转角的分子内连接键，例如二硫键或内酰胺键可从两亲性结构域的一个氨基酸残基延伸至4个N-末端残基之一。
该类激动剂的特别优选亚组由含有与人PYY相同的序列的肽构成，除了束缚螺旋转角的分子内连接键从两亲性结构域的一个氨基酸残基延伸至聚脯氨酸结构域N-末端部分的连接点。这种键可位于5位和20位，或8位和16位，特别是2位和27位的残基之间，例如27位D-Cys和2位Cys之间的二硫键。D-形Cys优选位于27位，因为这可将巯基侧链最佳地定向与2位引入的“正常”L-形Cys形成二硫键，从而使整个分子采取和模拟PP-折叠结构。应该注意虽然含有稳定的分子内连接键的全长PP-折叠肽可含有主要为Y1受体识别所需的分子的远端N-末端部分，本发明类似物的作用不是Y1受体激动剂或对其只有较低的上述效力。其原因在于，这种分子内连接键涉及Y1识别通常需要的残基，例如Pro2和Tyr27，或者当该连接键位于远离Y1识别表位的地方时，该肽中精细设计的取代保证了对Y2的选择性超过Y1。虽然优选这些激动剂与PYY天然序列之间基本相同(除工程改造的分子内连接键导致的任何改变之外)，天然序列的其它残基，特别是远离C-末端六肽序列的保守性取代也可接受。
在另一组(c)型激动剂中，束缚螺旋转角的分子内连接键在α螺旋结构域的最后一个螺旋转角中的残基之间延伸，例如在螺旋转角的Lys和Glu残基之间形成内酰胺连接键，或在C-末端Y2识别氨基酸序列中的残基和α螺旋结构域最后一个螺旋转角的残基之间延伸，例如在[Lys28，Glu32]PYY25-36(SEQ IDNo19图2B)中Lys28和Glu32之间的内酰胺连接键。该类激动剂的一个亚组含有与人PYY相同的序列，除了N-末端被截短，例如远至残基27，以及当然工程改造的分子内连接键需要的任何改变之外。
本发明所用的(a)、(b)和(c)型激动剂的各方面C-末端本发明考虑的是Y2选择性的所有3种类型的激动剂具有C-末端Y2受体识别氨基酸序列。根据采用本文所述的亲和力和效力测定的试验和误差不难确定某特定的C-末端测试序列能否识别Y2受体。存在于本发明激动剂中的一组优选的C-末端Y2受体识别氨基酸序列用-X-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示其中X不是碱性或酸性残基，R1和R1独立为氢或C1-C6烷基，或其保守性取代变体，其中Thr被His或Asn取代和/或Tyr被Trp或Phe取代；和/或Arg被Lys取代。本发明优选R1和R2均是氢。
一种具体的C-末端Y2受体识别氨基酸序列是-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(＝O)NH2，另一序列是-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
在一组本发明考虑的(a)、(b)或(c)型PP-折叠模拟激动剂中，含有Y2受体识别氨基酸序列的C-末端序列可在其N-末端与两亲性氨基酸序列结构域融合，该结构域含有毗邻所述表位N-末端的至少一个α螺旋转角和至少两个氨基酸的N-末端氨基序列，所述C-和N-末端氨基酸序列通过肽键与接头基团相连，该接头基团可以是任选含有一个或多个双键或三键的直链或支链亚烷基基团。例如，可分别为式NH2(CH2)nCO2H所示氨基酸的羧基和氨基使肽与接头基团相连，其中n是2-12，特别是6、7、8、9或10。因此，该激动剂可以是含有上述Cys-Cys键的NPY、PYY或PP类似物，但对应于天然肽5-24的氨基酸残基被具有6-10个碳原子的碳链的氨基羧酸取代，所述氨基羧酸选自6-氨基己酸(ε-氨基己酸)、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸和氨基癸酸。在具体实施方案中，优选8-氨基辛酸(本文有时缩写为“Aoc”)。这种激动剂的一个例子是[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY(SEQ ID No16；图2A)。
N-末端本发明考虑的所有3种Y-2选择性激动剂可在其N-末端酰化以赋予对氨肽酶活性的耐受性。例如，可酰化含有2-24个碳原子的碳链，N-末端酰化是具体的例子。
本发明所用的合适激动剂到目前为止，本发明所用的基础Y2-选择性激动剂已得到总体描述并提供了这种激动剂的具体例子。然而，为改善它们的药代动力学、药效学和代谢性能，可对这种激动剂，包括特别鉴定的激动剂作出各种修饰。这种修饰可涉及将该激动剂与本身为肽或蛋白质药物领域已知的功能基团(也称为基序)相连。无论(a)、(b)或(c)型，在本发明考虑的激动剂的情况中，有具体益处的三种特定修饰是与血清白蛋白结合基序或糖胺聚糖(GAG)相连，或PEG化。
虽然PYY3-36排除在本发明的用途之外，也可采用具有这种修饰的PYY3-36。
血清白蛋白结合基序血清白蛋白结合基序一般是亲脂性基团，将其引入能延长给药后(药物)在体内的驻留时间，或出于其它原因可用各种已知的方法将其与肽或蛋白质分子偶联，例如i)通过共价键，例如侧链氨基酸残上的功能基团，ii)通过插入该肽中的或适当衍生肽中的功能基团，iii)作为该肽的一种整合部分。例如，WO96/29344(Novo Nordisk A/S)、P.Kurtzhals等，1995 Biochemical J.312725-31和L.B.Knudsen等，2000 J.Med.Chem.431664-69描述了许多可用于本发明所考虑激动剂的合适亲脂性修饰。
合适的亲脂性基团包括任选取代的、饱和或不饱和的、直链或支链的10-24个碳原子的烃基团。这种基团可形成该激动剂骨架的侧链或其一部分，例如通过醚、硫醚、氨基、酯或酰胺键与骨架中氨基酸残基的侧链相连，或与PP-折叠模拟激动剂骨架中的非肽接头基团的骨架碳或骨架碳的支链相连。连接亲脂性基团的化学方法不是关键性的，但包含亲脂性基团的以下侧链是可与该激动剂的骨架碳相连的例子，或是其合适的支链CH3(CH2)nCH(COOH)NH-CO(CH2)2CONH-，其中n是9-15的一个整数，CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CONH-，其中r是9-15的一个整数，CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CONH-，其中s是9-15的一个整数，CH3(CH2)mCONH-，其中m是8-18的一个整数，-NHCOCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3，其中p是10-16之间的一个整数，-NHCO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3，其中q是10-16的一个整数，CH3(CH2)nCH(COOH)NHCO-，其中n是9-15的一个整数，CH3(CH2)pNHCO-，其中p是10-18的一个整数，-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3，其中m是8-18的一个整数，-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3，其中p是10-16的一个整数，-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3，其中q是10-16的一个整数，和部分或完全氢化的环戊菲(cyclopentanophenanthrene)骨架。
在一个化学合成方案中，含有亲脂性基团的侧链是酰化存在于激动剂骨架残基的侧链中的氨基的C12、C14、C16或C18酰基，例如十四烷酰基。
如上所述，对用于提供血清结合特性提高的激动剂进行修饰是一种通用方案，特别适用于以上列出的特定激动剂。因此，经合适修饰的激动剂包括Cys2，N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，D-Cys27]PYY、[Cys2，N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys4，D-Cys27]PYY、[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13]PYY3-36或[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys4]PYY3-36和它们的保守性取代类似物。
GAG结合在上述亲脂性血清结合基序例子中，可通过加入作为该激动剂骨架侧链(或其一部分)的GAG结合基序来修饰本发明考虑的激动剂。已知可以该方式加入的GAG-结合基序包括氨基酸序列XBBXBX和/或XBBBXXBX，其中B是碱性氨基酸残基，X是任何氨基酸残基。可将多条，例如3条这种序列以多联体(直链)或枝状体(支链)的方式加入。具体的多联体GAG基序包括Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala，和Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala，二者可以通过，例如多联体GAG-结合基序的C-末端与激动剂骨架氨基酸侧链的氨基之间形成酰胺键相偶连，所述氨基例如有激动剂[Cys2，Lys13，D-Cys27]PYY(图3A)中Lys13的或激动剂[Lys13]PYY3-36中Lys13的ε氨基。
GAG基序可直接或经接头基团与激动剂的C-或N-末端(优选)共价连接，而不是与激动剂相连或作为骨架残基侧链的一部分。GAG结合基序也可含有氨基酸序列XBBXBX和/或XBBBXXBX，其中B是碱性氨基酸残基，X是任何氨基酸残基，例如序列[XBBBXXBX]n，其中n是1-5，B是碱性氨基酸残基，X是任何氨基酸残基。当这些多联体重复序列结合GAG时，它们倾向于形成α螺旋，因此当它们与C-末端六肽/最后的α螺旋转角融合时，可稳定该转角从而以最佳方式提供Y2受体识别的组合结构。该型激动剂的具体例子是[XBBBXXBX-XBBBXXBX]PYY25-36或[XBBBXXBX-XBBBXXBX-XBBBXXBX]PYY25-36，其中B是碱性氨基酸残基，X是任何氨基酸残基，具体是Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-PYY25-36(SEQ ID No21)(图3B)。
本发明考虑的Y2选择性激动剂特别可用于治疗性血管生成。就该具体用途而言，该激动剂优选包含上述糖胺聚糖(GAG)结合基序。这种基序能确保该激动剂在胞外基质中与GAG结合，从而确保Y2受体在该组织中的局部接触时间延长。生长因子，趋化因子等可通过能与GAG的酸性糖相互作用的碱性氨基酸斑(patch)与GAG结合。生长因子上这些带正电荷表位通常由碱性残基的侧链构成，这些残基不一定连续地位于序列中但往往通过二级结构元件，例如a-螺旋或转角或通过该蛋白质的整个三维结构存在于邻近区域。某些上述GAG-结合性线形序列已有描述，例如XBBXBX和XBBBXXBX，其中B代表碱性残基(Hileman等，Bioassays 1998，20156-67)。圆二色性显示这些区段与GAG结合后形成α-螺旋。当存在例如三条这样的序列(例如每条是ARRRAARA序列)时，如果使这种序列位于例如多联体或枝状体构建物中，得到的24-单体肽，例如ARRRAARA-ARRRAARA-ARRRAARA可确保其在胞外基质中的保留(时间)类似于高分子量聚赖氨酸，即在4小时输注期间不会被洗掉(Sakharov等，FEBS Lett 2003，276-10)。
因此天然构建的生长因子和趋化因子有两类结合基序一类受体的结合基序，通过它实现信号转导，而一类GAG的结合基序，通过它实现结合与持久的局部活性。诸如PYY和NPY等肽是神经肽和神经激素，它们可从组织中相当快速地洗掉，这对持久的局部作用而言不是最佳的。使GAG-结合基序与本发明的Y2选择性激动剂或已知的典型肽激动剂PYY3-36结合，构建了一种具有PP-折叠肽部分的受体结合表位和GAG-结合基序的类似于生长因子和趋化因子的双功能分子。这种激动剂的一个例子见图3A。
如上所述，在本发明优选的实施方案中，GAG-结合基序，例如安置上述的多联体24-聚序列作为Y2-选择性激动剂的N-末端延伸段。这种安置(方式)对N-末端截短的PP-折叠模拟激动剂特别有意义。虽然本文所述的激动剂是Y2选择性的，但它们与天然PYY-36或PYY相比，在一定程度上对Y2受体的亲和力或效力降低。由于和GAG结合可形成能有助于稳定螺旋部分从而有助于以正确方式提供远端C-末端区段的α-螺旋，采用这种截短的PP-折叠模拟激动剂和多联体GAG-结合基序有利于延长(接触时间)。这种激动剂的一个例子见图3B。
就NPY肽及其类似物而言，引入PP-折叠肽的GAG结合基序(例如碱性多联体或枝状体构建物)的另一合适位置是14位，就PYY和PP肽及它们的类似物而言是13位。然而，如上所述，可将含有GAG-结合基序的残基引入激动剂中的任何位置，前提是这种引入与保留本发明考虑的(a)、(b)和(c)型激动剂中所需的PP-折叠结构和C-末端Y2-识别序列所需的(结构)相一致。因此，可将GAG-结合基序作为类似物中的间隔构建物部分安置，所述类似物的PP-折叠部分可用非肽间隔物替代。
PEG化在PEG化过程中，将一个或多个聚环氧烷基团共价偶联于肽或蛋白质药物以提高给药后在体内的有效半衰期和降低免疫原性、增强可溶性等。该术语得自该方法所用的优选聚环氧烷，即得自乙二醇-聚乙二醇或“PEG”。
合适的PEG基团可通过任何方便的化学方法与激动剂相连，例如通过激动剂的骨架氨基酸残基。例如，就PEG样的分子而言，常用的连接基团是赖氨酸的ε-氨基或N-末端氨基。其它连接基团包括游离羧基(例如，C-末端氨基酸残基或天冬氨酸或谷氨酸残基的羧基)、适当活化的羰基、巯基(例如，半胱氨酸的巯基)、芳香族氨基酸残基(例如，Phe、Tyr、Trp)、羟基(例如，Ser、Thr或OH-Lys的羟基)、胍基(例如，Arg)、咪唑基(例如，His)和氧化的碳水化合物部分。
当激动剂PEG化后，它通常包含1-5个聚乙二醇(PEG)分子，例如1、2或3个PEG分子。每个PEG分子的分子量可以是约5kDa(千道尔顿)-100kDa，例如约10kDa-40kDa的分子量，如约12kDa或优选不超过约20kDa。
合适的PEG分子可购自Shearwater Polymers，Inc.和Enzon，Inc.，并且可选自SS-PEG、NPC-PEG、醛-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC、SC-PEG、分枝mPEG(US 5,880,255)，或氧基羰基-氧基-N-二羧基酰亚胺-PEG(US 5,122,614)。
在具体的实施方案中，上述激动剂[Cys2，Lysl3，DCys27]PYY可以在Lys13的ε氨基处PEG化，激动剂[Cys2，DCys27]PYY可以在Lys4处PEG化。
血清白蛋白、GAG和PEG无论对激动剂的修饰是与某基团连接以促进血清结合、GAG结合还是通过PEG化提高其稳定性，血清白蛋白结合基序或GAG结合基序或PEG基团可以是，或者可以形成激动剂碳骨架侧链的一部分，对应于以下PYY或PP的任一位置1、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、17、18、19、21、22、23、25、26、28、29、30和32，或对应于以下NPY的任一位置1、3、4、6、7、10、11、12、14、15、16、17、18、19、21、22、23、25、26、28、29、30和32。
特别是当激动剂是(c)型时，血清白蛋白结合基序或GAG结合基序或PEG基团也可以是或可形成碳骨架侧链的一部分，对应于以下PYY、NPY或PP的任一位置2、5、8、9、13、14、20和24。
与较大生物分子的偶联如上所述，可在PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物的各种位置连接某些基序而不削弱它们对Y受体的高亲和力(见实施例)。以类似方式，选择性Y2受体激动剂可作为与例如白蛋白或另一种蛋白质或运载体分子相连的融合蛋白使用，从而提供有益的药代动力学或其它类型性能，例如减少肾排除。如同可采用多种蛋白质或运载体那样，本领域已知这种共价结合可采用多种化学修饰基团和接头。特别优选将选择性Y2肽激动剂与白蛋白共价结合于PP-折叠结构中，本文其它地方已指出的可用各种基序修饰的有关位置。在本发明优选的实施方案中，将终止于C-末端Y2受体识别氨基酸序列的肽与大生物分子，例如白蛋白的C-末端融合。这种融合蛋白可以通过各种半合成技术产生，其中肽可通过本文所述的肽合成技术制备，和通过重组技术制备生物分子。该融合蛋白也可整体作为表达的重组分子来制备，例如含有延伸序列Gly-Lys-Arg的前体分子，当该分子在真核细胞中表达为分泌型蛋白时将被生物合成酶切割，C-末端Y2受体识别序列的C末端Tyr残基上的Gly转变为羧酰胺。
稳定化如本文各处提及的那样，可以各种方法稳定本发明的许多选择性Y2激动剂，例如通过N-末端酰化或通过用非肽接头替换激动剂部分骨架，或通过内部环化交连来稳定PP-折叠结构。在大多数情况中，该稳定作用有两个目的，一是通过保留PP-折叠以最佳方式提供Y2受体的受体识别表位，另一是稳定此肽以抵抗降解，即特别是蛋白酶解的降解。当也通过连接上述各种基序来修饰选择性Y2激动剂以获得延长的半衰期、缓释和/或长时间组织接触时，这点特别重要。如通常的和与选择性Y2激动剂肽，例如PP-折叠稳定化，环形[Cys，D-Cys27]PYY及其各种类似物相关的具体例子所述，通常此肽激动剂主要通过肾脏相对快速地排出，因此蛋白质稳定性可能不重要，然而，当要求此肽以一种或多种方式在各种体液中延长存在数小时时，保持该肽的生物活性完整就特别重要，即其稳定形式应能耐受蛋白酶解攻击。
螺旋诱导肽已提及本发明考虑该激动剂N-末端的酰化可作为稳定该激动剂抵抗氨肽酶作用的一种方法。另一种稳定性修饰包括将4-20个氨基酸残基的稳定性肽序列共价连接于N-和/或C-末端，优选N-末端。此稳定性肽中的氨基酸残基选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met等。在一令人感兴趣的实施方案中，N-末端肽连接包含4、5或6个Lys残基，例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PYY25-36(SEQ ID No11)。这些稳定性肽可连接在PP-折叠肽激动剂的N-末端或者可将它们置于N-末端截短的PP-折叠模拟激动剂或N-末端缩短的PP-折叠模拟激动剂的N-末端，其中将间隔肽引入新的N-末端和稳定性肽之间。由于Lys残基链倾向于形成α螺旋结构并在随后的残基中诱导这种结构，如上所述这有益于由本发明选择性Y2激动剂肽最后螺旋转角和C-末端Y2受体识别氨基酸序列的受体呈递，这种修饰特别令人感兴趣。这种稳定性肽延伸物的常规描述见纳入本文作为参考的WO 99/46283(ZealandPharmaceuticals)。
本发明考虑的受体激动剂可通过熟知的方法制备，例如合成、半合成和/或重组方法。这些方法包括标准的肽制备技术，例如液态合成和固相合成。本领域技术人员根据本领域的教材和常规知识知晓如何获得激动剂和它们的衍生物或修饰物。
本发明所用的具体激动剂本发明所用激动剂的具体例子包括PYY2-36(SEQ ID No4)NPY2-36(SEQ ID No5)[D-Ala1]PYY(SEQ ID No6)[D-Ala2]PYY(SEQ ID No7)[Ala28]PYY(SEQ ID No8)[Ala30]PYY(SEQ ID No9)PYY(SEQ ID No10)Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PYY25-36(SEQ ID No11)[Lys4，Gln34]PP(SEQ ID No12)[Cys2，D-Cys27]PYY(SEQ ID No13)[Cys2，D-Cys27]NPY(SEQ ID No14)[Cys2，Ile3，D-Cys27，Val31]NPY(SEQ ID No15)[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY(SEQ ID No16)[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]NPY(SEQ ID No17)[Cys2，Ile3，Aoc5-24，D-Cys27，Val31]NPY(SEQ ID No18)[Lys28，Glu32]PYY25-36(SEQ ID No19)[Glu28，Lys32]PYY25-36(SEQ ID No20)Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-PYY25-36(SEQ ID No21)[D-Ala2]PYY2-36(SEQ ID No22)[Lys4，Leu17，Gln34]PP(SEQ ID No23)[Lys4，Leu17，Leu30，Gln34]PP(SEQ ID No24)[Lys4，Nle17，Nle30，Gln34]PP(SEQ ID No25)[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys4，Nle17，Nle30，Gln34]PP(SEQ IDNo26)N-乙酰基[Cys2-DCys27]PYY2-36(SEQ ID No27)[Cys2，N-(8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基)-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No28)[Cys2，N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No29)[Cys2，N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No30)[Cys2，N-PEG5000-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No31)[Cys2，Ile3，D-Cys27，Leu28，Val31]NPY(SEQ ID No32)NPY(SEQ ID No33)N-乙酰基-脱Tyr1[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY(SEQ ID No34)N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-[Cys2，D-Cys27]PYY(SEQ ID No35)[Cys2，D-Cys27]PYY2-36(SEQ ID No36)[Cys2，N-{N’-(21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧杂二十一碳酰基(hexaoxaheneicosanoyl))}-γ谷氨酰基-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No37)和它们的保守取代类似物。
本发明所用的特别优选的Y2-选择性激动剂是[Cys2，D-Cys27]PYY(SEQ ID No13)、[Lys4，Gln34]PP(SEQ ID No12；图2B)、[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY(SEQ ID No13；图2A)和它们的保守取代类似物。
下文描述了本发明的具体激动剂和相关的分子药理学特性以及肽的化学和稳定特性。
PYY2-36(SEQ ID No4)(a)型高度选择性Y2受体激动剂具有与内源性肽PYY3-36相同的许多结合特性，但与PYY3-36相比它提高了肽的稳定性。如上所述，由于受到二肽基肽酶-IV(DPP-IV)有效且快速的降解，而去除了前两个残基但产生了缺乏结构上重要的Pro2残基的更不稳定的肽，PYY的主要内源性血循环形式是PYY3-36。
受体识别情况-PYY2-36缺乏Tyr1，对Y1受体的亲和力差，但其结合Y2受体的亲和力与例如PYY3-36的一样高，PYY2-36是PYY衍生的肽，与PYY3-36类似，Y4受体对它识别亲和力低。
蛋白质稳定性-与PYY3-36相比，PYY2-36的优点在于更稳定，因此是更好的生物药学制剂。稳定性提高依据以下几点1)它不是DPP-IV的底物，因为它的第二残基不是Pro或Ala，2)其N-末端Pro能防止其被大多数氨肽酶，包括例如氨肽酶N降解，3)保留了重要的Pro2而确保它含有比PYY3-36更稳定的PP折叠，因为Pro2和反平行α螺旋的最后螺旋转角之间重要的相互作用，即特别是Tyr27仍然存在于PYY2-36中。PYY(SEQ ID No6)(a)型高度选择性Y2受体激动剂是一种新颖的肽，它具有许多与内源性肽PYY3-36相同的结合特性，但与PYY3-36相比它提高了肽的稳定性。
受体识别情况-[D-Ala1]PYY缺乏Tyr1的侧链，对Y1受体的亲和力降低，但其结合Y2受体的亲和力与例如PYY3-36一样高，该激动剂是PYY衍生的肽，与PYY3-36类似，Y4受体对它的识别亲和力低。
蛋白质稳定性-与PYY3-36相比，[D-Ala1]PYY的优点在于更稳定，因此是更好的生物药学制剂。稳定性提高的依据在于其N-末端的D-形Ala能防止其被大多数氨肽酶，包括例如DPP-IV和氨肽酶N降解。此外，如PYY2-363一样，保留了重要的Pro2可确保它具有比PYY3-36更稳定的PP折叠，因为Pro2和反平行α螺旋的最后螺旋转角之间存在重要的相互作用，即特别是Tyr27仍然存在于[D-Ala1]PYY中。PYY(SEQ ID No7)和[D-Ala2]PYY2-36(SEQ ID No22)这些(a)型高度选择性Y2受体激动剂是一种新颖的肽，其中在PYY的N-末端聚脯氨酸区段已引入可获得Y2选择性的取代。
受体识别情况-[D-Ala2]PYY2-36缺乏Tyr1，也缺乏Pro2的侧链，而[D-Ala2]PYY只缺乏Pro2的重要侧链，因此，与PYY3-36相似，二者对Y1受体亲和力低，但对Y2受体亲和力高。如表1所示，[D-Ala2]PYY对Y2受体的亲和力为0.93nM，而对Y1和Y4受体的亲和力分别为483nM和31nM；如表2所示，[D-Ala2]PYY对Y2受体的效力为1.4nM，而对Y1和Y4受体的效力分别为127nM和591nM。
蛋白质稳定性-与PYY3-36相比，[D-Ala2]PYY和[D-Ala2]PYY2-36的优点在于更稳定，因此是更好的生物药学制剂。稳定性提高的依据在于[D-Ala2]PYY2-36中N-末端的D-形Ala能防止其被大多数氨肽酶，包括例如DPP-IV和氨肽酶N降解，和[D-Ala2]PYY中Pro2的取代可用于类似目的。PYY(SEQ ID No8)这是在α螺旋结构域中引入修饰而确保了对Y2的选择性超过对Y1的(a)型高选择性Y2受体激动剂。[Ala28]PYY是一种新颖的肽。
受体识别情况-[Ala28]PYY缺乏Leu28的侧链，与PYY相比，它对Y1受体的亲和力降低了300倍；重要的是保留了对Y2受体的高亲和力和对Y4受体的低亲和力。因此，[Ala28]PYY与例如PYY3-36相比对Y2比对Y1有更好的选择范围(window)。
蛋白质稳定性-[Ala28]PYY具有类似于PYY的稳定PP-折叠。因此，为提高其作为生物药物的性能和防止，例如被氨肽酶降解，可如上所述制备N-末端乙酰化形式，或者可将Ala28取代与例如D-Ala1或D-Ala2取代组合，这也进一步提高了对Y2比超过Y1的(更好)识别范围。PYY(SEQ ID No9)这是在α螺旋结构域中引入修饰而确保了对Y2的选择性超过对Y1的另一种(a)型高选择性Y2受体激动剂。[Ala30]PYY是一种新颖的肽。
受体识别情况-[Ala30]PYY缺乏Leu30的侧链，与PYY相比，它对Y1受体的亲和力降低了100倍；重要的是保留了对Y2受体的高亲和力和对Y4受体的低亲和力。因此，类似于例如PYY3-36，[Ala30]PYY对Y2比对Y1有(更好)的选择范围。
蛋白质稳定性-[Ala30]PYY具有类似于PYY的稳定PP-折叠。因此，为提高其作为生物药物的性能和防止，例如被氨肽酶降解，可如上所述制备N-末端乙酰化形式，或者可将Ala30取代与例如D-Ala1或D-Ala2取代组合，这也进一步提高了对Y2比对Y1(更好)的识别范围。PYY(SEQ ID No10)这是另一种(a)型高选择性Y2受体激动剂，一种新颖的肽，其C-末端Y2识别氨基酸序列中同样引入了修饰而确保了对Y2的选择性超过Y1。
受体识别情况-[Ala31]PYY缺乏Val30的侧链，与PYY相比，它对Y1受体的亲和力降低了1500倍。它对Y2受体的亲和力降低了3-4倍并保留了对Y4的低亲和力。因此，类似于PYY3-36，[Ala31]PYY对Y2比对Y1有改善的极大选择范围。
蛋白质稳定性-[Ala31]PYY具有类似于PYY的稳定PP-折叠。因此，为提高其作为生物药物的性能和防止，例如被氨肽酶降解，可如上所述制备N-末端乙酰化形式，或者可将Ala31取代可与例如D-Ala1或D-Ala2取代组合，这也进一步提高了对Y2比对Y1(更好)的识别范围。PP(SEQ ID No12)该新颖的肽是(b)型高选择性Y2受体激动剂，即基础PP-折叠肽是含C-末端Y2受体识别氨基酸序列的PP，该氨基酸序列确保了对Y2和Y4受体的高亲和力和对Y1受体的低亲和力。为获得对Y2的选择性超过Y4，对PP的N-末端聚脯氨酸结构域的4位进行了取代，该取代破坏了对Y4的识别。如上所述，也可通过其它取代获得对Y2的选择性超过对Y4。总体上，与其它Y2选择性配体以及PP折叠肽相比，[Lys4，Gln34]PP的另一令人感兴趣的性能是对Y5受体也具有较高的亲和力。因此，[Lys4，Gln34]PP及其如下文所述的类似物可以认为是组合的Y2-Y5选择性激动剂。
受体识别情况-[Lys4，Gln34]PP对Y2受体的体外效力(下表2)非常类似于PYY3-36。与PYY3-36相似，在Y1受体上，[Lys4，Gln34]PP在对Y2和Y1受体的效力之间具有100倍以上的EC50。类似地，[Lys4，Gln34]PP对Y4受体具有大约100倍的选择窗口。因此，[Lys4，Gln34]PP是构建在PP支架上的对Y2比对Y1和Y4具有高选择性的激动剂。令人感兴趣的是，例如与PYY3-36相反，[Lys4，Gln34]PP对Y5受体具有极高效力。[Lys4，Gln34]PP对Y5受体的效力甚至高于最有效的内源性配体PYY和NPY。
蛋白质稳定性-[Lys4，Gln34]PP具有类似于PP的稳定PP-折叠。为提高其作为生物药物的性能和防止，例如被氨肽酶降解，可如上所述制备N-末端乙酰化形式，或者可将这些取代与例如D-Ala1或D-Ala2取代组合，这也进一步提高了对Y2比对Y1更好的识别范围。PP(SEQ ID No23)、[Lys4，Leu17，Leu30，Gln34]PP(SEQ ID No24)、[Lys4，Nle17，Nle30，Gln34]PP(SEQ ID No25)这些是新颖的(b)型高选择性Y2受体激动剂，即其基础PP-折叠肽是含C-末端Y2受体识别氨基酸序列的PP，该氨基酸序列确保了对Y2和Y4受体的选择性高而对Y1受体的选择性低。如就[Lys4，Gln34]PP而言，为获得对Y2的选择性超过Y4，在PP的N-末端聚脯氨酸结构域的4位进行了取代，该取代破坏了对Y4的识别。与[Lys4，Gln34]PP相似，总体上，与其它Y2选择性配体以及PP折叠肽相比，这些肽的另一令人感兴趣的性能质在于对Y5受体也具有较高的亲和力。重要的是，在[Lys4，Leu17，Gln34]PP、[Lys4，Leu17，Leu30，Gln34]PP和[Lys4，Nle17，Nle30，Gln34]PP中，17和30位的一个或两个Met残基被Leu或不能被氧化的正亮氨酸(Nle)取代。因此，此处的这3种肽代表了一组Y2选择性肽，其中通过用不能氧化的残基取代防止了Met残基氧化。
蛋白质稳定性-大体上，[Lys4，Leu17，Gln34]PP、[Lys4，Leu17，Leu30，Gln34]PP和[Lys4，Nle17，Nle30，Gln34]PP[Lys4，Gln34]PP的稳定性类似于[Lys4，Gln34]PP的，然而这些肽的一个或多个Met残基不易氧化，这在某些生物药物中是有利的。NPY(SEQ ID No17)在本文也称为C2-NPY的该肽是(c)型高选择性Y2激动剂，即含有C-末端Y2受体识别氨基酸序列的肽，该序列在其N-末端与两亲性氨基酸序列结构域(此例由NPY25-30构成)融合，该结构域因分子内共价连接而束缚于螺旋构型中，在这种情况下该结构域位于引入对应于N-末端聚脯氨酸螺旋结构域的NPY1-4区段的Cys2和引入该α螺旋结构域的D-Cys27之间。在C-2NPY中，用8-氨基辛酸取代了NPY的残基5-24序列(Krstenansky等，1989 PNAS 864377-8，Cox和Krstenansky 1991 Peptides 12323-27)。[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]NPY是具有胜过例如PYY3-36另一优点的高选择性Y2激动剂，它更小，只有16个残基仍然非常稳定。
受体识别情况-与NPY相反，在PP-折叠截短的NPY的2位Glu和30位Lys之间形成内酰胺键并且在残基4和25之间具有氨基己酸间隔臂的对应[Ahx5-24，γ-Glu2-ε-Lys30]NPY在大鼠体内显示了不诱导血压升高，即当在体内测试时缺乏典型的Y1受体(Beck-Sickinger等，1992 Eur.J.Biochem.206.957-64)。
蛋白质稳定性-这是一种环形肽。PYY(SEQ ID No16)在本文也称为C2-PYY的该肽是新颖的(c)型高选择性Y2激动剂，即含有C-末端Y2受体识别氨基酸序列的肽，该序列在其N-末端与两亲性氨基酸序列结构域(此例由PYY25-30构成)融合，该结构域因分子内共价连接束缚于螺旋构型中，在这种情况下该结构域位于引入对应于N-末端聚脯氨酸螺旋结构域的PYY1-4区段的Cys2和引入该α螺旋结构域的D-Cys27之间。在C-2PYY中，用8-氨基辛酸取代了PYY的残基5-24序列。C-2PYY与C-2NPY的区别在于3位(Ile代替了Ser)、28(Leu代替了Ile)和31(Val代替了Ile)，这使得C-2PYY成为PYY的C-和N-末端的完美模拟物，但其提供方式使得该更小的肽(16个残基而非36个残基)成为Y2选择性激动剂。重要的是，C2-PYY对Y2受体的效力高于C2-NPY。
受体识别情况-C2-PYY激活Y2受体(下表2)的EC50比PYY3-36的高约10倍，然而与PYY3-36以74nM的EC50激活Y1受体相反，C2-PYY甚至在1μM浓度也不激活Y1受体。重要的是，C2-PYY甚至在浓度1μM时既不激活Y4也不激活Y5受体。后一观察结果令人吃惊，因为这是PP-折叠肽类似物所观察到的最低效力。因此，C2PYY是对Y1受体具有选择性的个位数(single digit)纳摩尔Y2激动剂，比PYY3-36至少好10倍并且也对Y4甚至对Y5受体也具有高选择性。
蛋白质稳定性-C-2NPY是环形肽，因为它对天然存在的PP-折叠而设计，模拟了由于外部二硫键而成为结构上束缚形式的该结构末端。
N-乙酰基-脱Tyr1[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY(SEQ ID No34)、[Cys2，Ile3，Aoc5-24，D-Cys27，Val31]NPY(SEQ ID No18)这些肽是新颖的(c)型高选择性Y2受体激动剂，即含有C-末端Y2受体识别氨基酸序列的肽，该序列在其N-末端与两亲性氨基酸序列结构域(此例由PYY25-30或NPY25-36构成)融合，该结构域因分子内共价连接束缚于螺旋构型中，该结构域位于引入对应于N-末端聚脯氨酸螺旋结构域的PYY1-4或NPY1-4区段的Cys2和引入该α螺旋结构域的D-Cys27之间。在这些PP-折叠模拟物中，用8-氨基辛酸残基取代了残基5-24序列。这些肽代表了一组例子如下所示的肽Ac-脱Tyr1[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY(对应于[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY，其中Tyr1被N-末端封闭性乙酰化基团所取代)和[Cys2，Ile3，Aoc5-24，D-Cys27，Val31]NPY(对应于[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]NPY，其中为使其更象PYY，两个残基被取代)。通过这种修饰，可从特别适合临床使用的挑选出的肽制备一组Y2选择性肽。PYY(SEQ ID No13)该肽是(c)型高选择性Y2受体激动剂，也将其设计为高度稳定的蛋白。在C-2NPY和C-2PYY构建物的类似物中，在2位的Cys和27位的D-Cys之间引入了分子内二硫键，然而在本文中为稳定其PP-折叠结构，在全长PYY分子中引入了此二硫键。因此，[Cys2，D-Cys27]PYY在本文中代表一组在N-末端聚Pro序列和两亲性螺旋区段之间含有稳定性分子内连接键的选择性Y2激动剂肽。在该组的其它成员中，可以在其它位置的残基之间形成二硫键，或者可以建立另一类型的分子内共价连接，例如在如[Glu2-Lys30]PYY的Glu2的γ-羧基和Lys30的ε氨基之间建立内酰胺键。例如，[Cys2，D-Cys27]PYY也是含有N-末端乙酰化修饰的活性(物质)，该修饰进一步防止了该肽被氨肽酶降解。[Cys2，D-Cys27]PYY是一种新颖的化合物。
受体识别情况-[Cys2，D-Cys27]PYY激活Y2受体(下表2)的效力(EC50＝0.33Nm)类似于PYY3-36，而其激活Y1受体的效力大于1μM，这比PYY3-36对Y1受体的效力低20倍。对Y4受体，[Cys2，D-Cys27]PYY具有的EC50大于1μM。因此，[Cys2，D-Cys27]PYY是具有对Y1受体的选择性指数约为10.000的亚纳摩尔选择性Y2激动剂，它比PYY3-36好50-100倍。
蛋白质稳定性-[Cys2，D-Cys27]PYY因PP-折叠稳定性的分子内二硫键而比PYY3-36更稳定，其中除去了作为稳定PP-折叠的重要疏水核心部分的Pro2，因而甚至比PYY1-36本身更稳定。该二硫键能基本上防止PP-折叠被“拉开”，PP-折叠使该肽维持于内切蛋白酶难以接近的构型。用Cys取代Pro2的其它优点在于使得该肽总体上能抗二肽基肽酶IV的降解，否则PYY1-36是其相当好的底物。在[Cys2，D-Cys27]PYY的N-末端乙酰化形式中此种稳定性甚至得到进一步提高。
体内受体选择性-在剂量渐增研究中，通过连续30分钟静脉内输液分别将[Cys2，D-Cys27]PYY以剂量0.3、1、3、10、30和100g/kg给予麻醉的狗。用放射性免疫试验测定[Cys2，D-Cys27]PYY的血浆水平，显示线性剂量关系。最高剂量时，在狗中获得了32nM的血浆水平。然而，未观察到对血压或心率的剂量依赖作用。熟知作为Y1和Y2受体二者激动剂的PYY和NPY在低得多的血浆水平时将提高血压。因此，这些实验表明[Cys2，D-Cys27]PYY在体内也是高选择性肽而不具有任何可测的Y1受体活性。
对急性食物摄入的体内作用-禁食16小时后，皮下注射将PYY3-36、[Cys2，D-Cys27]PYY以每只动物3或30μg(PYY3-36)或10和100μg([Cys2，D-Cys27]PYY)的剂量或盐水给予各组小鼠(每组8只)。图4显示了小鼠累积的食物摄入量。30μg剂量的PYY3-36在最初2小时中抑制了食物摄入，但在随后的2-6小时期间该作用逐渐消失。[Cys2，D-Cys27]PYY在小鼠中对食物摄入的抑制作用比PYY3-36更显著和更持久。因此，在图4中观察到，即使10μg的剂量也能更有效地抑制食物摄入并且该作用持续8小时以上。因此，如体外信号转导试验测定好的那样，它对Y2受体的作用与PYY3-36等效，[Cys2，D-Cys27]PYY看来更有效，该作用可能与蛋白质稳定性的增加有关，这是二硫键稳定的[Cys2，D-Cys27]PYY肽所固有的。PYY(SEQ IDNo38)[Cys2，N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ IDNo29)[Cys2，N-(8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基)-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No28)这些肽是Y2高度选择性激动剂肽家族的代表，它们是用分子内二硫键化学稳定的蛋白质(防止内切肽酶降解)，可以进行N-末端乙酰化以防氨肽酶降解(该肽天然C-末端酰胺化以防羧肽酶降解)，通过含长链脂肪酸的γ-谷氨酸间隔序列对引入13位的Lys(在远离受体识别位点的PP-折叠环中)的ε氨基进行烷基化可保证该修饰的肽在循环中与白蛋白结合，从而使该肽的作用时间延长。
通过用具有不同链长和饱和度的其它长链脂肪酸烷基化可以获得类似的性能，即结合白蛋白(Kurtzhals，P.等，Biochem.J.1995，312725-31)。显然用长链脂肪酸烷基化该肽也可以通过修饰其它引入的氨基酸或修饰的氨基酸来进行，例如Cys，或者白蛋白结合部分可以是此肽中所含非天然氨基酸残基的整合部分。在给定的例子中，所述烷基化氨基酸位于PYY的13位，但它可位于此肽中不损伤该肽受体识别(能力)的任何位置，优选位于1-30位(见前文给出的总体描述)。
受体识别情况-如表1和表2所示，在[Cys2，D-Cys27]PYY的13位引入Lys残基并将一长烷基链连接于Lys13的ε氨基不会改变该环形肽对Y2受体的高亲和力，即，[Cys2，D-Cys27]PYY的IC50＝0.79nM，EC50＝0.48；[Cys2，Lys13，D-Cys27]PYY的IC50＝0.60nM，EC50＝1.9nM；[Cys2，N-(8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基)-Lys13，D-Cys27]PYY的IC50＝0.90nM，EC50＝0.68nM。
N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-[Cys2，D-Cys27]PYY(SEQ ID No35)
该肽是Y2高度选择性激动剂肽家族的代表，它是用分子内二硫键化学稳定的蛋白质(防止内切肽酶降解)，可以进行N-末端乙酰化以防氨肽酶降解(该肽天然C-末端酰胺化可防羧肽酶降解)，用长链脂肪酸烷基化Tyr1的氨基，除了能防止氨肽酶的攻击外还保证了该修饰的肽在循环中与白蛋白结合，从而使该肽的作用时间延长。PYY(SEQ ID No30)该肽代表了一组经修饰而含GAG-结合基序的Y2选择性肽以在体内与组织中的GAG结合，即在靶组织中获得持久的局部Y2受体(和Y5受体，如果该肽属于具有Y2和Y5组合选择性的一组肽)接触，和/或因在进入身体的部位(例如皮下注射部位)保留时间延长所致的长期缓释作用。在此具体例子中，GAG-结合基序(线形三聚体形式的Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala序列)与引入[Cys2，D-Cys27]PYY肽“背景”中13位Lys的ε氨基相连(参见，图3A)。下文描述了该肽的合成方法(为了分析，用荧光素基团在GAG-结合基序的N-末端加帽)。
受体识别情况-如上所述，引入Lys13不改变稳定的环形[Cys2，D-Cys27]PYY肽的Y2受体高亲和力和效力或其对Y2受体超过Y1和Y4受体的高选择性(表1和表2)。重要的是，24残基的GAG-结合基序[Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala]3与Lys13的ε氨基结合不影响Y2受体的高亲和力(IC50＝0.21nM)或效力(EC50＝0.37nM)或其Y2受体高选择性(参见表1和2)。
肝素结合-如图5所示，荧光素标记的[Cys2，N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，D-Cys27]PYY几乎完全吸附于HiTrap肝素-琼脂糖，当该基质接触2或3摩尔的NaCl时其首先被洗脱，表明GAG-基序修饰的肽对GAG(在此处以肝素代表)的亲和力极高。应注意已证明与高分子量聚赖氨酸类似，以这种亲和力与肝素结合的该类肽基序确保了期能保留在体内的胞外基质中，即在4小时的输液期间它不会被洗掉(Sakharov等，FEBS Lett 2003，276-10)。因此，[Cys2，N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，D-Cys27]PYY代表了一组具有高亲和力GAG-结合基序修饰，从而在靶组织中，例如在动脉内(如冠状动脉内或股动脉内)注射后可获得持久的局部受体接触的Y2选择性肽。
N-乙酰基[Cys2-DCys27]PYY2-36(SEQ ID No27)和[Cys2-DCys27]PYY2-36(SEQ ID No36)该肽([Cys2-DCys27]PYY2-36)是(c)型高选择性Y2激动剂，该肽也设计为高稳定性的蛋白质。与[Cys2-DCys27]PYY类似，为稳定其PP-折叠结构，在2位Cys和27位D-Cys之间引入了分子内二硫键，然而该二硫键在本文是引入PYY2-36中的。Tyr1不存在或用N-末端乙酰化取代。如同其它Y2选择性肽中存在可保留其Y2选择性同时又添加了上述其它有益性能的位置一样，可通过加入各种基序来修饰[Cys2，D-Cys27]PYY2-36和N-末端乙酰化形式，例如通过在本文其它地方所述的另一位置引入例如Lys13或其它残基的连接位点。[Cys2，D-Cys27]PYY2-36及其N-末端乙酰化形式是新颖的化合物。
N-乙酰基[Cys2-DCys27]PYY2-36具有极其类似于[Cys2-DCys27]PYY的Y1、Y2和Y4受体识别性能。NPY(SEQ ID No32)、[Cys2，Ile3，D-Cys27，Leu28，Val31]NPY(SEQ ID No33)、[Cys2，Ile3，Nle17，D-Cys27，Nle28，Val31]NPY(SEQ ID No34)这些肽均是(c)型高选择性Y2激动剂，与[Cys2-DCys27]PYY类似，在这些肽的2位Cys和27位D-Cys之间引入了分子内二硫键，然而该二硫键在本文是引入NPY中的，在各种肽中，为使该肽更象PYY但保留NPY的整体PP-折叠，对C-末端和/或N-末端的氨基酸残基进行了取代。在一些类似物中，Met残基被Leu或Nle残基取代以使该肽免遭可能的氧化。PYY25-36(SEQ ID No19)[Lys28、Glu32]PYY25-36(SEQ ID No19)通过分子内内酰胺连接键稳定的该环形十二肽PYY类似物是(c)型高选择性Y2激动剂，其只由PYY3-36中的12个而非34个残基构成，其中在α螺旋结构域残基和C-末端Y2识别氨基酸序列残基之间形成了稳定的分子内连接键。PYY的Leu28(在实际十二肽中的4位)被Lys残基取代，Thr32(在实际十二肽中的8位)被Glu残基取代，这些残基侧链中的氨基和羧基通过形成内酰胺键相连。已将NPY的类似物描述为效力类似于NPY的选择性Y2激动剂(Rist等，1996 FEBS Lett 394169-173)。
受体识别情况-[Lys28，Glu32]PYY25-36对Y2受体的效力类似于PYY3-36，但是它基本上不被Y1受体所识别因为其基础PYY结构也不被Y4受体所识别。
蛋白质稳定性-由于其设计，[Lys28，Glu32]PYY25-36是一种环形，结构有序的肽，该肽因螺旋稳定性的分子内内酰胺键而模拟了结构上受约束方式的PPY分子末端。6-PYY25-36(SEQ ID No11)该PYY类似物是(a)型高度选择性Y2激动剂，通过在其N-末端融合了由6个Lys残基构成的α螺旋诱导序列而作了修饰。由于这些残基的螺旋诱导性能和PYY的α螺旋结构域(此例为残基25-30)易于采取α螺旋结构的倾向，该螺旋诱导序列为Y2受体识别以最佳方式提供PYY25-36。
受体识别情况-[Lys]6-PYY25-36对Y2受体具有高亲和力(IC50＝4.1nM)，并且难以被Y1受体(IC50＝520nM)和Y4受体(IC50＝213nM)识别。
蛋白质稳定性-[Lys]6-PYY25-36有采取螺旋结构的强烈倾向，这使得它在总体上比此种大小的肽更稳定。
临床适应症本发明考虑的Y2-特异性激动剂可用于治疗对Y2受体激活起反应的疾病。这种疾病包括显示需要调节能量摄入或能量代谢或诱导血管生成的疾病。就这种用途而言，该激动剂可包含能赋予对肽酶的稳定性、血清蛋白质结合性能或PEG化以延长血清和/或组织半衰期的修饰或基序。特别是诱导血管生成，该激动剂可包含GAG-结合基序以延长组织半衰期和Y受体接触(时间)。
诱导血管生成的适应症疾病或病症包括周围血管疾病、冠状血管病、心肌梗塞、中风和认为任一上述情况是影响因素的病症、创伤愈合与组织修复。
显示需要调节能量摄入或能量代谢的适应症疾病或病症包括肥胖和超重，认为肥胖和超重是影响因素的疾病，例如食欲过盛、神经性贪食、X综合征(新陈代谢综合征)、糖尿病、2型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)、高血糖、胰岛素耐受、葡萄糖耐受不良、心血管疾病、高血压、动脉粥样硬化、冠状动脉病、心肌梗塞、周围血管病、中风、血栓栓塞性疾病、高胆固醇血症、高脂血症、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖性疾病如多囊性卵巢综合征，或乳腺癌、前列腺癌或结肠癌。
1.肥胖和超重PYY3-36显示能降低各种啮齿类动物的食欲、食物摄入和体重(Batterham等，Nature 2002，418595-7；Challis等，BBRC Nov.2003，311915-9)以及在人中降低食欲和食物摄入(Batterham等，2002)。包括受体敲除动物研究的动物数据强烈表明PYY3-36的这种作用是通过Y2受体和弓形核中的NPY/AgRP和POMC神经元介导的。令人感兴趣的是，这种作用持续时间很长，例如腹膜内注射一次PYY3-36后直至24小时仍可观察到该作用。也熟知脑室内注射特别是AgRP对食欲等有这种长时间持续作用。肥胖对象的PYY水平和PYY食物反应较低并与他们的BMI逆相关。重要的是，肥胖对象不耐受PYY的作用，因为PYY3-36输液90分钟以相似的持久方式降低了食物摄入(Batterham等，2003，NEJM 349941-48)。
因此，为调节能量摄入，本发明考虑的Y2选择性激动剂适用于包括人的哺乳动物对象。所以，本发明涉及调节能量摄入、食物摄入、食欲和能量消耗的方法。本文公开了通过给予对象美容或治疗有效量的这种激动剂来减少能量或食物摄入的方法。在一个实施方案中，给予该受体激动剂导致(摄入的)食物总量或总体积减少。在另一实施方案中，(给予受体激动剂)可导致食物成分的摄入减少，例如脂质、碳水化合物、胆固醇或蛋白质的消化降低。在本文公开的任何方法中，可以给予本文详述的优选化合物。在其它实施方案中，本文公开了通过给予治疗有效量的这种激动剂来降低食欲的方法。食欲可通过本领域技术人员已知的任何方法测定。可用本领域技术人员已知的任何方法测定食欲。
例如，可通过生理评估来评价食欲降低。在这种实施方案中，给予该受体激动剂可导致对饥饿的感知、过饱的感觉和/或饱帐感的变化。可用本领域技术人员已知的任何方法来评估饥饿。在一个实施方案中，用生理试验评估饥饿，例如利用调查表来评估饥饿感和感官感知。
在其它实施方案中，本文公开了改变对象的能量代谢的方法。该方法包括给予对象治疗有效量的这种激动剂而改变能量消耗。所有生理过程均消耗能量。机体可通过调节那些过程的效率或者改变正发生过程的数量和性质来直接改变能量消耗率。例如，在消化期间，机体消耗能量使食物通过肠道移动并消化食物，在细胞中，细胞代谢效率的改变会产生或多或少的热量。在其它实施方案中，本文公开了本申请所述弓形线路(arcuate circuitry)的所有调节方法，该方法协同改变了食物摄入并回应性改变能量消耗。能量消耗是细胞代谢、蛋白质合成、代谢速率和利用卡路里的结果。因此，在该实施方案中，外周给药导致能量消耗增加和卡路里利用率降低。在一个实施方案中，给予对象治疗有效量的本发明受体激动剂从而增加了能量消耗。
在治疗应用和美容应用相关的几个实施方案中，可用Y2选择性激动剂控制体重和治疗、减轻或预防肥胖，特别是以下一种或多种用途预防和减轻体重增加；诱导和促进体重降低；减轻体重指数所测定的肥胖症。如上所述，本发明还涉及Y2选择性激动剂在控制食欲、饱胀和饥饿中的应用，特别是以下一种或多种应用降低、压制和抑制食欲；诱导、增加、提高或促进饱胀和饱胀感；降低、抑制和压制饥饿和饥饿感。该内容还涉及Y2选择性激动剂的以下一种或多种应用维持所需体重、所需体重指数、所需外貌和良好的健康状况。
在另一方面，本发明涉及治疗和/或预防能量代谢降低、进食障碍疾患(feeding disorder)、食欲紊乱、超重、肥胖、食欲过盛、神经性贪食、X综合征(新陈代谢综合征)或与它们相关的并发症或风险，包括糖尿病、2型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)、高血糖、胰岛素耐受、葡萄糖耐受不良、心血管疾病、高血压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、中风、心肌梗塞、血栓栓塞性疾病、高胆固醇血症、高脂血症、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖性疾病如多囊性卵巢综合征，乳腺癌、前列腺癌或结肠癌，该方法包括给予对象，例如包括人的哺乳动物有效剂量的一种或多种本文所述Y2选择性激动剂。
2.治疗性血管生成对血管平滑肌细胞的生长、心室心肌细胞肥厚以及内皮细胞增殖和迁移的许多体外研究表明NPY可能起血管生成因子的作用(Zukowska-Grojec等，1998 Circ.Res.83187-95)。重要的是，利用小鼠角膜微袋(micropocket)模型和雏鸡绒毛尿囊膜(CAM)试验的体内研究证实NPY是一种强效血管生成因子，导致只用成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)时观察到的显示血管舒张(作用)的血管树样结构而不是例如血管内皮生长因子(VEGF)所致的血管生成结构(Ekstrand等，2003 PNAS 1006033-38)。在发育期间，雏鸡胚胎NPY诱导已存在的血管产生血管萌芽。在Y2受体敲除动物中未观察到NPY的这种作用，表明Y2受体负责NPY的血管生成作用(Ekstrand等，2003)。观察到Y2受体在局部缺血血管中高度上调和产生内源性、选择性Y2配体PYY3-36的酶，二肽基肽酶-IV也高度上调也支持该观点。
在各种心血管疾病如动脉粥样硬化中，考虑在外周血管以及冠状血管中诱导血管生成将是有益的。据信诱导血管生成也有利于确保心肌梗塞后的再灌注。特别是提出FGF-2是诱导心血管疾病患者的血管生成的有效药物。然而，与大多数其它血管生成因子一样，FGF-2是一种生长因子，也可能通过提供血管生成而刺激肿瘤生长。如上所述，通过Y2受体起作用的NPY以与FGF-2相似的诱导形式诱导了新血管生成，虽然NPY是神经肽，不是典型的生长因子，因而不涉及诱导肿瘤生长。因此，Y2激动剂是治疗性血管生成的一种有用药物。然而，对该用途特别重要的是，该激动剂不显示Y1激动作用，因为会带来有害的心血管作用。这意味着所有本发明关注的肽，无论是选择性Y2选择性激动剂或是特别有用的治疗药物均与诱导血管生成有关。如上所述，这些肽经修饰而与GAG-结合基序相连时特别有用。为进一步描述与大多数其它典型的生长因子一样，FGF-2的作用部分通过它们与胞外基质中的糖胺聚糖(GAG)结合而介导或受其控制。与GAG的这种结合确保了血管生成因子以合适的空间和瞬时方式起作用而不会从组织中被快速洗掉。对于本发明所述的小肽和肽模拟物在治疗性血管生成中的应用，这点尤其重要。因此，在本发明的优选实施方案中，为在给药后诱导最佳的血管生成，给这些肽掺一个或多个GAG-结合基序以确保它们与胞外基质中的GAG结合。为在冠状血管疾病和/或急性心肌梗塞后诱导心脏血管生成，可静脉内或动脉内给药或直接施用入冠状动脉。类似地，这种化合物可通过股动脉内注射给药来治疗周围血管疾病。也可以对皮肤损伤处局部给药以促进伤口愈合。也可用血清白蛋白结合基序修饰的本发明肽来获得能有效诱导血管生成的延长时间Y受体接触。
因此，在本发明优选的实施方案中，Y2选择性激动剂含有的GAG-结合基序位于不会损伤肽的稳定性或所述该肽效力和选择性的位置。本发明的一个特定实施方案涉及含有一个或多个GAG-结合基序的PYY3-36。
在本发明的另一实施方案中，该药物组合物包含治疗有效(量)的运载体配制的治疗有效量的含有GAG-结合基序的Y2和/或Y4选择性激动剂与肝素。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及Y2选择性受体激动剂在改进血管生成系统紊乱，特别是诱导血管生成，例如与疾病或病症相关的血管生成中的应用，所述疾病例如有心血管疾病，包括具有cladicatio intermitten症状的周围血管疾病、冠状动脉疾病和心肌梗塞；组织修复过程，包括皮肤伤口愈合；炎性疾病，包括胃肠道炎性疾病，例如溃疡、结肠炎、炎性肠病、克罗恩病等。
一个具体的实施方案是利用该受体激动剂诱导心脏或血管，或组织，例如包括胃肠道粘膜等粘膜组织和皮肤的血管生成。
3.伤口愈合在通过删除Y2受体基因来选择性去除Y2受体的动物中，据报道伤口愈合与相关的新血管生成受影响(Ekstrand等，2003 PNAS 1006033-38)。因此，本发明的选择性Y2激动剂可用于改善伤口愈合。对于该适应症，这些肽可以各种方式包括胃肠外给药给予。然而优选的给药途径是局部应用，例如以溶液、分散液、粉末、药棒(stick)、精华液(crème)、软膏、洗液、凝胶、水凝胶、包括贴片和膏剂等透皮递送系统。对于局部给药，它们可如此使用。然而，在本发明一优选的实施方案中，用一个或多个本文所述GAG-结合基序修饰这些肽以通过该肽与组织中的GAG结合而确保该肽的持久局部作用。
4.炎性肠病PYY先前已描述为可用于预防和/或治疗炎性肠病；参见纳入本文作为参考的Amylin Pharmaceuticals，Inc的WO 03/105763。因此，本发明关注的激动剂在治疗或预防炎性肠病中也有效。所以，本发明也涉及本文所述激动剂在这种医学应用中的用途。在一令人感兴趣的实施方案中，这些肽含有一个或多个上述GAG-结合基序。
5.骨质疏松症几项研究显示动物中Y2敲除对骨小梁形成具有极强的作用(例如Sainsbury等，Mol.Cell.Biol.2003，235225-33)。Y2受体也参与骨形成。Baldock等，2002 J.Clin.Invest 109915-21。因此，本发明的Y2选择性激动剂可用于治疗骨质疏松症。特别考虑含有一个或多个GAG-结合基序的这些肽适合用于骨质疏松症或相关疾病。
在种群的一个亚组中，Y2激动剂因遗传变异，例如Y2基因中的多态性而可能不具有所期望的作用。这些受体中丧失功能的突变可能与肥胖相关。因此，在本发明一优选实施方案中，为检测这些基因中的多态性/突变和鉴定这种多态性，对待治疗对象的Y2基因进行分析。根据这种分析可得到这些对象的最佳治疗方案。例如，只有具有不影响Y2激动剂功能的正常基因型或多态性的对象应该用这种激动剂治疗。为确保药物的最佳效果，另一种可能性是提高表达受损伤受体对象的Y2激动剂用量。在Y2受体功能受损导致对象肥胖的情况中，例如在杂合子患者(前提是至少保留了一些相关受体功能)中用替代疗法形式的Y2激动剂(例如大剂量)治疗可能有争议。
在本发明的一个实施方案中，在长期治疗开始前可进行给予Y2激动剂以确保这些化合物在待治疗对象中具有所期望作用的急性测试。通过这些方法确保了只有对用Y2激动剂治疗敏感的对象才可用这些化合物治疗。
联用Y2-选择性激动剂和Y4-选择性激动剂与其它药物我们在同一天提交的待批国际专利申请公开了Y4-选择性激动剂和它们在治疗中的应用。本申请的附录简明地总结了该申请的Y4激动剂所需的结构特性，并且给出了Y4选择性激动剂的具体例子。如下文简单所述，本发明的Y2-激动剂可与Y4的特异性激动剂联用来治疗。
通过用两种化合物(分别是选择性Y2激动剂和选择性Y4激动剂)联合治疗，可以用低于每种化合物各自单独使用时的剂量而获得最大的有益作用，。即可给予亚最高剂量的选择性Y2化合物而确保只有最小的副作用(例如通过周围心血管Y2受体产生最小副作用或产生呕吐)，同时给予最高剂量或者甚至超高剂量的Y4激动剂而确保通过具有更广泛治疗范围的Y4受体途径在所有对象中产生极强作用。Y2受体途径的伴随(部分)刺激可确保对食欲调节和能量消耗的作用比Y4激动剂单独刺激更有效。例如，Y2激动剂对胃排空的作用比Y4激动剂更明显。并且，Y4受体的伴随刺激可允许使用较低而更安全剂量的单用无效的Y2激动剂。
当单独用两种化合物获得对Y2和Y4受体的联合刺激时，可如上所述调整给药方案。因此，在本发明的具体实施方案中，Y2激动剂和Y4激动剂联合给药时，Y2和Y4之间的剂量比为约0.1∶10-约10∶0.1，例如约0.1∶1-约1∶0.1、约0.2∶1-约1∶0.2、约0.3∶1-约1∶0.3、约0.4∶1-约1∶0.4或约0.5∶1-约1∶0.5，例如1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6等。如上所述，一个令人感兴趣的实施方案是Y2和Y4激动剂联用，其中调整Y2与Y4用量之间的平衡可获得最大疗效和最小的副作用(如果有的话)。因此，可以考虑在这种组合中Y2激动剂的浓度低于Y4激动剂的浓度。为此，上述浓度和比例分别为摩尔浓度和摩尔比。
因此，在本发明的优选实施方案中，选择性Y2激动剂与选择性Y4激动剂联合给药来治疗肥胖症。
这些化合物可通过相同或不同的给药途径给予。原则上，给药途径可以是任何途径，如本文所述，胃肠外和局部途径最令人感兴趣。因此，在本发明的一个实施方案中，Y2和Y4激动剂均通过局部途径给药，例如鼻部给药或皮下注射，在其它实施方案中，Y2激动剂经鼻部给药给予而Y4激动剂经皮下注射给予，或反之亦然。其它合适的组合或给药途径也属于本发明范围内。
用于联合治疗的Y2和Y4激动剂可以装在同一药物组合物中(例如，掺合在药物组合物中)，或者可存在于不同药物组合物中以同时、依次或分别给药并装有具体的使用说明书。因此，这种组合物可以试剂盒的形式提供，该试剂盒中在同一或分开的容器中装有Y2激动剂和Y4激动剂，任选附有使用说明书。
本发明的选择性Y2激动剂可与各种靶向食欲和能量消耗的其它药物联用来治疗肥胖、糖尿病和相关疾病，包括但不限于胃肠道酯酶抑制剂、神经递质再摄取抑制剂、大麻素受体拮抗剂和反向激动剂以及其它类型的神经递质(包括但不限于5HT受体)和/或神经激素(包括但不限于GLP-1、MC4、MC3受体激动剂或拮抗剂)。由于选择性Y2激动剂靶向联系胃肠道和CNS的稳态调节机理(即，饱胀感介导肠道分泌的激素PYY通常靶向Y2受体)，特别优选联用Y2选择性激动剂和靶向食欲和能量消耗调节中枢快感机理(例如作为应答系统(reward system)一部分的CB1受体)的药物治疗。因此，在治疗肥胖症和相关疾病中联用选择性Y2激动剂与CB1拮抗剂是本发明的一种优选实施方案。
剂量本发明Y2受体激动剂的治疗有效量取决于所用的具体激动剂、所治疗对象的年龄、体重和状况、所治疗病症或疾病的严重性和类型、给药方式和所用组合物的强度。
例如，Y2受体激动剂的治疗有效量可在约0.01μg/公斤体重-约1g/公斤体重范围内变动，例如约1μg-约5mg/公斤体重，或约5μg-约1mg/公斤体重。在另一实施方案中，给予对象0.5-135皮摩尔(pmol)/kg体重，或约72pmol/kg体重的受体激动剂。
在一具体的非限制性例子中，皮下注射给予约5-约50nmol，例如约2-约20nmol，或者皮下注射给予约1.0nmol。本领域技术人员根据所用具体特定化合物的效力、对象的年龄、体重、性别和生理情况不难确定精确的剂量。激动剂的剂量可以是治疗有效剂量的PYY3-36的摩尔当量。
这些用量可分为一次或数次剂量，以每日、每两日、每周、每两周、每月或以任何其它适当的频率给药。给药一般是每日一次或每日两次。
给药方法本发明的Y2激动剂以及美容或药物组合物可经任何途径给予，包括肠内(例如，口服给药)或胃肠外途径。在一具体实施方案中，优选胃肠外途径，包括静脉内、关节内、腹膜内、皮下、肌肉内、胸骨内注射和输液，以及通过舌下、透皮、局部、经粘膜(包括鼻部途径)给药，或者通过吸入，例如肺部吸入给药。在具体实施方案中，优选皮下和/或鼻部给药途径。
这些受体激动剂可以分散在合适的运载体中给药，或者它们可以合适的药物或化妆品组合物形式给药。这种组合物也属于本发明的范围内。下文描述了合适的药物组合物。本领域技术人员熟知这种组合物也适用于美容用途，或者知道通过利用合适的美容上可接受的赋形剂将这些组合物调整为化妆品组合物。
药物组合物用于药品或化妆品中的本发明受体激动剂(也称为“化合物”)通常以药物组合物形式存在，所述药物组合物含有特定的化合物或其衍生物和一种或多种生理学或药学上可接受的赋形剂。
这些化合物可通过任何常规给药途径，例如口服、含服、鼻部、眼部、肺部、局部经皮、阴道、直肠、眼部、胃肠外(包括上述皮下、肌肉内和静脉内等)途径以各个体有效的剂量给予动物，包括哺乳动物，例如人。本领域技术人员知道如何选择合适的给药途径。如上所述，优选胃肠外给药途径。在一具体实施方案中，这些受体激动剂皮下给药和/或鼻部给药。本领域熟知皮下注射易于自行实施。
医生不难为每位患者单独确定适合具体给药途径的组合物。标准制剂的专题论文描述了各种药学上可接受的运载体及它们的制剂，例如E.W.Martin的《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)。
含有本发明化合物的药物组合物可以是固体、半固体或液体组合物形式。就胃肠外应用而言，这些组合物通常是液体组合物形式或是用于植入的半固体或固体形式。
可通过静脉内、肌肉内、鞘内、硬膜外、腹膜内或皮下注射或输液给予作为无菌溶液或分散体的液体组合物。可将这些化合物制备成无菌固体组合物，在给药前或给药时用无菌水、盐水或其它合适的无菌可注射介质溶解或分散。
组合物的液体形式可以是溶液、乳液(包括纳米乳液)、悬液、分散液、脂质体组合物、混合物、喷剂或气溶胶(后两种类型特别适用于鼻部给药)。
溶液或分散液的合适的介质通常是水或药学上可接受的溶剂，例如油(如芝麻油或花生油)或有机溶剂，例如丙醇或异丙醇。本发明的组合物可含有其它药学上可接受的赋形剂，例如pH调节剂、渗透压活性物质(例如为了将组合物的等渗性调节到生理上可接受的水平)、粘度调节剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂等。优选的介质是水。
鼻部给药的组合物也可含有本领域技术人员熟知的合适的无刺激性运载体，例如聚乙二醇、糖基糠醛(glycofurol)等以及吸收增强剂(例如参见《雷明顿药物科学》)。
就胃肠外给药而言，在一个实施方案中，一般通过将所需纯度、单位剂量可注射形式(溶液、悬液或乳液)的受体激动剂与药学上可接受的赋形剂或运载体，即在所用剂量和浓度时对受者无毒并且与组合物的其它成分相容的物质相混合来配制。
总体上，通过使受体激动剂与液体运载体或精细分级的固体运载体或二者均匀紧密地接触来制备制剂。然后视需要将产品做成所需制剂的外形。运载体优选胃肠外运载体，更优选与受者血液等渗的溶液。这种运载体的例子包括水、盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。非水性运载体，例如不易挥发的油和油酸乙酯以及脂质体也可用于本发明。由于本文所述肽的两亲性质，合适的剂型也包括胶束制剂、脂质体和包含一种或多种合适脂质如磷脂的其它类型制剂。
优选将这些受体激动剂悬浮在水性运载体中，例如pH约3.0-约8.0、优选pH约3.5-约7.4、3.5-6.0或3.5-约5的等渗缓冲溶液。有用的缓冲物质包括乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐，例如柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。
这些组合物也可设计为在给药后受控递送或持续递送所述受体激动剂以获得频率更低的给药方案。通常认为每日1-2次的剂量方案可接受，但是本发明也包括其它给药方案，例如频率更高或更低。为实现持续递送该受体激动剂，可采用含有例如脂质或油的合适运载体从而在给药部位形成长效形式而将受体激动剂缓慢释放入循环系统，或者可采用植入物。该方面合适的组合物包括掺有受体激动剂的脂质体和生物可降解颗粒。
在需要固体组合物的情况中，该固体组合物可以是片剂形式，例如常规药片、泡腾片、包衣片、融解片或舌下片、药丸、粉末、粒剂、颗粒、颗粒材料、固体分散体或固体溶液。
该组合物的半固体形式可以是咀嚼胶、软膏、乳膏、涂抹剂、糊剂、凝胶或水凝胶。
本发明的药物组合物的其它合适剂型可以是阴道栓(vagitories)、栓剂、膏剂、贴片、片剂、胶囊、小囊、锭剂、装置等。
剂型可设计为以化合物自由或受控方式释放，例如带有合适包衣的片剂。
该药物组合物可含有治疗有效量的本发明化合物。
本发明组合物中本发明化合物的含量是，例如占该药物组合物的约0.1-100％w/w。
药物制剂配制的技术人员可用熟知的方法制备这些药物组合物。
在这些药物组合物中，所述化合物通常与药学赋形剂，即治疗上惰性物质或运载体相混合。
所述运载体根据所需剂型和给药途径可采取各种形式。
药学上可接受的赋形剂可以是，例如填充剂、粘合剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、溶剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、增强剂、调味剂、色素、pH调节剂、滞留剂、润湿剂、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂等。详见药物手册，例如《雷明顿药物科学》或《药物赋形剂手册》(Pharmaceutical ExcipientHandbook)。
以下实施例描述了本发明一些具体激动剂的制备方法与活性。
合成缩写Fmoc芴基-9-甲氧基羰基DMF二甲基甲酰胺Pbf2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基Trt三苯基甲基Boc或tBoc丁氧基羰基Dde1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基(dioxocyclohexylidene))乙基HCTU1H-苯并三唑1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5氯-，六氟磷酸盐(1-)，3-氧化物(1H-Benzotriazolium 1-[bis(dimethylamino)methylene]-5chloro-，hexafluorophosphate(1-)，3-oxide)TFA三氟乙酸MALDI衬质辅助激光解吸电离NHSN-羟基琥珀酰亚胺可通过固相肽合成采用自动肽合成仪或传统的分步合成(bench synthesis)来合成本发明的肽激动剂。固体支持物可以是，例如氯三苯甲基(Cl)或Wang(OH)树脂，二者均不难购得。这些树脂的活性基团易于和N-Fmoc氨基酸的羧基反应，从而使其与聚合物共价结合。可通过与哌啶接触使结合在树脂上的胺脱保护。然后将第二种N-保护的氨基酸偶联于树脂-氨基酸。重复这些步骤直至获得所需序列。合成结束时，结合在树脂上的受保护肽可脱保护用三氟乙酸(TFA)从树脂上切下。有助于将新的氨基酸偶联于结合在树脂上的氨基酸链的试剂例子有六氟磷酸四甲基脲鎓(HATU)、六氟磷酸O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓(HBTU)，四氟硼酸O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲(TBTU)、1H-羟基苯并三唑(HOBt)。
除固相化学方法外，通过溶液化学方法肽合成也是可行的。
例如，修饰肽链中氨基酸的侧链氨基或羧基以引入上述GAG-结合基序或其它基序是不涉及此反应的其它反应活性侧链基团的选择性保护和脱保护的简单方法。
本文所称的肽可用Fmoc化学方法用超过5倍量的试剂在PAL Peg-PS树脂(酰胺树脂(amide resin Applied Bioscience，Warrington，UK GEN913401)上通过固相合成来制备。整个偶联过程通过HCTU，用DMF作为溶剂进行。用DMF配制的20％哌啶处理10-15分钟以除去Fmoc。然而，这些肽也可用各种其它标准的肽合成方法来合成，例如除固相方法以外的tBOC化学法和溶液化学法。下文说明了合成方法，但本发明考虑的其它肽可通过类似的方法制备合成[Cys2，Lys13，D-Cys27]PYY及其类似物下文描述了环形Y2选择性肽[Cys2，Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No39)的合成与其在Lys13的ε氨基上连有GAG-结合基序、血清蛋白结合基序或聚乙二醇基序的类似物的合成。
总体上，侧基保护是标准的Fmoc(方法)，除了Arg＝Fmoc Arg(Pbf)-OHAsn，Gln＝Fmoc Asn(Trt)-OHThr，Ser，Asp，Glu，Tyr＝叔丁基Lys＝Fmoc Lys(tBoc)-OHAla-Ser 22-23＝Fmoc AlaSer假脯氨酸(pseudoproline)
在[Cys2，Lys13，D-Cys27]PYY例子中，，采用以下特定的保护基团以获得选择性脱保护Tyr1＝tBoc Tyr(tBu)-OHLys13＝Fmoc Lys(Dde)-OHCys27＝Fmoc DLys(Trt)-OH采用Fmoc化学方法用超过5倍摩尔量的试剂在PAL Peg-PS树脂(酰胺树脂(切割后可产生生物学上重要的羧酰胺基团的树脂)上进行肽的固相合成。整个偶联过程通过HCTU，用DMF作为溶剂进行。每步偶联后，用DMF配制的20％哌啶处理10-15分钟以除去Fmoc。每步后通过定量茚三酮试验核查偶联情况。在某些例子中可进行双重偶联。
全长肽合成后，用DMF配制的2％肼处理15-20分钟除去Lys13的ε氨基保护基团，而肽仍连接在树脂上。
然后将树脂分为不同的批次以产生未衍生的肽以及3种不同的基序修饰肽1.将[Cys2，Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No39)(“母体肽”)从树脂上切下并用95％三氟乙酸∶2.5％水∶2.5％三丙基硅烷处理2-3小时脱保护。
将肽溶解在pH 8.5-9的乙酸铵中使浓度＜1mg/ml并搅拌24-48小时直至Ellman试验检测不到游离的巯基，从而通过空气氧化在Cys2和D-Cys27之间产生分子内的稳定性二硫键。
通过反向HPLC纯化肽Vydac 300柱，在250mm×10mm柱中用(缓冲液A＝水配制的0.05％TFA；缓冲液B＝60％MeCN∶40％水∶0.05％TFA)30-80％缓冲液B梯度洗脱20分钟，流速2ml/分钟。测定OD 215nm，收集含有特定肽的洗脱液并冻干。
通过质谱、氨基酸分析，在许多情况中也通过氨基酸序列分析来确认肽结构。
2.[Cys2，N-(8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基)-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No28)-为连接血清白蛋白结合基序，除去保护性Dde基团，肽仍连接在树脂上，用受保护的氨基辛酸(处理)两次然后用受保护的γ谷氨酸(处理)，从而通过肽合成将8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基基团连接到Lys13的游离ε氨基上。
从树脂上切下基序修饰的肽，按上述“母体肽”脱保护、环化并纯化。
3.荧光素-[Cys2，N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No30)-为了连接GAG-结合基序，在除去Dde基团后，用上述标准的Fmoc化学试剂，在仍连在树脂上的[Cys2，Lys13，D-Cys27]PYY肽上利用Lys13的游离ε氨基通过肽合成逐步构建该基序以此方式连接的GAG结合序列是Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala。为体外和体内分析的目的，给最终的GAG-结合序列的N-末端加入荧光素标记基团的5，6异构体(NHS酯，10倍过量，72小时)。
从树脂上切下GAG基序修饰的肽，按上述“母体肽”脱保护、环化并纯化。
4.[Cys2，N-{N’-(21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧杂二十一碳酰基)}-γ谷氨酰基-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No37)—为了连接聚乙二醇部分与Y2选择性肽，除去Dde基团后，在仍连在树脂上的[Cys2，Lys13，D-Cys27]PYY肽上利用Lys13的游离ε氨基通过肽合成，然后通过受保护的γ-谷氨酸连接受保护的21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧杂二十一碳烷酸。
从树脂上切下PEG化的肽，按上述“母体肽”脱保护、环化并纯化。
采用以上方法合成了作为实例的以下本发明激动剂PYY2-36(SEQ ID No4)NPY2-36(SEQ ID No5)[D-Ala1]PYY(SEQ ID No6)[D-Ala2]PYY(SEQ ID No7)[Ala28]PYY(SEQ ID No8)[Ala30]PYY(SEQ ID No9)[Ala31]PYY(SEQ ID No10)
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PYY25-36(SEQ ID No11)[Lys4，Gln34]PP(SEQ ID No12)[Cys2，D-Cys27]PYY(SEQ ID No13)[Cys2，D-Cys27]NPY(SEQ ID No14)[Cys2，Ile3，D-Cys27，Val31]NPY(SEQ ID No15)[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY(SEQ ID No16)[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]NPY(SEQ ID No17)[Cys2，Ile3，Aoc5-24，D-Cys27，Val31]NPY(SEQ ID No18)[Lys28，Glu32]PYY25-36(SEQ ID No19)[Glu28，Lys32]PYY25-36(SEQ ID No20)Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-PYY25-36(SEQ ID No21)[D-Ala2]PYY2-36(SEQ ID No22)[Lys4，Leu17，Gln34]PP(SEQ ID No23)[Lys4，Leu17，Leu30，Gln34]PP(SEQ ID No24)[Lys4，Nle17，Nle30，Gln34]PP(SEQ ID No25)[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys4，Nle17，Nle30，Gln34]PP(SEQ IDNo26)N-乙酰基[Cys2-DCys27]PYY2-36(SEQ ID No27)[Cys2，N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ IDNo29)[Cys2，N-PEG5000-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No31)[Cys2，Ile3，D-Cys27，Leu28，Val31]NPY(SEQ ID No32)[Cys2，Ile3，Nle17，D-Cys27，Nle28，Val31]NPY(SEQ ID No33)N-乙酰基-脱Tyr1[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY(SEQ ID No34)N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-[Cys2，D-Cys27]PYY(SEQ ID No35)肽的化学分析为说明所用的方法和达到的结果，下文列出了对用上述方法合成的本发明的一些肽的分析数据数据
分析性HPLC方法A柱＝Vydac C18肽-蛋白质柱，250×4.6mm缓冲液A＝水配制的0.05％TFA缓冲液B＝100％MeCN配制的0.05％TFA梯度＝20分钟内从0％B到60％B流速＝1.00mL/分钟波长＝215nm质谱＝用龙胆酸或□氰基羟基肉桂酸作为基质的MALDI-TOF分析性HPLC方法B柱＝Hypersil ODS-2，250×4.6mm缓冲液A＝100％MeCN配制的0.1％TFA
缓冲液B＝100％水配制的0.1％TFA梯度＝25分钟内从24％A到35％A流速＝1.00mL/分钟波长＝220nm质谱＝ESI[雾化器气体流速1.5L/分钟；CDL-20.0v；CDL温度250℃；阻断温度(block temp)200℃；探针偏置(probe bias)+4.5ky；检测器1.5kv；T.流速0.2mL/分钟；B.浓度50％H20/50％CAN.]分析性HPLC方法C柱＝Vydac C18 218TP54，250×4.6mm缓冲液A＝20mL MeCN和2mL水配制的TFA(总体积2000mL)缓冲液B＝2mL水配制的TFA(总体积2000mL)梯度＝27分钟从25％B到75％B流速＝1.00mL/分钟波长＝215nm注射体积＝10μL生物试验和结果I.测定肽亲和力和效力的体外试验人Y2受体亲和力试验在竞争性结合试验中利用结合于COS-7细胞中的125I-PYY来测定测试化合物对人Y2受体的亲和力，所述COS-7细胞采用标准磷酸钙转染方法用人Y2受体瞬时转染。
转染1天后，转染的COS-7细胞以40×103细胞/孔的密度转移至培养板，目标为结合5-8％的放射性配体。转染两天后，用25pM的125I-PYY(Amersham，Little Chalfont，UK)在4℃进行竞争性结合试验3小时。结合试验在0.5mL补充了以下成分的50mM Hepes缓冲液，pH7.4中进行1mM CaCl2、5mM MgCl2和0.1％(w/v)牛血清白蛋白和100μg/ml杆菌肽。由于是在含有1μM未标记的PYY时(进行)结合，测定了非特异性结合。细胞用0.5ml冰冷却的缓冲液洗涤两次，加入0.5-1ml裂解缓冲液(8M脲，3M乙酸配制的2％NP40)，用γ计数器计算结合的放射活性。测定按一式两份进行。用放射性配体在这些条件下达到稳态结合。
利用标准的药理学数据处理软件，Prism 3.0(graphPad Sofware，SanDiego，USA)计算EC50值。
人Y4受体亲和力试验除了利用人Y4-转化的COS-7细胞，其方案同Y2亲和力试验一样，竞争性试验采用125I-PP，而PP用于非特异性结合的测定。
人Y1受体亲和力试验除了采用人Y1-转化的COS-7细胞和以1.5×106细胞/孔的密度转移至培养板外，其方案同Y2亲和力试验一样，竞争性试验采用125I-NPY，而NPY用于非特异性结合的测定。
人Y5受体亲和力试验除了采用人Y5-转化的COS-7细胞和以5×105细胞/孔的密度转移至培养板外，其方案同Y2亲和力试验一样，竞争性试验采用125I-NPY，而NPY用于测定非特异性结合。
在以上亲和力试验中测试NPY、PYY、PYY3-36、PP和本发明的其它一些激动剂的结果见表1
表1
人Y2受体效力试验在COS-7细胞中进行剂量-反应实验测定测试化合物对人Y2受体的效力，COS-7细胞用人Y2受体以及能确保Y2受体经导致磷酸肌醇酯转化增加Gq途径偶联的混杂G蛋白，Gqi5瞬时转染。
磷脂酰肌醇转化-转染一天后，将COS-7细胞与5μCi的[3H]-肌醇(Amersham，PT6-271)在补加了10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和0.01mg/ml庆大霉素/孔的1ml培养基中培育24小时。细胞用补加了140mM NaCl、5mM KCl、1mM MgSO4、1mM CaCl2、10mM葡萄糖、0.05％(w/v)牛血清的20mM HEPES，pH7.4的缓冲液洗涤两次；用补加了10mM LiCl的0.5ml缓冲液37℃培育30分钟。在37℃用各种浓度的肽刺激45分钟后，用10％冰冷却的高氯酸提取细胞，然后在冰上培育30分钟。用HEPES缓冲液配制的KOH中和得到的上清液，在Bio-Rad AG 1-X8阴离子交换树脂上纯化产生的[3H]-磷酸肌醇酯并用β计数器计数。测定按一式两份进行。利用标准的药理学数据处理软件，Prism 3.0(graphPad Sofware，San Diego，USA)计算EC50值。
人Y4受体效力试验除了采用人Y4-转化的COS-7细胞以外，其方案同Y2效力试验一样。
人Y1受体效力试验除了采用人Y1-转化的COS-7细胞以外，其方案同Y2效力试验一样。
人Y5受体效力试验除了采用人Y5-转化的COS-7细胞以外，其方案同Y2效力试验一样。
在以上效力试验中测定NPY、PYY、PYY3-36、PP和本发明四种激动剂的结果见表2
表2
II.测定蛋白质稳定性的体外试验本发明许多肽的重要量度是蛋白质稳定性，特别是例如对酶降解的稳定性，因为与例如PYY3-36相比，设计的这些肽具有增加的稳定性，或者甚至与全长PYY和PP相比，其稳定性增加。
PP-折叠的稳定性-测定了所述肽对在能切割例如环形区的内切肽酶降解的稳定性，该区域如所述具有相对可弯曲性(O’Hare，M.和Schwartz，T.W.1990，在《生物活性物质的降解生理学和病理生理学》(Degradation of BioactiveSubstancesPhysiology and Pathophysiology)中所述，J.Henriksen编，CRC Press，Boca Raton，F1.)。利用内切蛋白酶Asp-N(Pierce)作为模型酶。该酶在Asp残基的N-末端侧，例如PP中残基9和10(Asp)之间切割。根据生产商的说明，将这些肽于室温在0.01M Tris/HCl，pH 7.5的缓冲液中与有效剂量的内切肽酶Asp-N一起培育24小时以上不同时间段后取样。HPLC分析样品并跟踪这些肽随时间推移的逐步降解情况。比较这些肽与PYY、PYY13-36和PP的稳定性。
对氨肽酶的稳定性-方法如上述内切肽酶测定的，但采用氨肽酶N和二肽基肽酶IV。特别设计了能耐受这些氨肽酶的一些肽，例如PYY2-36、N-末端乙酰化的肽衍生物和在N-末端含有白蛋白结合部分的烷基化肽衍生物。比较这些肽与PYY、PYY3-36和PP的稳定性。
III.测定糖胺聚糖(GAG)结合的体外试验在体外试验中利用固定的肝素，即例如HiTrap肝素-琼脂糖柱(AmershamPharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)或肝素HPLC柱监测测试化合物结合GAG的能力，用含2mM DTT和1mM MgEDTA的50mM磷酸钠(pH 7.3)配制的线性梯度0-0.5M NaCl洗脱50分钟，流速1ml/分钟。用缓冲液A配制的1M NaCl洗涤此柱51-55分钟以再生。为了初步分析目的，可以采用分步-梯度的NaCl。
IV.测定这些肽对食欲、食物摄入和体重作用的体内研究Y2选择性激动剂对小鼠急性食物摄入的作用超过Y1和Y4选择性激动剂采用ddy品系小鼠，34-37g和8-9周龄(Japan SLC，Shizuuoka，Japan)。小鼠分别养在12-小时白天-黑夜周期，7AM开始日照的受控环境中(22℃，55％湿度)。实验开始前(见下文)可随意吃食和饮水。在实验开始前的一星期中使小鼠适应皮下注射。每只小鼠在实验中使用一次。给药之前用生理盐水稀释肽作皮下注射，100μL体积。结果表示为平均值+/-SE。方差分析后用Bonferroni试验评估各组间差异。
在实际测试前16小时，小鼠不许进食但可随意饮水，实验在第二天上午10时开始。采用标准饮食(CLEA Japan，Inc.，Tokyo，Japan)，给药后通过从最初预先测量过的食物减去未吃的食物来测定食物摄入并检查食物的散落情况。各组8只小鼠接受盐水、或3μg PYY3-36、30μg PYY3-36、10μg测试化合物或100μg测试化合物。-PYY(Seq ID No13)作为测试化合物的结果见图4。
序列NPY(SEQ ID No1)H2N-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2PYY(SEQ ID No2)H2NTyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2PP(SEQ ID No3)H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2PYY2-36(SEQ ID No4)H2N-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2NPY2-36(SEQ ID No5)H2N-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2[D-Ala1]PYY(SEQ ID No6)H2N-D-Ala-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2[D-Ala2]PYY(SEQ ID No7)H2N-Tyr-D-Ala-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2[Ala28]PYY(SEQ ID No8)H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Ala-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2[Ala30]PYY(SEQ ID No9)H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-[Ala]-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
序列(续1)[Ala31]PYY(SEQ ID No10)H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-[Ala]-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PYY25-36(SEQ ID No11)Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2[Lys4，Gln34]PP(SEQ ID No12)H2N-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2[Cys2，D-Cys27]PYY (SEQ ID No13) [Cys2，D-Cys27]NPY(SEQ ID No14) [Cys2，Ile3，D-Cys27，Val31]NPY(SEQ ID No15) [Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY(SEQ ID No16)
序列(续2)[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]NPY(SEQ ID No17) [Cys2，Ile3，Aoc5-24，D-Cys27，Val31]NPY(SEQ ID No18) [Lys28，Glu32]PYY25-36(SEQ ID No19) [Glu28，Lys32]PYY25-36(SEQ ID No20) Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-PYY25-36(SEQ ID No21)Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2[D-Ala2]PYY2-36(SEQ ID No22)H2N-D-Ala-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2[Lys4，Leu17，Gln34]PP(SEQ ID No23)H2N-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2[Lys4，Leu17，Leu30，Gln34]PP(SEQ ID No24)H2N-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
序列(续3)[Lys4，Nle17，Nle30，Gln34]PP(SEQ ID No25)H2N-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys4，N1e17，Nle30，Gln34]PP(SEQID No26) N-乙酰基[Cys2-DCys27]PYY2-36(SEQ ID No27) [Cys2，N-(8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基)-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No28) [Cys2，N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ IDNo29)
序列(续4)[Cys2，N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No30) [Cys2，N-PEG5000-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No31) [Cys2，Ile3，D-Cys27，Leu28，Val31]NPY(SEQ ID No32) [Cys2，Ile3，Nle17，D-Cys27，Nle28，Val31]NPY(SEQ ID No33) N-乙酰基-脱Tyr1[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY(SEQ ID No34) [Cys2，Ile3，Aoc5-24，D-Cys27，Val31]NPY(SEQ ID No35)
序列(续5)N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-[Cys2，D-Cys27]PYY(SEQ ID No35) [Cys2，D-Cys27]PYY2-36(SEQ ID No36) [Cys2，N-{N’-(21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧杂二十一碳酰基)}-γ谷氨酰基-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No37) [Cys2，N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No38) [Cys2，Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No39)
附录我们的题为“用于治疗性干预的Y4选择性受体激动剂”的待批国际专利申请描述了Y4选择性激动剂在各种治疗和美容中的应用，例如用于治疗肥胖症和超重以及认为这些情况是影响因素的疾病，如腹泻和肠道分泌过多(intestinal hypersecretion)。
本发明的Y4受体激动剂是(a)一种具有以下成分的PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物(i)以-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端Y4受体识别氨基酸序列，其中R1和R1独立为氢或C1-C6烷基，X是Val、Ile、Leu或Ala，X3是除Gln以外的残基，或它们的保守取代变体，其中Thr被His或Asn所取代和/或Tyr被Trp或Phe所取代；和/或Arg被Lys所取代，和(ii)以H2N-X1-Pro-X2-(Glu or Asp)-表示的N-末端Y4受体识别氨基酸序列，其中X1不存在或是任何氨基酸残基，X2是Leu、Ile或Ser或它们的保守性取代，或者(b)含有以上(i)所定义的C-末端Y4受体识别序列所述序列与毗邻所述六肽序列的N-末端含有至少一个α螺旋转角的两亲性氨基酸序列结构域相融合，所述转角因分子内共价连接束缚于螺旋构型中，并且任选含有始于以上(ii)所定义的Y4受体识别氨基酸序列的N-末端序列；或者(c)含有两条共价相连的C-末端Y4受体识别氨基酸序列，每条至少含有以上(i)所定义序列的最后4个残基。本发明(a)、(b)或(c)型激动剂中存在的一组优选C-末端Y4受体识别氨基酸序列以-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示，其中X和X3如上所述，R1和R2各自是氢。残基X3也优选不应是Asn，Lys、Arg、Asp或Glu优选不是X3残基。当前优选X3是Pro，但X3也可以是His或选自4-羟基脯氨酸、氮杂环丁烷-2-羧酸、氮杂环丁烷-3-羧酸、氮杂脯氨酸(azaproline)和1-氨基环丁烷羧酸的非天然脯氨酸类似物。该激动剂的C-末端Y4受体识别氨基酸序列的一个优选残基X是Leu。
6个残基的C-末端Y4识别序列可以是以-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端六肽的最后残基，其中残基XA是非碱性和非酸性残基。在这种情况中，所述非酸性和非碱性氨基酸残基XA可以是，例如Leu或Met。
此外，前段所述的C-末端六肽序列本身可以是以-XC-Tyr-XB-Asn-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端十一肽的最后残基，其中序列-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2如上段所述，其中XC是Arg或Lys，XB是Ile、Leu或Val。这种十一肽序列的例子包括-Arg-Tyr-Ile-Asn-(Leu或Met)-Leu-Thr-Arg-(Pro或His)-Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
C-末端十一肽的另一例子以-XC-Tyr-XB-Asn-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示，其中XC是His、Asn或Gln，XB是Ile、Leu或Val。这种序列的例子是-His-Tyr-(Ile或Leu)-Asn-Leu-(Val/Ile)-Thr-Arg-(Pro或His)-Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
在一组(a)或(b)型PP-折叠模拟激动剂中，含有Y4受体识别氨基酸序列的C-末端序列可以在其N-末端与两亲性氨基酸序列结构域相合，该结构域含有毗邻所述表位N-末端的至少一个α螺旋转角和至少两个氨基酸的N-末端序列，所述C-和N-末端氨基酸序列通过肽键与接头基团相连，接头基团可以是任选含有一个或多个双键或三键的直链或支链亚烷基。例如，接头基团可以分别与式NH2(CH2)nCO2H氨基酸的羧基和氨基形成肽键，其中n是2-12，特别是6、7、8、9或10。因此，该激动剂可以是具有上述Cys-Cys键的NPY、PPY或PP的类似物，但对应于天然肽的5-24位氨基酸残基被具有6-10个碳原子，选自6-氨基己酸(ε-氨基己酸)、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸和氨基癸酸的氨基羧酸所取代。在具体的实施方案中，优选8-氨基辛酸(本文有时缩写为“Aoc”)。这种激动剂的一个例子是[Cys2，Aoc5-24，Dcys27]-PP(SEQ ID.No9)。
在(a)和(b)型激动剂的N-末端Y4受体识别氨基酸序列中，残基X1可以是Ala或不存在。此外，在该激动剂的N-末端Y4受体识别氨基酸序列中，残基X2可以是Leu、Ile或Ser。
这种N-末端序列的具体例子H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-和H2N-Pro-Leu-Glu-。
待批国际专利申请的激动剂，Y4选择性激动剂的具体例子如下PP2-36[His34]-PP[Ala1，Pro34]-PYY[Ala2，Pro34]-PYY[Glu4，Pro34]-PYY[Ala1，Glu4，Pro34]-PYY[Arg26，Pro34]-PYY[Ile28，Pro34]-PYYMet30，Pro34]-PYY[Cys2，DCys27]-PP[Cys2，Aoc5-24，Dcys27]-PP([Lys28，Glu32]PP25-36[Glu28，Lys32]PP25-36S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2和它们的保守性取代类似物。
权利要求
1.除PYY3-36以外的Y受体激动剂在制备治疗对Y2受体激活起反应疾病的组合物中的应用，所述激动剂对Y2受体的选择性超过Y1和Y4受体(a)所述激动剂是选自PYY、NPY、PYY模拟物和NPY模拟物的PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物，这些肽或肽模拟物具有C-末端Y2受体识别氨基酸序列和不具有对应于NPY的Tyr1的酪氨酸残基和/或不具有对应于NPY的Pro2的脯氨酸残基和/或不具有对应于NPY的Ser3的丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸残基不具有对应于NPY的Lys4的赖氨酸或精氨酸残基和/或在对应于NPY的Leu24位具有除亮氨酸以外的残基和/或在对应于NPY的Arg25位具有除精氨酸以外的残基和/或在对应于NPY的His26位具有除组氨酸以外的残基和/或在对应于NPY的Ile28位具有除异亮氨酸以外的残基和/或在对应于NPY的Asn29位具有除天冬酰胺以外的残基和/或在对应于NPY的Leu30位具有除亮氨酸或甲硫氨酸以外的残基；或(b)所述激动剂是选自PP和PP-模拟物的PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物，这些肽和肽模拟物具有C-末端Y2受体识别氨基酸序列和在对应于PP的Pro2位不具有脯氨酸残基和/或在对应于PP的Leu3位不具有亮氨酸残基和/或在对应于PP的Glu4位不具有谷氨酸残基；或(c)所述激动剂(i)含有的C-末端Y2受体识别氨基酸序列在其N-末端与毗邻所述Y2受体识别序列的N-末端的含有至少一个α螺旋转角的两亲性氨基酸序列结构域相融合，所述转角因分子内共价键而被束缚于螺旋构型中，和(ii)，如果该激动剂具有类似于NPY或PYY的N-末端结构，则其含有一个或多个以上(a)所列出的修饰，以及如果所述激动剂具有类似于PP的N-末端结构，则其含有一个或多个以上(b)所列出的修饰。(a)型
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述激动剂是(a)型并且在对应于NPY的Tyr1位具有除Tyr、Trp或Phe以外的残基和/或在对应于NPY的Pro2位具有除Pro以外的残基和/或在对应于NPY的Ser3位具有除Ile、Leu、Val、Phe、Trp、Tyr、Ser、Thr和Asn以外的残基和/或在对应于NPY的Lys4位具有除赖氨酸或精氨酸以外的残基。(b)型
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述激动剂是(b)型并且在对应于PP的Pro2位具有除Pro、Tyr、Phe和Trp以外的残基和/或在对应于PP的Leu3位具有除Ile、Leu、Met和Val以外的残基和/或在对应于PP的Glu4位具有除Glu或Asp以外的残基。(c)型
4.如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述激动剂是(c)型并且具有PP-折叠结构，其中束缚螺旋转角的分子内连接键从两亲性结构域的一个氨基酸残基延伸至该激动剂的N-末端部分的连接点，该N-末端部分对应于反平行延伸至两亲性结构域的PP-折叠肽的聚脯氨酸结构域。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述束缚螺旋转角的分子内连接键从两亲性结构域的一个氨基酸残基延伸至4个N-末端残基之一。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述激动剂中束缚螺旋转角的分子内连接键是二硫键或内酰胺键。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述激动剂中束缚螺旋转角的分子内连接键是在所述螺旋转角中的Lys和Glu残基之间，或在所述螺旋转角中的Lys或Glu残基与C-末端Y2识别序列中的Glu或Lys残基之间形成的内酰胺键。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述激动剂中分子内共价键是在α螺旋中的L-或D-Cys残基与位于该激动剂N-末端部分中的Cys残基之间形成的二硫键，该N-末端部分对应于反平行延伸至两亲性结构域的PP-折叠肽的聚脯氨酸结构域。
9.以上任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的C-末端Y2受体识别氨基酸序列是-X-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2，其中X不是碱性或酸性残基，R1和R1独立为氢或C1-C6烷基，或它们的保守取代变体，其中Thr被His或Asn所替代和/或Tyr被Trp或Phe所替代；和/或Arg被Lys所替代。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的C-末端Y2受体识别氨基酸序列是-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的C-末端Y2受体识别氨基酸序列是-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
12.以上任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述激动剂具有的包含Y2受体识别氨基酸序列的C-末端序列在其N-末端与两亲性氨基酸序列结构域相融合，该结构域含有毗邻所述表位N-末端的至少一个α螺旋转角和至少两个氨基酸的N-末端序列，所述C-和N-末端氨基酸序列通过肽键分别与式NH2(CH2)nCO2H氨基酸的羧基和氨基相连，其中n是2-12。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，n是6、7、8、9或10。
14.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述激动剂选自PYY2-36(SEQ ID No4)NPY2-36(SEQ ID No5)[D-Ala1]PYY(SEQ ID No6)[D-Ala2]PYY(SEQ ID No7)[Ala28]PYY(SEQ ID No8)[Ala30]PYY(SEQ ID No9)[Ala31]PYY(SEQ ID No10)[Lys4，Gln34]PP(SEQ ID No12)[Cys2，D-Cys27]PYY(SEQ ID No13)[Cys2，D-Cys27]NPY(SEQ ID No14)[Cys2，Ile3，D-Cys27，Val31]NPY(SEQ ID No15)[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]NPY(SEQ ID No17)[Cys2，Ile3，Aoc5-24，D-Cys27，Val31]NPY(SEQ ID No18)[Lys28，Glu32]PYY25-36(SEQ ID No19)[Glu28，Lys32]PYY25-36(SEQ ID No20)[D-Ala2]PYY2-36(SEQ ID No22)[Lys4，Leu17，Gln34]PP(SEQ ID No23)[Lys4，Leu17，Leu30，Gln34]PP(SEQ ID No24)[Lys4，Nle17，Nle30，Gln34]PP(SEQ ID No25)[Cys2，Ile3，D-Cys27，Leu28，Val31]NPY(SEQ ID No32)[Cys2，Ile3，Nle17，D-Cys27，Nle28，Val31]NPY(SEQ ID No33)[Cys2，D-Cys27]PYY2-36(SEQ ID No36)和它们的保守取代类似物。
15.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述激动剂是[Cys2，D-Cys27]PYY(SEQ ID No13)或其保守取代类似物。
16.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述激动剂是[Lys4，Gln34]PP SEQ ID No12)或其保守取代类似物。
17.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述激动剂是[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY SEQ ID No13或其保守取代类似物。
18.以上任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述激动剂的N-末端被以抵抗氨肽酶活性。
19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述激动剂的N-末端用具有2-24个碳原子的碳链，例如N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-[Cys2，D-Cys27]PYY(SEQ ID No35)酰化。
20.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述激动剂的N-末端用例如N-乙酰基-脱Tyr1[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY(SEQ ID No34)或N-乙酰基[Cys2-DCys27]PYY2-36(SEQ ID No27)酰化。
21.如以上任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述激动剂是PYY3-36或如任一项权利要求所定义的，并含有血清白蛋白结合基序或糖胺聚糖(GAG)结合基序或螺旋诱导基序或是PEG化的。
22.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的血清白蛋白结合基序是亲脂性基团。
23.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的亲脂性基团含有任选取代的、饱和或不饱和的、直链或支链的10-24个碳原子的烃基团。
24.如权利要求22或23所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的亲脂性基团是该激动剂骨架侧链，或是其一部分。
25.如权利要求24所述的应用，其特征在于，所述激动剂中含有亲脂性基团的侧链通过醚、硫醚、氨基、酯或酰胺键与骨架中的残基相连。
26.如权利要求25所述的应用，其特征在于，所述激动剂中含有亲脂性基团的侧链选自CH3(CH2)nCH(COOH)NH-CO(CH2)2CONH-，其中n是9-15的一个整数，CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CONH-，其中r是9-15的一个整数，CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CONH-，其中s是9-15的一个整数，CH3(CH2)mCONH-，其中m是8-18的一个整数，-NHCOCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3，其中p是10-16的一个整数，和-NHCO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3，其中q是10-16的一个整数，CH3(CH2)nCH(COOH)NHCO-，其中n是9-15的一个整数，CH3(CH2)pNHCO-，其中p是10-18的一个整数，-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3，其中m是8-18的一个整数，-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3，其中p是10-16的一个整数，-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3，其中q是10-16的一个整数，和部分或完全氢化的环戊菲骨架。
27.如权利要求24所述的应用，其特征在于，所述激动剂中含有亲脂性基团的侧链是酰化该激动剂骨架残基侧链中氨基的C12、C14、C16或C18酰基。
28.如权利要求24所述的应用，其特征在于，所述激动剂中含有亲脂性基团的侧链是酰化该激动剂骨架残基侧链中氨基的十四烷酰基。
29.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述激动剂是Lys13-十四烷酰基-[Cys2，Lys13，D-Cys27]PYY、Lys4-十四烷酰基-[Cys2，D-Cys27]PYY、[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys4，Nle17，Nle30，Gln34]PP(SEQ IDNo26)[Cys2，N-(8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基)-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No28)[Cys2，N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No29)，或它们的保守取代类似物。
30.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述激动剂是Lys13-十四烷酰基-[Lys13]PYY3-36或Lys4-十四烷酰基-PYY3-36或其保守取代类似物。
31.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的GAG结合基序是该激动剂骨架侧链的氨基酸序列，或者是其一部分。
32.如权利要求31所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的GAG-结合基序含有氨基酸序列XBBXBX和/或XBBBXXBX，其中B是碱性氨基酸残基，X是任何氨基酸残基。
33.如权利要求31或32所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的GAG-结合基序是多联体或枝状体。
34.如权利要求31到33中任一项所述的应用，其特征在于，所述GAG-结合基序是通过酰胺键偶联的Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala，所述酰胺键形成在多联体GAG-结合基序的C-末端和[Cys2，Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No39)的Lys13的ε氨基之间。
35.如权利要求31到33中任一项所述的应用，其特征在于，所述GAG-结合基序是通过酰胺键偶联的Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala，所述酰胺键形成在多联体GAG-结合基序的C-末端和[Cys2，Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ IDNo39)的Lys13的ε氨基之间。
36.如权利要求31到33中任一项所述的应用，其特征在于，所述GAG-结合基序是通过酰胺键偶联的Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala，所述酰胺键形成在多联体GAG-结合基序的C-末端和[Lys13]PYY3-36的Lys13的ε氨基之间。
37.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的GAG-结合基序直接或通过接头基团共价连接于该激动剂的C-或N-末端。
38.如权利要求37所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的GAG-结合基序直接或通过接头基团共价连接于该激动剂的N-末端。
39.如权利要求37或38所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的GAG-结合基序含有氨基酸序列XBBXBX和/或XBBBXXBX，其中B是碱性氨基酸残基，X是任何氨基酸残基。
40.如权利要求37或38所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的GAG-结合基序含有氨基酸序列[XBBBXXBX]n，其中n是1-5，B是碱性氨基酸残基，X是任何氨基酸残基。
41.如权利要求37所述的应用，其特征在于，所述激动剂是[XBBBXXBXXBBBXXBX]PYY25-36或是[XBBBXXBXXBBBXXBXXBBBXXBX]PYY25-36，其中B是碱性氨基酸残基，X是任何氨基酸残基。
42.如权利要求37所述的应用，其特征在于，所述肽是Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-PYY25-36(SEQ ID No21)或[Cys2，N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No30)。
42.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的PEG是分子量最高约20kDa的聚乙二醇或聚环氧乙烷。
43.如权利要求20或41所述的应用，其特征在于，所述激动剂是在Lys4处PEG化的[Cys2，DCys27]PYY或在Lys13处PEG化的[Cys2，Lys13，DCys27]或是[Cys2，N-PEG5000-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No31)或是[Cys2，N-{N’-(21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧杂二十一碳酰基)}-γ谷氨酰基-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No37)。
44.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的螺旋诱导肽直接或通过接头基团共价连接于该激动剂的C-或N-末端。
45.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的螺旋诱导肽直接或通过接头基团共价连接于该激动剂的N-末端。
46.如权利要求44或45所述的应用，其特征在于，所述螺旋诱导肽具有4-20个选自以下的氨基酸残基Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met、Orn和式-NH-C(R1)(R2)-CO-的氨基酸残基，其中R1是氢，R2是任选取代的C1-C6烷基、苯基或苯基甲基，或者R1和R2与和它们相连的C原子结合一起形成环戊基、环己基或环庚基环。
47.如权利要求44或45所述的应用，其特征在于，所述螺旋诱导肽含有4、5或6个Lys残基。
48.如权利要求44或45所述的应用，其特征在于，所述激动剂是Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PYY25-36(SEQ ID No11)。
49.如权利要求22-36、43或44中任一项所述的应用，其特征在于，所述激动剂中的血清白蛋白结合基序或GAG结合基序或PEG基团是，或者可以形成骨架碳侧链的一部分，所述骨架碳对应于PYY或PP的以下任一位置1、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、17、18、19、21、22、23、25、26、28、29、30和32，或对应于NPY的以下任一位置1、3、4、6、7、10、11、12、14、15、16、17、18、19、21、22、23、25、26、28、29、30和32。
50.如权利要求49所述的应用，其特征在于，所述激动剂是(c)型，血清白蛋白结合基序或GAG结合基序或PEG基团是，或形成骨架碳侧链的一部分，所述骨架碳对应于PYY、NPY或PP的以下任一位置2、5、8、9、13、14、20和24。
51.如权利要求49所述的应用，其特征在于，所述激动剂如权利要求12所述，血清白蛋白结合基序或GAG结合基序或PEG基团是，或形成骨架-(CH2)n-接头基团上侧链的一部分。
52.一种如权利要求16到51中任一项所定义对Y2受体的选择性超过Y1和Y4受体的的Y受体激动剂。
53.如照权利要求16-51中任一项定义的经修饰的PPY3-36。
54.一种对Y2受体的选择性超过Y1和Y4受体，选自以下的Y受体激动剂PYY2-36(SEQ ID No4)NPY2-36(SEQ ID No5)[D-Ala1]PYY(SEQ ID No6)[D-Ala2]PYY(SEQ ID No7)[Ala28]PYY(SEQ ID No8)[Ala30]PYY(SEQ ID No9)[Ala31]PYY(SEQ ID No10)Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PYY25-36(SEQ ID No11)[Lys4，Gln34]PP(SEQ ID No12)[Cys2，D-Cys27]PYY(SEQ ID No13)[Cys2，D-Cys27]NPY(SEQ ID No14)[Cys2，Ile3，D-Cys27，Val31]NPY(SEQ ID No15)[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY(SEQ ID No16)[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]NPY(SEQ ID No17)[Cys2，Ile3，Aoc5-24，D-Cys27，Val31]NPY(SEQ ID No18)[Lys28，Glu32]PYY25-36(SEQ ID No19)[Glu28，Lys32]PYY25-36(SEQ ID No20)Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-PYY25-36(SEQ ID No21)[D-Ala2]PYY2-36(SEQ ID No22)[Lys4，Leu17，Gln34]PP(SEQ ID No23)[Lys4，Leu17，Leu30，Gln34]PP(SEQ ID No24)[Lys4，Nle17，Nle30，Gln34]PP(SEQ ID No25)[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys4，Nle17，Nle30，Gln34]PP(SEQ IDNo26)N-乙酰基[Cys2-DCys27]PYY2-36(SEQ ID No27)[Cys2，N-(8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基)-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No28)[Cys2，N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No29)[Cys2，N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No30)[Cys2，N-PEG5000-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No31)[Cys2，Ile3，D-Cys27，Leu28，Val31]NPY(SEQ ID No32)[Cys2，Ile3，Nle17，D-Cys27，Nle28，Val31]NPY(SEQ ID No33)N-乙酰基-脱Tyr1[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY(SEQ ID No34)N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-[Cys2，D-Cys27]PYY(SEQ ID No35)[Cys2，D-Cys27]PYY2-36(SEQ ID No36)[Cys2，N-{N’-(21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧杂二十一碳酰基)}-γ谷氨酰基-Lys13，D-Cys27]PYY(SEQ ID No37)和它们的保守取代类似物。
55.一种对Y2受体的选择性超过Y1和Y4受体的Y受体激动剂，所述激动剂是[Cys2，D-Cys27]PYY(SEQ ID No13)或其保守取代类似物。
56.一种对Y2受体的选择性超过Y1和Y4受体的Y受体激动剂，所述激动剂是[Lys4，Gln34]PP(SEQ ID No12)或其保守取代类似物。
57.一种对Y2受体的选择性超过Y1和Y4受体的Y受体激动剂，所述激动剂是[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY(SEQ ID No.16)或其保守取代类似物。
58.如权利要求54-59中任一项所述的Y受体激动剂，其特征在于，如权利要求16-51中任一项所定义经修饰的。
59.一种对Y2受体的选择性超过Y1和Y4受体的Y受体激动剂，所述激动剂是Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PYY25-36(SEQ ID No11)或其保守取代类似物。
60.一种治疗对Y2受体激活起反应疾病的方法，所述方法包括给予需要治疗的患者有效量的权利要求1-59中任一项所述的Y2选择性受体激动剂。
61.如权利要求1-50中任一项所述的应用或如权利要求58所述的方法，其特征在于，所治疗的疾病是显示需要调节能量摄入或能量代谢，或诱导血管生成的疾病。
62.如权利要求61所述的应用或方法，其特征在于，所治疗的疾病是显示需要诱导血管生成的疾病，并且其中所述Y2选择性受体激动剂含有GAG-结合基序。
63.如权利要求61所述的应用或方法，其特征在于，所治疗的疾病是显示需要诱导血管生成的疾病，并且其中所述Y2选择性受体激动剂含有血清-结合基序。
64.如权利要求61所述的应用或方法，其特征在于，所治疗的疾病是显示需要诱导血管生成的疾病，并且其中所述Y2选择性受体激动剂是PEG化的。
65.如权利要求61-64中任一项所述的应用，其特征在于，所治疗的疾病是周围血管病、冠状血管病、心肌梗塞、中风、认为任一上述情况是影响因素的疾病、伤口愈合或组织修复。
65.如权利要求61所述的应用或方法，其特征在于，所治疗的疾病是肥胖症或超重，认为肥胖症或超重是影响因素的疾病。
66.如权利要求65所述的应用或方法，其特征在于，所治疗的疾病是显示需要诱导血管生成的疾病，并且其中所述Y2选择性受体激动剂含有血清结合基序。
67.如权利要求65所述的应用或方法，其特征在于，所治疗的疾病是显示需要诱导血管生成的疾病，并且其中所述Y2选择性受体激动剂是PEG化的。
68.如权利要求65-67中任一项所述的应用或方法，其特征在于，所治疗的疾病是食欲过盛、神经性贪食、X综合征(新陈代谢综合征)、糖尿病、2型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)、高血糖、胰岛素耐受、葡萄糖耐受不良、心血管疾病、高血压、动脉粥样硬化、冠状动脉病、心肌梗塞、周围血管病、中风、血栓栓塞性疾病、高胆固醇血症、高脂血症、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖性疾病如多囊性卵巢综合征，或乳腺癌、前列腺癌或结肠癌。
69.如权利要求65到68中任一项所述的方法，其特征在于，所述激动剂给予禁食状态的患者。
70.如权利要求60到68中任一项所述的方法，其特征在于，所述激动剂经胃肠外途径给予患者，包括皮下、肌肉内、静脉内、鼻部、透皮或含服给药。
71.含有一种或多种权利要求1-59中任一项所定义的选择性Y2受体激动剂和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
72.含有一种或多种权利要求1-59中任一项所定义的选择性Y2受体激动剂和美容上可接受的赋形剂的化妆品组合物。
全文摘要
本发明公开了除PYY3－36以外对Y2受体的选择性超过Y1和Y4受体的Y受体激动剂，和它们在治疗因Y2受体激活所致反应疾病中的应用。广泛地说，Y2－选择性激动剂是(a)选自PYY、NPY、PYY模拟物和NPY模拟物的PP－折叠肽或PP－折叠肽模拟物，这些肽或肽模拟物含有C－末端Y2受体识别氨基酸序列和相对于天然肽的各种修饰或(b)选自PP和PP－模拟物的PP－折叠肽或PP－折叠肽模拟物，这些肽和肽模拟物含有C－末端Y2受体识别氨基酸序列和相对于天然肽的各种修饰或(c)具有C－末端Y2受体识别氨基酸序列，该序列在其N－末端与毗邻所述Y2受体识别序列N－末端处含有至少一个α螺旋转角的两亲性氨基酸序列结构域融合，所述转角因分子内共价键而束缚于螺旋构型中，和(ii)，如果该激动剂具有类似于NPY或PYY的N－末端结构时，其含有一个或多个以上(a)所述的修饰，以及如果该激动剂具有类似于PP的N－末端结构时，则其含有一个或多个以上(b)所述的修饰。
文档编号A61P3/06GK1933848SQ200580008680
公开日2007年3月21日 申请日期2005年3月17日 优先权日2004年3月17日
发明者T·施瓦茨 申请人:7Tm制药联合股份有限公司