专利名称：三种细菌的pcr检测引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及PCR引物，具体地，涉及三种细菌的PCR检测引物。
背景技术：
多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一 PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性 引物，进行PCR扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染，可系统组合的有①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠；有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠；有时是乙丙型肝炎病毒重叠。②肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍舌L有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病。③性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断。④战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检。⑤需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等。多重PCR的特点有①高效性，在同一 PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检。③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。在多重PCR反应体系中，引物之间的相互作用严重影响着多重PCR的结果，故在多重PCR建立之初需要明确引物之间存在怎样的相互影响。除引物之间的相互影响外，引物的浓度对多重PCR的稳定性和灵敏度也有重要影响。目前国内还未出现针对脂环酸芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌的多重PCR检测引物及检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种针对脂环酸芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌同时进行检测的多重PCR检测引物，本发明建立的多重PCR检测方法的最大优势就是实现了 “一管三检”，不仅提高了检测效率，还降低了检测过程中因操作导致的误差。本发明提供了如下的技术方案
三种细菌的PCR检测引物，其中，三种细菌为脂环酸芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌，包括以下3对引物
脂环酸芽孢杆菌的检测引物
上游引物 SEQ ID NO. I :5’-AAAACGGCAAGAAAAAGCAG-3’
下游引物 SEQ ID NO. 2 :5’ -ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG-3’大肠埃希氏菌的检测引物
上游引物 SEQ ID NO. 3 :5’ -AAAACGGCAAGAAAAAGCAG-3’
下游引物 SEQ ID NO. 4 :5’-ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG-3’
沙门氏菌的检测引物
上游引物 SEQ ID NO. 5 :5’ -TACTTAACAGTGCTCGITTAC-3’
下游引物 SEQ ID NO. 6 :5’ -ATAAACTTCATCGCACCGTCA-3’
三种细菌的PCR检测弓I物在脂环酸芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌PCR检测中的应用。本发明具有以下有益效果
本研究尝试用多重PCR检测脂环酸芽孢杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌。由于没有果汁中细菌多重PCR检测方法的相关报道，故与常规方法比较后发现，本研究建立的三重PCR检测方法有相同的灵敏度，并能实现一个反应检测3种污染菌，大大提高了检测效率。在人工模拟试验中，建立的三重PCR检测方法能够在小于100个菌体每毫升的染菌量下扩增出特异性条带，说明该检测方法符合实际检测要求。另外，当前用于果汁污染菌检测的PCR技术由于受到不能区分病原菌的死活而在实际应用中受到限制，而本试验对样品先进行预增菌，再取增菌液进行检测，检测的是活的菌体。这虽然较直接从样品中提取基因组进行检测多耗费时间，但增菌过程在大大的提高了多重PCR检测敏感性的同时，还避免了果汁中其他成分对DNA提取的影响以及DNA污染所带来的假阳性结果。本试验建立的三重PCR检测试剂盒，通过实验表明其有良好的特异性、敏感性和稳定性，能够满足果汁生产过程和日常卫生监测的需要。相比常规方法而言，该试剂盒的检测在保证准确性的前提下，将7个工作日的检测时间缩减为I昼夜，大大提高了检测效率。PCR本身的检测成本较常规方法低，故在经济上也存在优势。相比单重PCR，本研究建立的多重PCR检测方法的最大优势就是实现了“一管三检”，不仅提高了检测效率，还降低了检测过程中因操作导致的误差。另外，由于试剂盒内的试剂为预混装，在简化了操作步骤的同时，也减少了操作失误和外界污染的概率。随着PCR方法的不断改进和优化，多重PCR检测试剂盒也将广泛应用于各种临床检测和生产质控。
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中
图I是不同退火温度对大肠埃希氏菌PCR扩增的影响的电泳 图2是不同退火温度对脂环酸芽孢杆菌PCR扩增的电泳 图3是不同退火温度对沙门氏菌PCR扩增的影响的电泳 图4是引物浓度对脂环酸芽孢杆菌PCR的影响的电泳 图5是引物浓度对大肠埃希氏菌PCR的影响的电泳 图6是引物浓度对沙门氏菌PCR的影响的电泳 图7是两种多重PCR检测的敏感性的电泳 图8是在不同浓度的重组质粒条件下三重PCR的电泳 图9是针对沙门氏菌、脂环酸芽孢杆菌和大肠埃希氏菌的三重PCR检测试剂盒的稳定性检测电泳图。在附图中，给出以下附图标记
图I中，M 2000bp DNA分子质量标准(从上往下依次为2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ) ; I 8 依次为退火温度 60 V、59°C、58 V、57°C、56 V、55°C、54°C和 53°C 下的大肠埃希氏菌PCR产物(147bp)；图2中，M 2000bp DNA分子质量标准(从上往下依次为2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ) ; I 8 依次为退火温度 530C、54°C、55°C、56°C、57°C、58 V、59 V和 60 V 下的脂环酸芽孢杆菌PCR产物(298bp )；
图3中，M 2000bp DNA分子质量标准(从上往下依次为2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ) ; I 8 依次为退火温度 530C、54°C、55°C、56°C、57°C、58 °C、59 V和 60 V 下的沙门氏菌PCR产物(570bp)；
图4中，M 2000bp DNA分子质量标准(从上往下依次为2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp) ;1 8 :引物浓度为 I. 0 u M,0. 5 u M,0. 25uM,0. 125uM,62. 5nM、31. 25nM、15. 625nM和I. 8125nM下的脂环酸芽孢杆菌PCR产物(298bp)；
图5中，M 2000bp DNA分子质量标准(从上往下依次为2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp) ;1 8 :引物浓度为 I. 0 u M,0. 5 u M,0. 25uM,0. 125uM,62. 5nM、31. 25nM、15. 625nM和7. 8125nM下的大肠埃希氏菌PCR产物(147bp)；
图6中，M 2000bp DNA分子质量标准(从上往下依次为2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp) ;1 8 :引物浓度为 I. 0 u M,0. 5 u M,0. 25uM,0. 125uM,62. 5nM、31. 25nM、15. 625nM和7. 8125nM下的沙门氏菌PCR产物(570bp)；
图 7 中，M:2000bp DNA 分子标准(从上往下依次为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp);7 为阴性对照；1 6 依次为 107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL浓度下沙门氏菌、脂环酸芽孢杆菌和大肠埃希氏菌混合模板的三重PCR产物；
图 8 中，M 2000bp DNA 分子标准(从上往下依次为 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、100bp) ；8 和 9 为阴性对照;1 7 依次为 2X 105、2X 104、2X 103、200、100、50、5 个/UL质粒浓度下沙门氏菌、脂环酸芽孢杆菌和大肠埃希氏菌混合模板的三重PCR产物；
图 9 中，M:2000bp DNA 分子标准(从上往下依次为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp);l :保存30d后试剂盒的PCR产物(从上往下依次为570bp、298bp和147bp);
2:保存90d后试剂盒的PCR产物(从上往下依次为570bp、298bp和147bp) ；3 :保存:180d后试剂盒的PCR产物(从上往下依次为570bp、298bp和147bp)。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。试验材料 菌种
本试验所用的肠炎沙门氏菌(本专利中简称为沙门氏菌，保藏编号和大肠埃希氏菌(保藏编号-ATCC25922)均购自美国模式培养物集存库(ATCC)。脂环酸芽孢杆菌(保藏编号购自德国菌种保藏中心(DSM)。其他菌株棒状杆菌、单核细胞增生李斯特氏杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏杆菌、绿脓杆菌、鼠疫耶尔森氏菌和多杀性巴氏杆菌等13种菌均购自中国兽医药品监察所。试剂
Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTP、10XPCR Buffer均购自北京天根生化科技公司；琼脂糖购自Solarbio公司；DL_2000和500Marker购自TaKaRa (大连)公司产品。待检样品
(I)送检样品来自生产过程中的浓缩果汁样品6份、鲜榨果汁·10份、商品果汁18份和过期的果汁样品16份。(2)人工污染样品采用双盲方式人工将大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、脂环酸芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌分别污染已除菌的果汁中备用。通过相关文献证明大肠埃希氏菌的WW基因、沙门氏菌的基因和脂环酸芽孢杆菌的WsrRNA基因均为高度保守基因，因此根据GenBank中提交的基因序列，参照已发表的针对3种菌的单PCR检测引物，应用多重PCR特异性引物设计系统
5.O引物设计软件，设计和修饰得到3对特异性引物(表I)。
权利要求
1.三种细菌的PCR检测引物，其中，三种细菌为脂环酸芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌，其特征在于，包括以下3对引物 脂环酸芽孢杆菌的检测引物 上游引物 SEQ ID NO. I :5’-AAAACGGCAAGAAAAAGCAG-3’ 下游引物 SEQ ID NO. 2 :5’-ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG-3’ 大肠埃希氏菌的检测引物 上游引物 SEQ ID NO. 3 :5’ -AAAACGGCAAGAAAAAGCAG-3’ 下游引物 SEQ ID NO. 4 :5’ -ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG-3’ 沙门氏菌的检测引物 上游引物 SEQ ID NO. 5 :5’-TACTTAACAGTGCTCGITTAC-3’ 下游引物 SEQ ID NO. 6 :5’ -ATAAACTTCATCGCACCGTCA-3’。
2.权利要求I所述的三种细菌的PCR检测引物在脂环酸芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌PCR检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了三种细菌的PCR检测引物，三种细菌为脂环酸芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌，其中，脂环酸芽孢杆菌的检测引物为上游引物SEQIDNO.1，下游引物SEQIDNO.2；大肠埃希氏菌的检测引物为上游引物SEQIDNO.3，下游引物SEQIDNO.4；沙门氏菌的检测引物为上游引物SEQIDNO.5，下游引物SEQIDNO.6。本发明建立的多重PCR检测方法的最大优势就是实现了“一管三检”，不仅提高了检测效率，还降低了检测过程中因操作导致的误差。
文档编号C12N15/11GK102747162SQ20121025533
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者刘磊, 张亮, 郭玉蓉 申请人:甘肃农业大学