专利名称：β－内酰胺抗生素的制备方法
技术领域：
本发明涉及突变青霉素酰基转移酶和β-内酰胺抗生素的制备方法，其中β-内酰胺核在突变青霉素酰基转移酶存在下借助活化侧链被酰化。
青霉素酰基转移酶是一组源自微生物，例如细菌，的水解酶，它们能可逆水解青霉素的6-酰基基团或头孢菌素的7-酰基基团以形成相应的自由氨基而不破坏青霉素或头孢菌素的环结构。反应图I图示一个水解反应。青霉素化合物中R侧链的几个例子有苯乙酰基和苯氧乙酰基。
反应图I青霉素酰基转移酶的称呼不一，例如有青霉素酰胺酶或苄基青霉素水解酶(酶分类E.C.3.5.1.11)。
术语β-内酰胺抗生素包括所有如化学式II或III所示包含稠环系统的抗生素，其中X＝S或O。最为人们熟知的β-内酰胺抗生素是青霉素和头孢菌素。
在本申请上下文中，将青霉素定义为化学式(II)的化合物，将头孢菌素定义为化学式(III)的化合物。
其中X＝S，O，C，S(O)，或SO2，R1＝侧链，例如苯乙酰基、苯氧乙酰基、羟基苯基甘氨酰基、苯基甘氨酰基、二氢苯基甘氨酰基及其衍生物以及乙酰基、己二酰基、戊二酰基及其衍生物，R2，R3＝Cl、脂肪族或芳香基团，可选地带有一或多个O、S或N原子，R4＝OH、脂肪或芳香醇及其衍生物，可选地带有一或多个O、S或N原子。
本发明上下文中的侧链可以包括任何可结合到β-内酰胺核6-penam或7-cephem位从而形成具抗生素活性化合物的适宜化合物。
R2或R3中的脂肪族基团优选包含1～4个原子，且优选为甲基基团。
借助青霉素酰基转移酶和活化的侧链，通过例如酰化化学式(IV)所示6-氨基青霉烷酸(6-APA)或其衍生物的6-氨基基团、或者化学式(V)所示7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)或其衍生物的7-氨基基团来制备青霉素或头孢菌素。借助青霉素酰基转移酶还可以酰化7-氨基头孢烷酸(7-ACA)核。依照化学式(IV)或(V)化合物的衍生物理解为分别依照化学式(IV)或(V)的化合物，其中X、R2、R3和R4分别具有化学式(II)和(III)中所示的含义。
其中X＝SR2＝CH3R3＝CH3R4＝OH青霉素酰基转移酶的分类既可根据它们的分子结构也可根据它们的底物特异性进行。存在I、II和III型酰基转移酶。II型酰基转移酶由具有α-亚单位(小)和β-亚单位(大)的杂二聚体构成。IIa型，即所谓的青霉素G酰基转移酶，对带有疏水侧链，例如青霉素G的侧链苯乙酰基的底物有活性。例如短烷基链也能被IIa型酰基转移酶识别。然而，IIa型酰基转移酶对具有带电荷侧链的底物没有活性。具有带电荷侧链的底物适合于IIb型酰基转移酶。所有的II型酰基转移酶属于一个家族。已知II型酰基转移酶在氨基酸序列上显示出高同源性。
在本申请中，青霉素酰基转移酶被理解为II型酰基转移酶。在一种优选实施方式中本发明涉及IIa型青霉素酰基转移酶。
突变青霉素酰基转移酶或青霉素酰基转移酶突变体被理解为一种在野生型青霉素酰基转移酶氨基酸序列中至少一个位置的氨基酸被另一氨基酸置换的青霉素酰基转移酶。
突变体依据野生型氨基酸序列中被置换氨基酸的位置序数来描述。该数字前给出野生型中这一位置出现的氨基酸，该数字后给出突变体中置换它的氨基酸。
SEQ ID No1示出大肠杆菌(E coli.)青霉素酰基转移酶的氨基酸序列，其中包括分泌信号。SEQ ID No2示出大肠杆菌青霉素酰基转移酶α-亚单位的氨基酸序列。SEQ ID No3示出大肠杆菌青霉素酰基转移酶β-亚单位的氨基酸序列。SEQ ID No4中给出了大肠杆菌酰基转移酶在145位突变的α-亚单位(α-R145L)的氨基酸序列。
许多涉及突变青霉素酰基转移酶的出版物是已知的。WO98/20120中，给出了例如以下出版物作为参考Prieto等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.33(1990)553-559，其中描述了用L-丙氨酸(M168A)、L-缬氨酸(M168V)、L-天冬酰胺(M168N)或L-酪氨酸(M168Y)置换K.citrophila青霉素酰基转移酶168位的L-甲硫氨酸会影响青霉素G和青霉素V的脱酰作用动力学参数，而分别用赖氨酸(N375K)和组氨酸(Y481H)置换Asn375或Tyr481则没有影响。在J.Martin和I.Prieto，Biochimica et Biophysica Acta 1037(1990)133-139中描述了一个Met168被丙氨酸(M168A)置换的突变体。这导致热稳定性提高。用甘氨酸(S177G)、苏氨酸(S177T)、亮氨酸(S177L)、或精氨酸(S177R)取代大肠杆菌青霉素酰基转移酶Ser177产生失活的酶(Wang Min等人，Shiyan Shengwu Xuebao 24(1991)1，51)，然而根据Kyeong Sook等人，Journal of Bacteriology 174(1992)6270和Slade等人，Eur.J.Biochem.197，(1991)75，Ser290是大肠杆菌青霉素酰基转移酶中的一个重要氨基酸。用天冬氨酸(G359D)置换Gly359产生不能水解青霉素G但能水解邻苯二酰-亮氨酸和邻苯二酰-甘氨酰-L-脯氨酸的突变酶。用精氨酸置换Trp431(W431R；GabrielDel Rio等人，Biotechnology and Bioengineering 48(1995)141-148)产生在碱性环境中稳定性提高的突变大肠杆菌青霉素G酰基转移酶。
最近的一份出版物是W.B.L.Alkema等人，Protein Engineering，13，(2000)857～863，其中鉴定了大肠杆菌青霉素酰基转移酶的结合位点，并进一步描述道，146位为酪氨酸的突变体(F146Y)不能由苯乙酰胺和6-氨基青霉烷酸合成青霉素G，而该位置为亮氨酸(F146L)或丙氨酸(F146A)的突变体却能比野生型更有效的合成青霉素G。
其中描述了许多青霉素酰基转移酶突变体的专利有欧洲专利申请EP-A-0453048和国际专利申请WO 96/05318。
对于一种具有经济吸引力的酶制备β-内酰胺抗生素方法来说，理想的是合成/水解比率(S/H比率)要高。优选S/H比率高，且同时酶活性也足够高。
合成/水解比率(S/H比率)理解为在所定义条件下酶促酰化反应的合成产物与水解产物的摩尔比率。合成产物理解为由活化侧链和β-内酰胺核形成的β-内酰胺抗生素。水解产物理解为相应于活化侧链的酸。
在本发明上下文中，酶活性定义为根据溶解或固定化酶的量在所定义条件下酶促酰化反应的容积产率(volumetric productivity)。优选酶以固定化形式使用，且酶活性以固定化酶量定义。
酰化反应的容积产率可以表达为，在所定义条件下反应过程中单位体积和单位时间内酰化反应形成的β-内酰胺抗生素的摩尔量。
除其它因素外，S/H比率是反应物浓度、温度、pH和酶的函数。因此指示在何种条件下测定S/H比率是很重要的。
根据国际专利申请WO 98/20120已知一种借助青霉素酰基转移酶突变体从β-内酰胺核和活化侧链经酶法制备β-内酰胺抗生素的方法。该出版物公开了β-内酰胺抗生素可以经酶促酰化反应制备，该反应中β-内酰胺核和活化侧链在青霉素G酰基转移酶存在下相互接触。侧链与核偶联形成β-内酰胺抗生素。活化侧链通常为侧链的酰胺或酯类。
国际专利申请WO 98/20120公开了，酶活性和酰化反应的选择性可通过在青霉素G酰基转移酶上的一或多个氨基酸位置制造突变来改变。特别地，好的青霉素G酰基转移酶由α-亚单位氨基酸第142和146位以及β-亚单位氨基酸第24、56或177位的突变产生。尤其是β24位的突变体(其24位的初始L-苯丙氨酸被L-丙氨酸(F24A)置换)在青霉素和头孢菌素的合成中借助酯类形式的活化的侧链似乎产生显著更高的产量。
我们发现，如果酰胺与F24A突变体组合使用则S/H比率相对较高，但是酶活性很低以至于使用该突变体不具有经济上的吸引力。
我们发现，以酰胺作为活化侧链是吸引人的，因为酰胺比酯类在化学上更加稳定。更强的化学稳定性意味着，对酰胺来说，其活化侧链的水解形成相应的酸和/或侧链的化学外消旋化显著低于酯类。例如，在相同的温度和pH下，苯基甘氨酰胺比苯基甘氨酸甲酯稳定大约一千倍。
因此本发明的目的是提供一种突变的青霉素酰基转移酶，当其被用于从β-内酰胺核和作为活化侧链的酰胺经酶法制备β-内酰胺抗生素的方法中时，会产生相对较高的S/H比率和相对较高的活性。
令人惊奇的是，在一种β-内酰胺抗生素制备方法中已经发现较高的S/H比率，根据该方法β-内酰胺核在青霉素酰基转移酶存在下借助活化侧链被酰化，作为一种突变青霉素酰基转移酶，该酰基转移酶在与大肠杆菌青霉素酰基转移酶α-亚单位位置145相应的位置上具有至少一个氨基酸置换。特别地，在所述方法中高的S/H比率是在一种突变青霉素酰基转移酶的存在下得到的，该突变青霉素酰基转移酶中所述145位的L-精氨酸被L-亮氨酸(R145L)、L-赖氨酸(R145K)或L-半胱氨酸(R145C)取代。
已知，一种青霉素酰基转移酶中与另一野生型青霉素酰基转移酶的特定位置相应的位置可通过，例如，比对氨基酸序列而发现。例如国际专利申请WO96/05318描述了如何比对青霉素酰基转移酶氨基酸序列，并示出了源自大肠杆菌(E coli.)、粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)、嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌(Kluyvera citrophila)、粘节杆菌(Arthrobacter viscosis)和P.rettgeri的青霉素酰基转移酶氨基酸序列。例如指出了大肠杆菌中的哪个氨基酸位置与粪产碱菌中的氨基酸位置相对应(参见WO96/05318附图2)。
当R145L、R145K和R145C突变体被用于从β-内酰胺核和作为活化侧链的酰胺经酶法制备β-内酰胺抗生素的方法中时，它们产生的初始S/H比率至少是使用野生型大肠杆菌青霉素G酰基转移酶所得初始S/H比率的两倍，并且其酶活性大于野生型大肠杆菌青霉素G酰基转移酶活性的1％。本发明还涉及突变的青霉素酰基转移酶，当其被用于从β-内酰胺核和作为活化侧链的酰胺借助突变青霉素酰基转移酶经酶法制备β-内酰胺抗生素的方法中时，它产生的初始S/H比率至少是在相同反应条件下使用野生型大肠杆菌青霉素G酰基转移酶所得初始S/H比率的两倍，并且其酶活性大于相同反应条件下野生型大肠杆菌青霉素G酰基转移酶活性的1％。优选地，根据本发明的突变青霉素酰基转移酶是大肠杆菌青霉素酰基转移酶。
本发明还涉及一种借助本发明的突变青霉素酰基转移酶从β-内酰胺核和活化侧链经酶法制备β-内酰胺抗生素的方法。
在一种优选实施方式中本发明涉及一种制备β-内酰胺抗生素的方法，根据该方法，在根据本发明的青霉素酰基转移酶存在下β-内酰胺核借助酰胺形式的活化侧链被酰化。
在一种优选实施方式中青霉素酰基转移酶是这样一种酰基转移酶，当它被用于一种借助突变酰基转移酶从β-内酰胺核和作为活化侧链的酰胺经酶法制备β-内酰胺抗生素的方法中时，它产生的初始S/H比率至少比使用野生型大肠杆菌青霉素G酰基转移酶所得初始S/H比率高出3倍，优选4倍。
酶活性相对于野生型大肠杆菌青霉素G酰基转移酶活性优选至少为2％，更优选至少5％。
国际专利申请WO96/05318提到了与提高的从D-苯基甘氨酰胺和6-氨基青霉烷酸合成氨苄青霉素的S/H比率有关的青霉素酰基转移酶突变体αM143V、βL56G和βL177S。然而，其中所引证的S/H比率不是野生型大肠杆菌青霉素酰基转移酶的两倍，而是显著低于2倍。
酰化反应中达到的转化率可根据所使用反应物的摩尔量表达为在反应中的特定时刻酰化反应形成的β-内酰胺抗生素的摩尔量，此处反应物可为β-内酰胺核或(活化)侧链。在本发明上下文中，将转化率定义为酰化反应中形成的β-内酰胺抗生素量(以摩尔计)除以所使用的β-内酰胺核量(以摩尔计)。
在酶促酰化反应过程中，S/H比率通常会降低。通常转化率先升高后降低。除其他因素外，S/H比率是转化率的函数。优选在相同转化率处比较不同青霉素酰基转移酶的S/H比率。最常见的是在0％转化率处对其进行比较，即所谓的初始S/H比率，它也因此是S/H比率的一个度量标准。初始S/H比率理解为0％转化率处的S/H比率，因而是在时间t＝0时。进行酰化反应，当转化率达到高至至少30％、优选至少50％时绘制S/H比率对转化率的图表，并外推至转化率为0％的S/H比率，这样可以非常准确地测定初始S/H比率。用外推法测定初始S/H比率是理想的，因为它提高初始S/H比率测定的准确性。要进行准确测定的话，理想的是得到足够多的数据点，例如，至少三个数据点，优选这些数据点代表相差至少5％的转化率且优选这些测定点处的转化率都不低于10％。
在酶促酰化反应过程中，容积产率和酶生产力通常随时间降低。容积产率和酶活性是转化率的函数。优选在相同转化率处比较不同青霉素酰基转移酶的酶活性。最常见的是在0％转化率处对其进行比较，即所谓的初始酶活性，它也因此是酶活性的一个度量标准。初始酶活性理解为0％转化率处的酶活性，因而是在时间t＝0时。当转化率达到高至至少30％、优选至少50％时绘制酶活性对转化率的图表，并外推至转化率为0％的酶活性，这样可以非常准确地测定初始酶活性。用外推法测定初始酶活性是理想的，因为它提高初始酶活性测定的准确性。要进行准确测定的话，理想的是得到足够多的数据点，例如，至少三个数据点，优选这些数据点代表相差至少2％的转化率且优选这些测定点处的转化率都不低于1％。
用突变或未突变青霉素酰基转移酶完成酰化反应的适宜反应条件是本领域技术人员公知的。
活化侧链与β-内酰胺核的摩尔比率，即以摩尔表示的所添加活化侧链总量除以以摩尔表示的所添加β-内酰胺核总量，可以在很宽范围内变化。优选该摩尔比率介于0.5和2.0之间，特别是介于0.7和1.8之间。
实施酰化反应的温度通常低于40℃，优选介于-5℃和35℃之间。实施酰化反应的pH通常介于5.5和9.5之间，优选介于6.0和9.0之间。
优选在差不多达到最大转化率时反应几乎完全终止。终止反应的一种适宜实施方式是降低pH至，优选介于4.0和6.3、特别是介于4.5和5.7之间的值。另一种适宜的实施方式是在达到最大转化率时立即降低反应混合物温度。也可以结合这两种实施方式。
在本发明上下文中，可通过例如加入酸来降低pH。适宜的酸有例如矿物酸，特别是硫酸，盐酸溶液或硝酸和羧酸，例如，醋酸、草酸、柠檬酸。要提高pH可以加入例如碱。适宜的碱有例如无机碱，特别是氨、氢氧化钾或氢氧化钠溶液，和有机碱，例如三乙胺和D-苯基甘氨酰胺。优选用氨。
可在水中进行酶促酰化反应。如果想要的话，反应混合物中也可以包含有机溶剂或有机溶剂混合物，优选体积比小于30％。可以使用的适宜有机溶剂例如是带有1～7个碳原子的醇类，例如一元醇，特别是甲醇或乙醇；二元醇，特别是乙二醇或三元醇，特别是甘油。
优选酶促酰化反应以分批补料方式进行。如果想要的话，反应也可持续进行。可用于本发明方法的适宜β-内酰胺核的例子是青霉素衍生物，例如6-APA，和头孢菌素衍生物，例如带或不带3-位取代基的7-氨基头孢烷酸，例如，7-ACA、7-ADCA、7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADAC)、7-氨基-3-氯-头孢-3-烯-4-羧酸(7-amino-3-chloro-ceph-3-em-4-carboxylic acid)(7-ACCA)和7-氨基-3-氯-8-氧代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸。
本发明上下文中侧链可以包括任何可结合到β-内酰胺核6-penam或7-cephem位从而形成具抗生素活性化合物的适宜化合物。苯基甘氨酸、对羟基苯基甘氨酸和二氢苯基甘氨酸为适宜侧链的示例。作为(酶促)酰化反应中使用的活性侧链可由例如所述侧链的酰胺(一级、二级、三级)或酯类制备，例如苯基甘氨酸、对羟基苯基甘氨酸或二氢苯基甘氨酸的酰胺或酯类，优选酰胺或低级烷基(1～4个C)酯，例如甲酯。活化侧链还可包括酯类或酰胺的盐。优选，以苯基甘氨酰胺为活化侧链。
优选用本发明方法制备的β-内酰胺抗生素是羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢拉定和头孢克洛。
青霉素酰基转移酶突变体可从任一已知的青霉素酰基转移酶制备。可从例如以下微生物获得青霉素酰基转移酶醋杆菌属(Acetobacter)，特别是巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianum)，气单孢菌属(Aeromonas)，产碱菌属(Alcaligenes)，特别是粪产碱菌，Aphanocladium，芽孢杆菌种(Bacillus sp.)，特别是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，头孢属(Cephalosporium)，埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)，黄杆菌属(Flavobacterium)，镰刀菌属(Fusarium)，特别是尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)和茄病镰孢(Fusarium solani)，克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)，枝动菌属(Mycoplana)，精朊杆菌属(Protaminobacter)，变形菌属(Proteus)，特别是雷氏普罗威登斯菌(Proteus rettgari)，假单孢菌属(Pseudomonas)和黄单胞菌属(Xanthomonas)，特别是柑橘黄单孢菌(Xanthomonas citrii)。
突变青霉素酰基转移酶可用任何已知方法制备。适宜的方法例如是用聚合酶链式反应(PCR)向编码青霉素酰基转移酶的DNA导入突变的方法。在PCR法中，借助合成的寡核苷酸将突变导入青霉素酰基转移酶编码DNA序列上的目的位点。例如可以用寡核苷酸5′-TGCCAGATTATCGATTTCGCTAGTACTATCAGAGAACAAGTTTGCCAT-3′，其中带有下划线的密码子编码L-亮氨酸，为了在大肠杆菌青霉素酰基转移酶α-亚单位第145位导入突变，用L-亮氨酸密码子取代该位置的L-精氨酸密码子。用ACA或CTT取代上述寡核苷酸中的下划线密码子，这样的寡核苷酸可用于在相同位置分别导入L-半胱氨酸或L-赖氨酸。
向DNA序列中导入突变后，可将获得的DNA序列克隆进载体。随后可用载体转化宿主细胞。之后在适于突变青霉素酰基转移酶表达的条件下培养宿主细胞。
发明还涉及编码本发明突变青霉素酰基转移酶的核酸序列和包含本发明核酸序列的表达载体，该载体中的核酸序列与适于在宿主细胞中表达核酸序列的启动子功能性相连。发明还涉及包含表达载体的宿主细胞和制备突变青霉素酰基转移酶的方法，在该方法中宿主培养于适于突变青霉素酰基转移酶生产的条件下。优选以大肠杆菌为宿主细胞。
优选青霉素酰基转移酶以固定化形式使用，因为固定化酶随后易于分离和循环利用。
本发明将根据实施例得以阐明但不受其限制。
氨基酸命名氨基酸3字母缩写 单字母缩写L-丙氨酸 AlaAL-半胱氨酸CysCL-天冬氨酸AspDL-谷氨酸 GluEL-苯丙氨酸PheFL-甘氨酸 GlyG.
L-组氨酸 HisHL-异亮氨酸IleIL-赖氨酸 LysKL-亮氨酸 LeuLL-甲硫氨酸MetML-天冬酰胺AsnNL-脯氨酸 ProPL-谷氨酰胺GlnQL-精氨酸 ArgRL-丝氨酸 SerSL-苏氨酸 ThrT
L-酪氨酸 Br YL-缬氨酸 ValVL-色氨酸 TrpW缩写列表7-ADCA 7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸6-APA6-氨基青霉烷酸AMPI 氨苄青霉素CEX 头孢氨苄PG D-苯基甘氨酸PGA D-苯基甘氨酰胺PGM.HCL D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐HPGM D-对羟基苯基甘氨酸甲酯实施例和比较试验青霉素酰基转移酶(野生型)AssemblaseTM是WO-A-99/20786和WO-A-97/04086中所述大肠杆菌ATCC 1105的固定化大肠杆菌青霉素酰基转移酶。以凝胶和壳聚糖作凝胶化合物以及戊二醛为交联剂如EP-A-222462所述将酰基转移酶固定于小球体。
大肠杆菌青霉素酰基转移酶产生的活性根据添加至活化小球体的酶量测定，总计为3ASU/g干重。将1ASU(羟氨苄青霉素合成单位)定义为每小时从6-APA和HPGM产生1g三水合羟氨苄青霉素所需的酶量(20℃；6.5质量％6-APA和6.5质量％HPGM)。
实施例1突变青霉素酰基转移酶(R145L)突变体制备在聚合酶链式反应(PCR)中热循环扩增DNA片段。为此用了两个引物，它们各与扩增片段(模板)的DNA(大肠杆菌)两个末端之一互补。引物与模板结合后，DNA聚合酶能与引物模板复合物结合，DNA得以扩增。
热循环中发生以下步骤步骤194℃孵育双链模板解链形成单链模板DNA。
步骤255℃孵育引物与模板上的互补DNA结合。
步骤372℃孵育聚合酶与引物模板复合物结合并扩增DNA。
通过重复这3个步骤一定次数，可以扩增模板DNA上的片段，该片段侧翼序列为与引物序列互补的序列。
如上所述制备αR145L突变体。用以下反应混合物扩增得到一个具有305个碱基对的片段1μl引物R145Lfw(100ng/μl)5′-GAAGTGCTTGGCAAA-3′1μl引物R145L rv(100ng/μl)5′-TGCCAGATTATCGATTTCGCTAGTACTATCAGAGAACAAGTTTGCCAT-3′(其中的下划线密码子编码L-亮氨酸)1μl质粒DNA，pEC(～20ng/μl保存液)2μl dNTPs(10mM保存液)10μl 10×Pwo缓冲液1μl Pwo聚合酶84μl H2O用以下温度程序加热反应混合物94℃1分钟1个循环；25个循环94℃1分钟，之后是55℃1分钟，之后是72℃1分钟；72℃5分钟1个循环。
之后用限制性酶ClaI和EcoRV切割PCR产物和质粒pEC。产物都进行琼脂糖凝胶电泳，并用Quiagen的Quiaex试剂盒纯化。纯化后连接二者片段。用以下反应混合物完成该步骤10μl用ClaI和EcoRV切割的PCR产物水溶液(共300ng DNA)1μl用ClaI和EcoRV切割的质粒DNA水溶液(共100ng DNA)
2μl连接缓冲液1μl连接酶6μl H2O反应在室温下进行16小时。
之后用10μl反应混合物转化CaCl2感受态大肠杆菌HB101。用Sambrook等人，′Molecular Cloninga Laboratory Manual′，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1989中所述的标准方法进行转化。所有的酶及缓冲液得自Boehringer Mannheim。
经测序证实，所得突变体包含目的核苷酸序列。
纯化方法如下述得到重组酶。于17℃，150rpm，在含有0.1mM IPTG的LB培养基中培养带有质粒pEC的大肠杆菌，该质粒pEC含有带相关突变的青霉素酰基转移酶基因。600nm光密度(OD600)值为2时于5000×g离心10分钟收集细胞。离心物重悬于10倍体积的冰预冷缓冲液A(20％蔗糖，100mM Tris-HCl，pH8.0，10mm EDTA)。于5000×g再次离心细胞10分钟。离心物重悬于冰预冷的缓冲液B(1mM EDTA)，于5000×g离心10分钟。上清液为周质提取物，加入磷酸缓冲液pH7.0至终浓度50mM。
向上清液中逐步加入(NH4)2SO4至终浓度为1.5M，之后将抽提物在10 000×g下离心20分钟。然后将上清液置于Resource Phe(Amersham-Pharmacia Biotech)上，用1.5M～0M(NH4)2SO4线性梯度洗脱。通过测定280nm下的吸收(A280)(室长1cm)测定纯化酶的终浓度，消光系数为210.000M-1·cm-1。
质粒pEC示于
图1。
固定化的Pen-G酰基转移酶突变体R145L除用突变体R145L而非野生型大肠杆菌Pen-G酰基转移酶外，用与AssemblaseTM所述相同方法固定突变青霉素酰基转移酶(α145L)，根据固定化蛋白质选择酶载量分别高出0.87(正常载量)和1.35(较高载量)倍。
对照试验A固定化的Pen-G酰基转移酶突变体βF24A除用突变体βF24A而非野生型大肠杆菌Pen-G酰基转移酶外，用与AssemblaseTM所述相同方法固定突变青霉素酰基转移酶(βF24A)。根据固定化蛋白质选择相同的酶载量。
用AssemblaseTM(固定化的野生型Pen-G酰基转移酶)和PGA合成头孢氨苄用20g nett-wet AssemblaseTM填充酶反应器(100ml)，酶反应器具有175μm纱布的筛网状底部。用40.0ml水(T＝2℃)、0.10g亚硫酸氢钠、10.8g 7-ADCA(49.6mmol)和7.1g PGA(46.8mmol)填充制备反应器(100ml)。加入0.45g浓氨水，之后在T＝2℃下搅拌悬浮液10分钟。pH为7.8。随后在t＝0时用10.0ml水将悬浮液转入酶反应器(T＝2℃)。t＝0时启动酶反应器中的搅拌子。温度保持在T＝2℃。约90分钟后所有7-ADCA都已经溶解；之后，除固体AssemblaseTM外，呈现清澈溶液。
166分钟后pH已经升至8.80，[PG]＝1.10质量％，转化率＝70％w.r.t.初始7-ADCA量，和S/H＝6.6。计算初始酶活性为～8.2μmolCEX/(分钟·mg酶)。S/H作为转化率的函数示于图2。
对照试验B用固定化的Pen-G酰基转移酶突变体βF24A和PGA合成头孢氨苄用25.0g nett-wet固定化Pen-G酰基转移酶突变体βF24A填充与对照试验A中类似的酶反应器。用40ml水(2℃)、0.10亚硫酸氢钠、10.0g 7-ADCA(45.9mmol)和7.2g PGA(47.5mmol)填充制备反应器。加入0.45g氨。进一步条件如对照试验A中所述。
280分钟后pH已经升至7.9，[PG]＝0.05质量％，转化率＝23％w.r.t.初始7-ADCA量，和S/H＝33。计算初始酶活性为～0.13μmolCEX/(分钟·mg酶)。S/H作为转化率的函数示于图2。
实施例2用固定化的Pen-G酰基转移酶突变体R145L(正常载量)和PGA合成头孢氨苄用20.0g nett-wet固定化Pen-G酰基转移酶突变体(R145L，正常载量)填充与对照试验A中类似的酶反应器。用47.0ml水(2℃)、0.16g亚硫酸氢钠、15.5g 7-ADCA(70.9mmol)和11.5g PGA(76.0mmol)填充制备反应器。进一步条件如对照试验A中所述。
315分钟后pH已经升至8.58，[PG]＝0.66质量％，转化率＝81％w.r.t.初始7-ADCA量，和S/H＝13.8。计算初始酶活性为～0.71μmolCEX/(分钟·mg酶)。S/H作为转化率的函数示于图2。
结果(图2)显示，与野生型Pen G酰基转移酶(对照试验A)相比，Pen-G酰基转移酶突变体R145L(实施例1)在头孢氨苄合成中得到了较高的S/H比率(13.8)和高转化率(83％)。用Pen-G酰基转移酶突变体βF24A(对照试验B)仅得到低转化率(23％)。此外，Pen-G酰基转移酶突变体R145L的初始酶活性是野生型Pen G酰基转移酶的8.8％，而Pen-G酰基转移酶突变体βF24A的初始酶活性仅仅是野生型Pen G酰基转移酶的1.6％。
对照试验C用AssemblaseTM(固定化的野生型Pen-G酰基转移酶)和PGA合成氨苄青霉素用150g nett-wet AssemblaseTM填充酶反应器(750ml)，该酶反应器具有175μm纱布的筛网状底部。
用250ml水(T＝10℃)和71.6g 7-PGA(475mmol)填充制备反应器(600ml)。T＝10℃下，在15分钟内边冷却边以小比例加入65.8g 6-APA(300mmol)，并且通过6N H2SO4滴定保持pH值7.0。T＝10℃下搅拌混合物15分钟，随后在t＝0时用50.0ml水将混合物转入酶反应器(T＝10℃)。t＝0时启动酶反应器中的搅拌子。用6NH2SO4滴定使pH维持在7.0。温度维持在10℃。
t＝160分钟时氨苄青霉素的量最大，加入6N H2SO4使pH降至5.6。t＝160分钟时转化率＝91～92％w.r.t.初始6-APA量，S/H＝1.67。计算初始酶活性为～1.4μmol AMPI/(分钟·mg酶)。S/H作为转化率的函数示于图3。
对照试验D用固定化的Pen-G酰基转移酶突变体βF24A和PGA合成氨苄青霉素用95.5g nett-wet固定化的Pen-G酰基转移酶突变体βF24A填充与对照试验C中类似的酶反应器。用200ml水(T＝10℃)、30.0g 6-APA(139.0mmol)和22.8g PGA(140mmol)填充制备反应器(600ml)。pH为6.7。T＝10℃下搅拌混合物15分钟，随后在t＝0时用50.0ml水(T＝10℃)将混合物转入酶反应器。t＝0时启动酶反应器中的搅拌子。用6N H2SO4滴定使pH维持在6.7。温度维持在10℃。
t＝300分钟时，转化率仅为11.1％，S/H比率为19.1。计算初始酶活性为～0.057μmol AMPI/(分钟·mg酶)。S/H作为转化率的函数示于图3。
实施例3用固定化的Pen-G酰基转移酶突变体R145L和PGA合成氨苄青霉素用90g nett-wet固定化的Pen-G酰基转移酶突变体R145L(正常载量)填充与对照试验C中类似的酶反应器。之后加入59.8g PGA、65.8g 6-APA(300mmol)和225ml水(T＝10℃)，T＝10℃下搅拌混合物15分钟。之后加入59.8g PGA(397mmol)(t＝0)。10分钟后，加入1.0g三水合氨苄青霉素。温度维持在T＝10℃，用50％醋酸滴定使pH维持在6.9。共计需要43ml 50％的醋酸。t＝390分钟时氨苄青霉素量最大，加入50％醋酸使pH降至5.6。
t＝390分钟时氨苄青霉素量最大，加入50％醋酸使pH降至5.6(又一10ml)。相对6-APA量的转化率为87～88％，S/H比率为14.5。计算初始酶活性为～0.94μmol AMPI/(分钟·mg酶)。S/H作为转化率的函数示于图3。
结果(图3)显示，与野生型Pen G酰基转移酶(对照试验C)相比，Pen-G酰基转移酶突变体R145L(实施例II)在氨苄青霉素合成中在高转化率处得到了较高的S/H比率(14.5)。用Pen-G酰基转移酶突变体βF24A(对照试验D)仅得到低转化率。此外，Pen-G酰基转移酶突变体R145L的初始酶活性是野生型Pen G酰基转移酶的67％，而Pen-G酰基转移酶突变体βF24A的初始酶活性仅仅是野生型Pen G酰基转移酶的4％。
序列表<110>DSM NV<120>β-内酰胺抗生素的制备方法<130>20538WO<140>
<141>
<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>846<212>PRT<213>大肠杆菌<400>1Met Lys Asn Arg Asn Arg Met Ile Val Asn Cys Val Thr Ala Ser Leu1 5 10 15Met Tyr Tyr Trp Ser Leu Pro Ala Leu Ala Glu Gln Ser Ser Ser Glu20 25 30Ile Lys Ile Val Arg Asp Glu Tyr Gly Met Pro His Ile Tyr Ala Asn35 40 45Asp Thr Trp His Leu Phe Tyr Gly Tyr Gly Tyr Val Val Ala Gln Asp50 55 60Arg Leu Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Thr Val65 70 75 80Ala Glu Val Leu Gly Lys Asp Phe Val Lys Phe Asp Lys Asp Ile Arg85 90 95Arg Asn Tyr Trp Pro Asp Ala Ile Arg Ala Gln Ile Ala Ala Leu Ser100 105 110Pro Glu Asp Met Ser Ile Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Gly Met Asn Ala115 120 125Trp Ile Asp Lys Val Asn Thr Asn Pro Glu Thr Leu Leu Pro Lys Gln130 135 140Phe Asn Thr Phe Gly Phe Thr Pro Lys Arg Trp Glu Pro Phe Asp Val145 150 155 160Ala Met Ile Phe Val Gly Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ser Thr165 170 175Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Lys Tyr180 185 190
Gly Val Ser Gln Gly Met Ala Val Phe Asn Gln Leu Lys Trp Leu Val195 200 205Asn Pro Ser Ala Pro Thr Thr Ile Ala Val Gln Glu Ser Asn Tyr Pro210 215 220Leu Lys Phe Asn Gln Gln Asn Ser Gln Thr Ala Ala Leu Leu Pro Arg225 230 235 240Tyr Asp Leu Pro Ala Pro Met Leu Asp Arg Pro Ala Lys Gly Ala Asp245 250 255Gly Ala Leu Leu Ala Leu Thr Ala Gly Lys Asn Arg Glu Thr Ile Ala260 265 270Ala Gln Phe Ala Gln Gly Gly Ala Asn Gly Leu Ala Gly Tyr Pro Thr275 280 285Thr Ser Asn Met Trp Val Ile Gly Lys Ser Lys Ala Gln Asp Ala Lys290 295 300Ala Ile Met Val Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Tyr Ala Pro Ala Tyr305 310 315 320Thr Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Tyr Asp Val Thr Gly Asn325 330 335Thr Pro Phe Ala Tyr Pro Gly Leu Val Phe Gly His Asn Gly Val Ile340 345 350Ser Trp Gly Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Asp Val Asp Ile Phe Ala355 360 365Glu Arg Leu Ser Ala Glu Lys Pro Gly Tyr Tyr Leu His Asn Gly Lys370 375 380Trp Val Lys Met Leu Ser Arg Glu Glu Thr Ile Thr Val Lys Asn Gly385 390 395 400Gln Ala Glu Thr Phe Thr Val Trp Arg Thr Val His Gly Asn Ile Leu405 410 415Gln Thr Asp Gln Thr Thr Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Ser Arg Ala Trp420 425 430Asp Gly Lys Glu Val Ala Ser Leu Leu Ala Trp Thr His Gln Met Lys435 440 445Ala Lys Asn Trp Gln Glu Trp Thr Gln Gln Ala Ala Lys Gln Ala Leu450 455 460Thr Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Val Asn Gly Asn Ile Gly Tyr Val465 470 475 480His Thr Gly Ala Tyr Pro Asp Arg Gln Ser Gly His Asp Pro Arg Leu485 490 495
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Ala Pro Asp Gly Thr Val Asp Lys His Tyr Glu Asp Gln Leu Lys Met805 810 815Tyr Glu Asn Phe Gly Arg Lys Ser Leu Trp Leu Thr Lys Gln Asp Val820 825 830Glu Ala His Lys Glu Ser Gln Glu Val Leu His Val Gln Arg835 840 845<210>2<211>209<212>PRT<213>大肠杆菌<400>2Glu Gln Ser Ser Ser Glu Ile Lys Ile Val Arg Asp Glu Tyr Gly Met1 5 10 15Pro His Ile Tyr Ala Asn Asp Thr Trp His Leu Phe Tyr Gly Tyr Gly20 25 30Tyr Val Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg35 40 45Ser Thr Gln Gly Thr Val Ala Glu Val Leu Gly Lys Asp Phe Val Lys50 55 60Phe Asp Lys Asp Ile Arg Arg Asn Tyr Trp Pro Asp Ala Ile Arg Ala65 70 75 80Gln Ile Ala Ala Leu Ser Pro Glu Asp Met Ser Ile Leu Gln Gly Tyr85 90 95Ala Asp Gly Met Asn Ala Trp Ile Asp Lys Val Asn Thr Asn Pro Glu100 105 110Thr Leu Leu Pro Lys Gln Phe Asn Thr Phe Gly Phe Thr Pro Lys Arg115 120 125Trp Glu Pro Phe Asp Val Ala Met Ile Phe Val Gly Thr Met Ala Asn130 135 140Arg Phe Ser Asp Ser Thr Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr145 150 155 160Ala Leu Lys Asp Lys Tyr Gly Val Ser Gln Gly Met Ala Val Phe Asn165 170 175Gln Leu Lys Trp Leu Val Asn Pro Ser Ala Pro Thr Thr Ile Ala Val180 185 190Gln Glu Ser Asn Tyr Pro Leu Lys Phe Asn Gln Gln Asn Ser Gln Thr195 200 205Ala
<210>3<211>557<212>PRT<213>大肠杆菌<400>3Ser Asn Met Trp Val Ile Gly Lys Ser Lys Ala Gln Asp Ala Lys Ala1 5 10 15Ile Met Val Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Tyr Ala Pro Ala Tyr Thr20 25 30Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Tyr Asp Val Thr Gly Asn Thr35 40 45Pro Phe Ala Tyr Pro Gly Leu Val Phe Gly His Asn Gly Val Ile Ser50 55 60Trp Gly Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Asp Val Asp Ile Phe Ala Glu65 70 75 80Arg Leu Ser Ala Glu Lys Pro Gly Tyr Tyr Leu His Asn Gly Lys Trp85 90 95Val Lys Met Leu Ser Arg Glu Glu Thr Ile Thr Val Lys Asn Gly Gln100 105 110Ala Glu Thr Phe Thr Val Trp Arg Thr Val His Gly Asn Ile Leu Gln115 120 125Thr Asp Gln Thr Thr Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Ser Arg Ala Trp Asp130 135 140Gly Lys Glu Val Ala Ser Leu Leu Ala Trp Thr His Gln Met Lys Ala145 150 155 160Lys Asn Trp Gln Glu Trp Thr Gln Gln Ala Ala Lys Gln Ala Leu Thr165 170 175Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Val Asn Gly Asn Ile Gly Tyr Val His180 185 190Thr Gly Ala Tyr Pro Asp Arg Gln Ser Gly His Asp Pro Arg Leu Pro195 200 205Val Pro Gly Thr Gly Lys Trp Asp Trp Lys Gly Leu Leu Pro Phe Glu210 215 220Met Asn Pro Lys Val Tyr Asn Pro Gln Ser Gly Tyr Ile Ala Asn Trp225 230 235 240Asn Asn Ser Pro Gln Lys Asp Tyr Pro Ala Ser Asp Leu Phe Ala Phe245 250 255
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<210>4<211>209<212>PRT<213>大肠杆菌<400>4Glu Gln Ser Ser Ser Glu Ile Lys Ile Val Arg Asp Glu Tyr Gly Met1 5 10 15Pro His Ile Tyr Ala Asn Asp Thr Trp His Leu Phe Tyr Gly Tyr Gly20 25 30Tyr Val Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg35 40 45Ser Thr Gln Gly Thr Val Ala Glu Val Leu Gly Lys Asp Phe Val Lys50 55 60Phe Asp Lys Asp Ile Arg Arg Asn Tyr Trp Pro Asp Ala Ile Arg Ala65 70 75 80Gln Ile Ala Ala Leu Ser Pro Glu Asp Met Ser Ile Leu Gln Gly Tyr85 90 95Ala Asp Gly Met Asn Ala Trp Ile Asp Lys Val Asn Thr Asn Pro Glu100 105 110Thr Leu Leu Pro Lys Gln Phe Asn Thr Phe Gly Phe Thr Pro Lys Arg115 120 125Trp Glu Pro Phe Asp Val Ala Met Ile Phe Val Gly Thr Met Ala Asn130 135 140Leu Phe Ser Asp Ser Thr Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr145 150 155 160Ala Leu Lys Asp Lys Tyr Gly Val Ser Gln Gly Met Ala Val Phe Asn165 170 175Gln Leu Lys Trp Leu Val Asn Pro Set Ala Pro Thr Thr Ile Ala Val180 185 190Gln Glu Set Asn Tyr Pro Leu Lys Phe Asn Gln Gln Asn Set Gln Thr195 200 205Ala
权利要求
1.突变青霉素酰基转移酶，该酰基转移酶在与大肠杆菌青霉素酰基转移酶α-亚单位位置145相应的位置上具有至少一个氨基酸取代。
2.根据权利要求1的突变青霉素酰基转移酶，其中所述145位的L-精氨酸被L-亮氨酸、L-赖氨酸或L-半胱氨酸取代。
3.突变青霉素酰基转移酶，当其被用于借助突变青霉素酰基转移酶从β-内酰胺核和作为活化侧链的酰胺经酶法制备β-内酰胺抗生素的方法中时，产生的初始S/H比率至少是在相同反应条件下使用野生型大肠杆菌青霉素G酰基转移酶所得初始S/H比率的两倍，并且其酶活性至少是在相同反应条件下野生型大肠杆菌青霉素G酰基转移酶活性的1％。
4.根据权利要求1～3中任一项的突变青霉素酰基转移酶，其特征在于该青霉素酰基转移酶是大肠杆菌青霉素酰基转移酶。
5.制备β-内酰胺抗生素的方法，其中β-内酰胺核在突变青霉素酰基转移酶存在下借助活化侧链被酰化，其特征在于使用根据权利要求1～3中任一项的突变青霉素酰基转移酶。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于用酰胺作为活化侧链。
7.根据权利要求5或6的方法，其特征在于β-内酰胺抗生素是头孢菌素。
8.根据权利要求5或6的方法，其特征在于β-内酰胺抗生素是青霉素。
9.编码根据权利要求1～3中任一项的突变青霉素酰基转移酶的核酸序列。
10.含有如权利要求9中所定义核酸序列的表达载体，其中该核酸序列与适于在宿主细胞中表达该核酸序列的启动子功能性相连。
11.含有权利要求10的表达载体的宿主细胞。
12.制备根据权利要求1～3中任一项的突变酶的方法，其中宿主细胞培养于适于突变青霉素酰基转移酶生产的条件下。
全文摘要
本发明涉及突变青霉素酰基转移酶，与野生型青霉素酰基转移酶相比它具有高的合成/水解比率且活性至少为其1％。本发明还涉及一种借助突变青霉素酰基转移酶从β－内酰胺核和活化侧链经酶法制备β－内酰胺抗生素的方法。
文档编号C12N1/21GK1608130SQ02826109
公开日2005年4月20日 申请日期2002年12月18日 优先权日2001年12月27日
发明者W·B·L·阿尔克玛, H·M·穆迪, J·M·拉恩范德, T·J·G·M·多仁范, W·H·J·博坦 申请人:Dsm Ip资产有限公司