专利名称：一种提高烟草烟叶钾含量的育种方法
技术领域：
本发明涉及一种提高烟草烟叶钾含量的育种方法。
背景技术：
根据大量资料统计，钾是烤烟吸收量和体内含量最高的营养元素，也是影响我国烤烟质量进一步提高的重要限制因素。而我国大多数植烟土壤不能提供充足的钾供给烤烟以满足优质烟叶生产的需求。因此，生产上需要投入大量的钾肥。连年大量施用 化肥，不但增加烟农的生产成本，而且加速土壤理化性质的恶化。遗憾的是我国优质烟叶平均钾含量依然较低，与国外优质烟叶相比至少还低20%以上(我国优质烟叶2%左右，国外优质烟叶大
2.5%)。影响烤烟体内钾含量的因素有许多，主要有土壤和气候；栽培措施；品种或基因型等。土壤和气候是自然形成的，人类较难改变。栽培措施提高烟叶钾含量，多年实践证明有一定的局限性，何况再增加钾肥用量也不可取。因此，选育高钾含量烤烟新品种将是解决烤烟钾含量的关键途径之一。然而常规育种存在远缘杂交不亲合、杂种性状不稳定、分离世代长等问题；体细胞杂交技术虽然在一定程度上克服了杂交不亲合现象，但存在再生频率低、变异后代群体小、体细胞无性系变异、遗传不稳定等问题；自Hess提出花粉粒可以吸收外源DNA的研究报道以后，总DNA导入技术在作物育种中得到广泛应用，它逾越了常规育种中的生殖障碍，弥补了细胞工程技术繁琐、植株再生频率低、后代群体小，难以筛选等缺陷，在目前烟草遗传背景尚不明了、优良基因来源有限、转基因研究仍受到贸易壁垒负面影响的形势下，不失为一条切实可行的品种改良的捷径。利用带有目的基因的供体植物DNA (包括远缘供体DNA)直接转化受体，筛选目的性状变异后代，培育农作物新品种的方法，是植物基因工程与分子生物技术在农业育种上的实际应用。花粉管通道法是利用植物开花受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精细胞。近年来，我国已通过此技术在棉花、大豆、水稻、小麦、烟草等多种作物上获得成功。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种花粉管通道法，将高钾植物商陆的总基因组DNA导入到烤烟品种红花大金元中，以期获得高钾含量烤烟的方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的，其步骤如下一种提高烟草烟叶钾含量的育种方法利用花粉管通道法将高钾植物商陆的总体DNA导入烟草品种红花大金元(从中国烟草中南试验站购买)中进行栽培，具体包括以下步骤(I)供体DNA的提取取0. 2g幼嫩烟草冰冻叶片入砚钵中一加入2XCTAB提取液700 u I研磨后转入I. 5ml离心管一于65°C保温20_30min —冷却后加入等体积的氯仿 异戍醇混勻IOmin — 10000r/min离心IOmin —取上清液至一新管一加入100 u I 5M NaCl和Iml冰冷乙醇沉淀DNA —挑出DNA沉淀，用70%乙醇洗净干燥一溶解于100 u ITE中；所述的2XCTAB 提取液配方为2%CTAB, I. 4M NaCl, IOOmM Tris-HCl, IOOmM EDTA，pH8. 0，2%P -巯基乙醇；所述的氯仿异戊醇的体积比为24 : I ;(2)导入方法选择生长健壮、主茎中上部已开放的花朵，将其花冠褪下，露出柱头，然后用左手拇指甲做砧板托住柱头，右手拿刀片沿与柱头成45°C角切除1/4 1/3柱头，最后将DNA提取液滴于柱头上，再将花冠戴上；导入时间从早晨6:00花初放开始，然后每一小时导入一次，至下午4:00花凋萎止。所述的提高烟草烟叶钾含量的育种方法中，将高钾植物商陆的总体DNA导入烟草品种后，再以烟草烟叶钾含量不低于2%的标准进行筛选。烟叶钾含量测定在烟株成熟期时，每个处理选取有代表性的植株6株整株收获， 洗净后在105°C下杀青30min，然后在80°C下烘干，粉碎过筛，将0. 45mm筛的样品0. Ig置于150mL三角瓶中，加5%乙酸IOOmL,塞上橡皮塞，在摇床或振荡器上振荡萃取30min，用定性滤纸过滤，弃去前几毫升滤液，收集后续滤液，最后用原子吸收光谱仪测定钾的浓度。本发明的积极效果是首次将烟草作为受体，将高钾植物商陆的总基因组DNA导入烤烟品种红花大金元中，获得了高钾含量烤烟；以满足优质烟叶生产的需求。应用花粉管通道导入外源植物总基因组DNA可以引起烟草受体的形状变异，通过筛选，可以得到各方面形状表现好的品种，而且由于是在自花受粉的基础上，部分DNA片段或目的基因进入受体基因组，避免了供体与受体基因的全面重组，因而易于稳定；同时，利用花粉管通道将植物总基因组DNA导入烟草的育种方法，操作简单方便，也是目前解决烟草远源杂交改良品种较有效的方法之一。
图I为荧光定量PCR法测定不同烟草高钾新品系和对照中相关高钾基因的mRNA转录水平。
具体实施例方式以下实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例I :本发明方法实施后烟草后代主要性状的表现按照以下方法进行DNA导入(I)供体DNA的提取取0. 2g幼嫩烟草冰冻叶片入砚钵中一加入2 X CTAB提取液700 u I研磨后转入I. 5ml离心管一于65°C保温20_30min —冷却后加入等体积的氯仿 异戍醇混勻IOmin — 10000r/min离心IOmin —取上清液至一新管一加入100 u 15M NaCl和Iml冰冷乙醇沉淀DNA —挑出DNA沉淀，用70%乙醇洗净干燥一溶解于100 u ITE中；所述的2XCTAB 提取液配方为2%CTAB, I. 4M NaCl，IOOmM Tris-HCl, IOOmM EDTA, pH8. 0，2%^ -巯基乙醇；所述的氯仿异戊醇的体积比为24 : I ;(2)导入方法选择生长健壮、主茎中上部已开放的花朵，将其花冠褪下，露出柱头，然后用左手拇指甲做砧板托住柱头，右手拿刀片沿与柱头成45°C角切除1/4 1/3柱头，最后将DNA提取液滴于柱头上，再将花冠戴上；导入时间从早晨6:00花初放开始，然后每一小时导入一次，至下午4:00花凋萎止。
I.烟草后代主要农艺性状的表现以商陆为供体，烤烟品种红花大金元为受体，配制导入组合，每个组合处理20朵花，成熟后获％1082粒(Dtl为导入当代种子)。2000年种植Dtl,共212株发育成正常植株。成熟期(移栽后65d)分别取中部叶测定烟叶钾含量，结果见表I。从表I中可知，供体植物商陆的总基因组DNA导入烤烟后，烟叶钾含量产生了较大变幅。15%的烟株烟叶钾含量高于2. 5%，其中有I株烟叶钾含量高达5. 06%。可见，外源DNA导入处理，显著改变了受体烟叶钾含量，证明导入的有效性。表I Dtl代烟叶含钾量(中部叶)
烟叶钾含fi (%) <2,0 2.0 2. 5 2. 5 3. 5 3. 5 4. 5 4. 5 5. 0 >5,0 株数(株)1285215124I
出现频率ObO0.250.070 Uh0.020.005收获时，烟叶钾含量高于2. 5%的烟株单收单脱，获D1代种子，经过连续九年种植，以烟叶钾含量高于2. 5%为主要选择压力，同时考虑株型和抗病性，将选出的D9代的三个株系进行主要性状考查，结果见表2。由表2可知，导入后的D9代株系的主要农艺性状与受体(红花大金元)相比，株高、叶数、节距和生育期均无多大变化。而在叶面积(长X宽)、茎围和产量三个性状方面，不同的品系表现不一样。D9-05和D9-06的叶面积最大,和受体相比达到极显著水平差异；09-05和09-12的产量最高，和受体相比达到显著水平差异；在茎围方面，与受:体相比，D9-06和D9_12两个品系达到极显著水平差异。表2 D9代主要农艺性状基本调查表
株高叶数长X宽茎围节距屯存期卜叶甫产量
品种/糸
tcm) (片)(CnT)(cm) (cm) (d)(g)Ckg/hm")
D9-OS199.5 27 1753.3* 11.8* 6.3 124 104.8 2729.8**
D9-06214.8 29 1762.8* 12.2** 6.0 128 115.5* 2622. 7
D9-12215,7 30 1698.8 12.6** 6.8* 128 118.2* 2724,9**
受体(红花大
一195. I 27 1728. 5 9.4 5.8 122 112.8 2628.5*
金元)注*表示在LSRatl5水平有显著差异，**表示在LSRatll水平有显著差异。2.烟草后代烟叶钾含量的表现烟叶含钾量的高低作为质量评价的重要指标之一。试验结果表明，新品系的烟叶含钾量均比对照(红花大金元)较大的提高(表3);与对照相比，以D9-05和D9-06的增幅最大，其中D9-05的中部叶含钾量平均数超过I. 9%，总和超过5. 7% ；D9-06的下部叶含钾量平均数超过2. 17%，总和超过6. 51%。表3三个新品系烟叶含钾量与对照比较的差异显著性n ^IT钾含量平均数比较总和的比较
m系(或m种) 部位 -v-mr n tn -v-mr _平均数_-MM__走数
上部叶2.350.50*7.051.50*
D9-05中部叶3.981.90**11.945. 70**
下部叶3.891.64*11.674.92**
上部叶2.820.97"8.462.91"
D Db屮部叶3.611.53w10.834.59**
F部叶4. 422. 17*13.266.51*
上部叶2.560.7Im'7.682. 13"
D9-12中部叶3.471.39**10.41-I. 17**
下部叶3.531.28**10.593.84**
紅介+人一上部叶1.855.55
ilHf7c 中部叶2.086.24
下部叶2.256. 75注*表示在LSRatl5水平有显著差异广表示在LSRatll水平有显著差异。多重比较时，相同部位进行比较。实施例2 :本发明方法实施后烟草后代烟叶质量的表现I.烟叶外观质量表现烟叶外观质量评价结果表明(表4):红花大金元与D9_05和D9_12品系在成熟度上表现基本一致，而D9-06品系成熟较晚；油分最多的是红花大金元，其次是09-06品系；红花大金元与D9-05、D9-06和D9-12结构大部分均为疏松；D9-05、D9-06和D9_12在饱满度、均匀度、色泽上均好于K327。这说明，新品系在烟叶外观质量上，稍好于对照红花大金元，但差异不显著。表4不同品系的烟叶外观质量评价比较
均匀度
品种(系)部位成熟度组织结构油分饱满度Uniformit 色泽 Variety Position Maturity Structure Oil Plumpness yChorma
B成熟稍密稍有-有 CBC
D9-05C成熟疏松有-稍有 BBB
X 成-尚熟疏松稍有-有 CCC B 成-尚熟稍密有-稍有 CBBD UhC 成-尚熟疏松稍有-有 CCB
X 成-尚熟疏松稍有 CBB B 成-尚熟稍密稍有-有 BBB D -1) C 成熟疏松有-稍有 CBC X 成熟疏松稍有-有 BCC 红花大金 B 成熟疏松稍有 C C B 元 C 成熟疏松有-稍有 BCB __X 成-尚熟尚疏松有__B__C__B注部位中的B、C、X分别代表上部烟叶、中部烟叶和下部烟叶(下同)。
2.烟叶化学成分表现分别取不同品系和红花大金元叶片，烘烤后烟叶混合烟样进行化学成分的常规分析(表5):①在下部叶片中，09-06和09-12品系的总糖含量稍低于对照红花大金元而D9-05品系稍闻于对照红花大金兀，但均未达到显著水平；D9_05、D9-06和D9_12新品系的还原糖均高于对照红花大金元而总氮和烟碱稍低于对照红花大金元，但均未达到显著水平；还原糖/烟碱、K2O和Cl—上均高于对照红花大金元而在K2o/cr上均低于对照红花大金元。②在中部叶片中，新品系的总糖、还原糖、还原糖/烟喊、K2O和K20/C1均闻于对照红花大金元，其中在总糖上与对照的差异不显著、在还原糖上与对照的差异达显著水平、在还原糖/烟碱上与对照的差异除与D9-12品系差异不显著外同09-05和09-06品系呈显著水平、在K2O上除与BD9-06品系差异达显者水平外同D9-12和D9-05品系差异不显者、在K2O/Cl上同D9-12、D9-05和D9-06品系达极显著水平；总氮和Cr均低于对照红花大金元，对照与D9-06品系差异达显著水平而与D9-12和D9-05品系差异不显著；只有D9-12品系的烟碱高于对照红花大金元，D9-05和D9-06品系的烟碱低于对照红花大金元且对照与D9-06品系达到了显著水平；③在上部叶片中，新品系的总糖、还原糖和Cr均低于对照红花大金元，其中对照在总糖上除与d9-12品系差异不显著外同d9-05和D9-Oe品系呈显著水平、在还原糖上差异均 不显著而在Cr上差异均达极显著水平；在K2O和K2o/cr上均高于对照红花大金元，其中对照与D9_06品系差异均不显著而与D9_12和D9_05品系差异均达显著水平；D9_05和D9_06品系的总氮和烟碱均高于对照红花大金元且差异达极显著水平，而D9-12品系的低于对照红花大金元且差异不显著水平；D9-12品系的还原糖/烟碱高于对照红花大金元且差异不显著，而D9-05和D9-06品系的低于对照红花大金元且差异达显著水平。表5不同品系主要化学成分比较
权利要求
1.一种提高烟草烟叶钾含量的育种方法，其特征在于，利用花粉管通道法将高钾植物商陆的总体DNA导入烟草品种红花大金元中进行栽培，具体包括以下步骤 (1)供体DNA的提取取0.2g幼嫩烟草冰冻叶片入砚钵中一加入2XCTAB提取液700 u I研磨后转入I. 5ml离心管一于65°C保温20_30min —冷却后加入等体积的氯仿 异戍醇混勻IOmin — 10000r/min离心IOmin —取上清液至一新管一加入100 u I 5M NaCl和Iml冰冷乙醇沉淀DNA —挑出DNA沉淀，用70%乙醇洗净干燥一溶解于100 u ITE中；所述的 2X CTAB 提取液配方为2%CTAB, I. 4M NaCl，IOOmM Tris-HCl，IOOmM EDTA, pH8. 0，2% ^ -巯基乙醇；所述的氯仿异戊醇的体积比为24 : I ; (2)导入方法选择生长健壮、主茎中上部已开放的花朵，将其花冠褪下，露出柱头，然后用左手拇指甲做砧板托住柱头，右手拿刀片沿与柱头成45°C角切除1/4 1/3柱头，最后将DNA提取液滴于柱头上，再将花冠戴上；导入时间从早晨6:00花初放开始，然后每一小时导入一次，至下午4:00花凋萎止。
2.根据权利要求I所述的提高烟草烟叶钾含量的育种方法，其特征在于，将高钾植物商陆的总体DNA导入烟草品种后，再以烟草烟叶钾含量不低于2. 5%的标准进行筛选。
全文摘要
本发明是一种提高烟草烟叶钾含量的育种方法。利用花粉管通道法将高钾植物商陆的总体DNA导入栽培烟草品种红花大金元中，引起其后代烟叶钾含量大幅度提高，为烟草新品种的选育、改良和种质资源的创新提供了丰富的变异来源。
文档编号C12N15/87GK102787139SQ20121025605
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者夏凯, 徐双红, 戴林建, 朱列书, 王翔, 符建国, 钟军 申请人:湖南农业大学