实体瘤患者自体nk细胞分离、活化扩增及活性检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明技术主要涉及一种实体瘤患者自体外周血来源NK细胞体外分离培养、活 化扩增和细胞毒活性检测方法。
【背景技术】
[0002] 自然杀伤细胞（natural killer cell，NK)又称天然杀伤细胞，其抗病毒感染、抗 肿瘤无 MHC限制性，已作为临床细胞免疫治疗肿瘤的一个重要治疗手段。NK细胞作为机体 天然免疫细胞，主要通过直接杀伤肿瘤细胞和分泌细胞因子调节其他免疫细胞两种途径杀 死肿瘤细胞、病毒和清除非己细胞。Rosenberg等在应用IL-2活化的LAK细胞治疗肿瘤过 程中发现：其中以⑶3-0)16+细胞（natural killer cell，NK)为特征的细胞发挥抗肿瘤 的主要作用，NK细胞是主要的效应细胞。从此，研宄者们将肿瘤免疫细胞治疗的研宄重点 从LAK细胞转向NK细胞，将NK细胞作为肿瘤免疫治疗的一种重要手段。到目前为止，NK细 胞治疗肿瘤已经取得了很好的临床效果，尤其是在血液肿瘤方面。同种异体NK细胞在杀伤 血液病细胞的同时，可以促进造血干细胞植入、降低GVHD的发生以及增强移植物抗白血病 (GVL)效应。同种异体NK细胞已成为临床移植辅助治疗的一种重要手段。
[0003] NK细胞治疗过程主要包括三个步骤：采集分离、纯化、活化扩增。目前治疗血液肿 瘤所用到的NK细胞主要通过磁珠分选的方法，这种方法不适合自体NK细胞治疗实体瘤。主 要原因是：①治疗血液肿瘤一般选择健康的供者，可以提取到大量的细胞，不需要体外长时 间的培养扩增就已经能够达到治疗所需要的数量，可以直接将提取出的高纯度NK细胞经 过检测后静脉回输给患者，采集患者自体外周血中的NK细胞比例低，并且受到自身肿瘤细 胞的免疫耐受，分离以后需要经过长时间的刺激、培养、扩增的过程，达到一定数量和比例 才能给患者回输；②由于在磁珠分选的过程中细胞的活性受到影响，不适合在体外长时间 的培养。密度梯度离心法是利用细胞的物理特性一一血液中各种细胞的密度不同分离所需 要的细胞的方法，由于是物理的方法，对细胞的损伤比较小，不影响细胞活性。密度梯度离 心法分离过程中的试剂目前已经由临床级别的，这种方法分离外周血中NK细胞是一种适 合实体瘤患者自体NK细胞治疗的经济实用方法。
[0004] NK细胞纯化的方法主要包括物理方法和化学方法。物理方法有！Percoll不连续 密度梯度离心法、两步黏附法；化学方法有：去除单核细胞、绵羊红细胞花环法、磁珠分选 法、补体依赖的细胞毒法。活化和扩增过程主要是加入的不同刺激因子，通过这些刺激因子 促进NK细胞的快速增殖，而降低非NK细胞增殖速度。主要刺激因子有：丝裂原、细胞因子、 饲养细胞等。
[0005] Grzywacz等从脐带血提取造血干细胞，然后经过分化和诱导扩增得到大量NK细 胞，虽然脐带血的来源比较丰富，但存在伦理问题。Berg等使用IOOGy照射后的EB病毒转 化的B淋巴母样细胞（EBV-LCL)作为饲养细胞，与PBMC中分选的NK细胞共培养培养21d 后，可使NK细胞扩增（490±260)倍。Imai等使用照射过的K562-mbl5-41BBL细胞株作为 饲养细胞，3周后可使PBMCs中⑶3-⑶56+NK细胞扩增1000多倍。饲养细胞可提高NK细胞 扩增效率、纯度与杀伤活性均较高，但存在安全性问题。随着生物技术的发展，现在已较少 使用饲养细胞，更侧重于细胞因子的组合体外活化和扩增NK细胞。临床级磁珠分选仪随着 干细胞的研宄已经逐步进入了临床，其设备及其附属耗材价格昂贵。自体NK细胞首先经过 临床级磁珠分选仪纯化后，需要扩增和增殖，这将增加治疗成本，临床病人难以接受。目前 临床级磁珠分选仪在我国还没有得到相关部门的认证用于临床。
[0006] 已知许多细胞因子单独或组合能有效地诱导、刺激NK细胞增殖和促进其分化成 熟，如 IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、Flt-3L、SCF 等，其中 IL-2 和 IL-15 的作用尤为 明显。IL-2是一种具有多种生物学活性的细胞因子，主要由⑶4+T、⑶8+T细胞以及NK，LAK 细胞产生，在免疫应答网络中起重要作用。IL-2能刺激NK细胞增殖，并增强NK细胞杀伤功 能，是体外NK细胞扩增体系中最早也是最常用的细胞因子。
[0007] 目前，国内外很多文献和专利关于NK细胞分离提取和活化扩增的方法，但是存在 一些缺点，实际应用到临床上的并不多。①细胞数量：临床治疗需要的NK细胞数量大，而采 集50ml患者自体外周血中NK细胞的含量比较少；②细胞纯度：需要NK细胞纯度高，而外 周血中NK细胞约占淋巴细胞的5%~10% ;③细胞来源：目前治疗实体瘤NK细胞的主要来 源是有患者本人的外周血，治疗血液病的NK细胞可以来源于健康志愿者（患者的父母子女 或兄弟姐妹)。同种异体NK细胞治疗实体瘤还处于临床试验阶段；④添加因子：在培养的 过程中，不能加入动物源性和其它在细胞回输后对人体产生负作用的添加剂；⑤操作过程： 繁琐的操作步骤将增加污染的几率；⑥体外培养时间：免疫细胞在体外培养时间的长或短 决定了回输到体内免疫细胞的活性。如果培养时间太短，细胞还没有扩增到一定数量，如果 时间太长，细胞量虽然较多，但细胞表现为复制性衰老（replicative senescence)，绝大多 数细胞已经开始凋亡，不论是从细胞总数和活性还是从细胞比例都会有下降的趋势，而且 将这种状态的细胞回输到体内后，绝大多数细胞会死亡，这提示我们必须选择合适的培养 时间；⑦成本：如果培养过程中使用一些非常昂贵的试剂或仪器设备，超出了一般患者所 能够承受的经济范围。NK细胞的体外分离和高效扩增方案成为NK细胞临床治疗中需要迫 切解决的一个关键问题。
[0008] 按照我国相关规定，在过继免疫细胞临床应用前和应用过程中，应检测免疫细胞 的细胞毒作用。有报道指出，由于两种细胞混合在一起培养，互相之间有抑制对方生长的细 胞因子的分泌，在效应细胞杀伤肿瘤细胞的同时，肿瘤细胞对效应细胞也会有抑制生长和 促进凋亡的作用。目前常用检测凋亡的方法MTT法和LDH法只能从整体水平判断凋亡率， 而不能从单细胞水平检测免疫细胞的细胞毒作用，并且这些方法容易受到背景信号的干 扰，因此其检测结果广受质疑。51Cr释放实验一直被认为是检测NK细胞活性的标准方法， 但作为放射性核元素，51Cr的应用具有一定的限制性。TUNEL法能准确地反应细胞凋亡最典 型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度高，但只能标记中晚期凋亡 细胞，并受效应细胞和靶细胞自发死亡和非特异性杀伤的存在会造成很强的背景信号的影 响，而且方法操作繁琐。Annexin-V/PI流式细胞分析法是目前研宄免疫细胞细胞毒作用最 常用的流式方法，能检测早期凋亡细胞，与51Cr释放实验结果一致。这种方法适用于一种作 用因素(化疗药或其他非细胞物质)对一种靶细胞的作用研宄。检测免疫细胞对肿瘤细胞的 细胞毒作用时，两种细胞混合在一起，效应细胞和靶细胞同时都有凋亡，流式细胞仪分析时 无法区分效应细胞和靶细胞，结果中包括靶细胞和效应细胞共同的凋亡率。如果效应细胞 和靶细胞的体积相差比较大时，能通过FSC/SSC圈门将两种细胞区分开；当靶细胞和效应 细胞体积相当时，在所分析的靶细胞区域中混有效应细胞，最终得出的凋亡率将会受到效 应细胞的影响。
[0009] 荧光染料CFSE是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，具有很高的荧光活 性，被激发后能产生绿色荧光。近年来，CFSE作为一种安全、无放射性、无污染、细胞毒性小 的细胞标记物，应用于淋巴细胞亚群的增殖、抗原特异性效应与记忆淋巴细胞的体内分布 及其活化、增殖、分化，细胞毒性检测等方面。其特点主要包括：①能够轻易穿透细胞膜但自 身不发荧光，进入细胞后荧光不受内环境影响，对细胞生理活动没有任何影响；②可以随细 胞分裂平均到达两个子代细胞；③标记的荧光时间长达数周；④操作简单、经济实惠。
[0010] Annexin-V是一种分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋 亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是 完整的，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，当细胞发生凋亡 的早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS)由脂膜内侧翻向外侧，Annexin-V与磷脂酰丝氨酸有高度 亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。放线菌素 D (7-amino-actinomycin D，7-AAD)是一种广泛应用于细胞凋亡研宄的染料，其可与凋亡细 胞浆内的DNA结合。
【发明内容】
[0011] 本发明旨在克服现有的实体瘤患者自体NK细胞体外分离培养、活化扩增和细胞 毒活性检测方法的不足，对NK细胞采集分离、活化扩增和细胞毒活性检测等步骤进行改进 和优化。
[0012] 由于实体瘤患者自身免疫细胞的功能被破坏或抑制，体外经过分离培养获得的NK 细胞比例低、数量少，并且培养过程耗时长，培养所需试剂等刺激因子成本高和存在不安全 因素等缺点。本发明在传统方法基础上经过改进和优化，总结出一种分离培养操作步骤简 单，经济高效的方法，不仅避免了由于操作繁琐而发生污染，而且在培养过程中所需要的试 剂和耗材成本低，使用该方法培养出的NK细胞扩增倍数多、纯度高和活性好，此技术方法 适合应用于临床过继免疫细胞治疗肿瘤。
[0013] 同时建立一种了基于流式细胞染色检测技术，三种荧光染料CFSE/ Annexin-V/7-AAD联合标记，分析NK细胞的细胞毒活性。该方法避免放射性试剂，减少了 同位素的污染，操作简单，结果重复性好，敏感