BS重悬后离心重复3次以彻底洗去血 清，用血小板计数器计数。加适量PBS重悬使细胞密度为I. 5 X IO6Ail。将细胞转入无菌EP 管中，密封，置冰上，待移植。
[0151] 5、MCA0后24h股静脉移植细胞麻醉大鼠，固定，从股静脉进针移植细胞，速度控制 在5分钟/ml左右(其中假手术组和PBS对照组移植ImlPBS ;hNSC治疗组移植ImlhNSC ;和 MCAO模型鼠。所有细胞密度都是I. 5 X IO6Ail )。
[0152] 6、体重变化及行为评估从手术造模开始每天称量大鼠体重。手术后3、5、7、10、14 天进行行为学测试。方法同训练，贴附物移除实验计时改为5min，大于5min按5min计算， 每天2次，中间间隔IOmin以上；转棒仪实验参数设定为25rpm3min，每天2次，间隔10分 钟以上。用SPSS对行为学数据进行差异分析。
[0153] 7、灌注取脑观察两周后深度麻醉大鼠，打开胸腔腹腔充分暴露心脏，用注射器经 心尖通过左心室插入主动脉，剪开右心耳后灌注生理盐水250ml左右至右心耳流出透明液 体。换4%多聚甲醛（PFA)液继续灌注，出现肌颤后缓慢灌注至肝脏的颜色变白变硬，约灌 注250ml。取出大脑，置4%PFA中固定Id后观察梗死区域并拍照。
[0154] 8、HE染色观察及脑梗死体积计算将所有实验组大鼠脑组织于4%多聚甲醛中固定 Id后将脑组织切成2mm厚的5个冠状切片(从松果体腺往嗅球方向每隔2mm切一片)。将切 片于4%多聚甲醛中固定2d，做常规石蜡切片，HE染色，显微镜下观察，拍照。用图像处理软 件处理图像，测量切片梗死区域面积计算脑梗死相对体积，参照Neumann-Haefe I in等的脑 相对梗死体积百分比计算公式：各切片梗死面积=对侧面积一梗死侧非梗死区域面积；各 切片梗死体积=切片两面梗死面积之和X切片厚度/2,相对梗死体积百分比=各切片梗 死体积之和/大脑体积。用SPSS软件分析各组别之间的差异。
[0155] 9、统计学处理
[0156] 用SPSS16. 0统计软件进行分析。数据均采用均数土标准差（i± s)表示，多组间 比较采用单因素方差分析（AN0VA)，组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD法)。
[0157] 结果
[0158] 1、细胞的分离与体外扩增
[0159] 取培养后细胞做流式鉴定，结果表明：Ρ3的hNSC已经有了较高的纯度。
[0160] 2、细胞移植前后各组动物行为学变化及脑梗死体积比较
[0161] 2. 1左腿贴附物移除时间在第3天治疗组贴附物移除时间要显著短于PBS对照组 (P < 0. 05)，第5天后差异不显著（P > 0. 05)，说明干细胞能促进脑损伤大鼠较早的恢复身 体机能，见图1A。
[0162] 2. 2右腿贴附物移除时间DhNSC组与PBS组相比在第14天有显著改善（P < 0. 05)，在其它时间点平均时间比PBS组短；2)PBS组大鼠贴附移除时间两周内与MCAO模 型鼠组相比无显著改善（P < 0. 05)，而治疗组从第5天开始贴附移除时间接近于假手术组 (P > 0· 05)。见图 1B。
[0163] 2. 3转棒仪跑步持续时间DhNSC组平均跑步能力在所有时间点均高于PBS组；2) PBS组与MCAO模型鼠相比跑步能力一直未有显著恢复（P < 0. 05)，从第7天开始治疗组与 假手术组跑步差异不显著（P > 〇. 05);见图1C。
[0164] 2. 4脑梗死体积百分比hNSC组脑梗死体积占总脑体积百分比（12. 2 ±2. 2)显著比 PBS 组（15. 4土 L 3)小（P < 0· 05)，见图 1D。
[0165] 3、脑组织外观及HE染色
[0166] 3. 1脑外观1)假手术组脑组织表面光滑完整；2) MCAO模型鼠和PBS组脑组织表 面粗糙，有一定程度的萎缩和较大面积的梗死区域；3)治疗组脑组织较为光滑，萎缩程度和 梗死区域明显减小；见图2。
[0167] 3. 2HE染色①假手术组脑组织细胞间紧密相连无梗死区域；②PBS组有较大面积 梗死区域，梗死区域细胞稀疏排布；③治疗组梗死区域面积小，梗死区细胞排布稀疏程度 低，见图2。
[0168] 结论：
[0169] hNSC移植治疗MCAO模型大鼠，跟PBS对照组相比，能促进神经功能恢复并且能有 效地减小脑梗死体积。
[0170] 基于本实施例的研究结果，本发明所述方法制备的神经干细胞可用于制备治疗神 经系统疾病如病毒性脑炎、脑萎缩、遗传性小脑共济失调、侧索硬化、脑外伤、脑血管病、帕 金森氏病、老年性痴呆的药物制剂，以及检测诊断试剂。
【主权项】
1. 一种规模化制备神经干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤： A、 幼年动物或胚胎脑组织，称重，按1 :2加入0. 1M/L磷酸盐缓冲液（PBS)，采用电动机 械法绞碎或匀浆； B、 离心，去上清，沉淀用10-100倍体积的0. 01%的胶原酶或胰酶37°C搅拌消化30分 钟，离心，用0.IMPBS洗涤1~3次； C、 用10-100倍体积的0.IMPBS液将沉淀洗出，加胶原酶、蛋白酶K、DNase继续搅拌消 化30分钟，0.IMPBS洗涤3次，沉淀用10-100倍体积的0.IMPBS洗出上层悬浮细胞，过滤， 离心后取细胞悬液进行细胞计数； D、 取上述细胞按IXIO5Ail进行培养，培养基为DMEM/F12培养基，内加bFGF、EGF和牛 血清白蛋白，当培养中神经干细胞生长为神经细胞球后，采用胰酶消化法收集神经干细胞， 传代，接种密度为IXIOVml继续培养； E、 进行大规模(摆瓶法、转瓶法或发酵罐法）细胞扩增，同时保持细胞未分化； F、 当细胞扩增10-100倍后收集细胞，按1-2XIOVml进行细胞冻存，备用； G、 细胞复苏后通过流式细胞和细胞培养检测，符合神经干细胞的特征。2. 根据权利要求1所述的神经干细胞的大规模制备方法，其特征在于：所述神经组织 来源是选自：灵长类、小鼠、大鼠、兔、狗、猪、牛、马的幼年动物或胎儿动物的大脑、小脑、中 脑或脊髓。3. 根据权利要求1所述的神经干细胞的大规模制备方法，其特征在于：所述步骤A中， 所述的机械法包括：电动法(组织绞碎机，研磨机和匀浆机等)，匀浆速度和处理时间由组织 匀浆液的均匀度和细胞存活率决定，不做具体规定。4. 根据权利要求1所述的神经干细胞的大规模制备方法，其特征在于：所述步骤A中， 所述的加PBS的比例为：PBS的重量：神经组织重量为1-100 :1之间的任一比例，优选为10 : 1〇5. 根据权利要求1所述的神经干细胞的大规模制备方法，其特征在于：所述步骤B中， 所述的胶原酶浓度可为〇. 〇〇1%_1%，根据所用胶原酶的活力单位决定，所消化的时间因温度 不同可为1分钟至48小时，由最后所得的细胞数和细胞活力决定，优选0. 01%的II胶原酶 37 °C消化30分钟。6. 根据权利要求1所述的大规模制神经干细胞的方法，其特征在于：所述步骤B中，所 述的胰酶浓度可为〇. 〇〇1%_1%，根据所用胰酶的活力单位决定，所消化的时间因温度不同可 为1分钟至48小时，由最后所得的细胞数和细胞活力决定，优选0. 0125%的胰酶37°C消化 30分钟。7. 根据权利要求1所述的神经干细胞的大规模制备方法，其特征在于：所述步骤E中， 所述的方法为摆瓶法或转瓶法培养，和内加或不加支持物(如磁株、胶原、明胶和琼脂等有 型物）的摆瓶法或转瓶法培养。8. 根据权利要求7所述的神经干细胞的大规模制备方法，其特征在于：所述的摆瓶法 或转瓶法主要是使神经干细胞处于悬浮状态生长，加入胶原或明胶等有型物的浓度可为 〇%_1% ;摆瓶法的转速为55-65次/分钟。9. 根据权利要求8所述的神经干细胞的大规模制备方法，其特征在于：胶原浓度为 0. 01%，明胶的浓度为0. 005%。
【专利摘要】本发明涉及一种神经干细胞的大规模制备方法及其在细胞移植、干细胞培养、扩增、定向分化和神经系统疾病治疗领域的用途。本发明所述的神经干细胞，该干细胞是按以下步骤制备的：从幼年动物或胚胎脑组织中采用机械法、酶法和机械-酶法和密度梯度离心法，联合提取神经干细胞；体外大规模培养，扩增，经神经干细胞鉴定后冻存备用。本发明所述方法比常规方法制备神经干细胞效率提高约10-1000倍，可用于组织工程学研究、神经干细胞制剂或干细胞药物的生产。
【IPC分类】A61P25/16, A61K35/30, C12N5/0797, A61P25/00
【公开号】CN104928246
【申请号】CN201410105033
【发明人】邹清雁, 陈文明, 赖良学, 唐时幸, 兰丹, 钟慧霖, 丁先风, 刘海霞, 刘志成, 杜少茵
【申请人】广州赛吉生物科技有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2014年3月20日