专利名称：合成的除草剂抗性基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及合成的除草剂抗性基因，其制备除草剂抗性转基因植物及其用作选择性标记的用途。
背景技术：
2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)是用于控制阔叶杂草的除草剂。2，4-D由富氧产碱菌和其它微生物降解。编码富氧产碱菌对2，4-D的降解途径中的第一个酶是tfdA。这个基因编码催化2，4-D转变为2，4-二氯酚(DCP)的二加氧酶。DCP对植物的毒性比2，4-D小得多，并且已经报道含有tfdA基因的转基因烟草作物、棉花植物和阔叶树对2，4-D的耐受增加。Streber等，Bio/Technology，7，811-816(1989)；Lyon等，Plant Molec.Biol.，13，533-540(1989)；Bayley等，Theor.Appl.Genet.，83，645-649(1992)；Llewellyn和Last，inHerbicide-Resistant Crops，第10章，159-174页(Duke，主编CRCPress(1996))；Last和Llewellyn，Weed Science，47，401-404(1999)；美国专利6,153,401，6,100,446和5,608,147；和PCT申请WO 98/38294和WO 95/18862。然而，尚未获得在农业情形下可能遇到的转基因植物抗2，4-D的水平。见Last和Llewellyn，WeedScience，47，401-404(1999)。这些作者提示tfdA基因的密码子优化“可能增强耐受性水平。”Id.at 404。tfdA基因也已经用作鉴定转化植物和植物细胞的选择标记。美国专利5,608,147；PCT申请WO 95/18862。
发明概述本发明提供了包含合成的DNA序列的DNA分子。该合成的DNA序列编码将2，4-二氯苯氧乙酸降解为二氯酚的酶。合成的DNA序列包括编码该酶的天然微生物序列，其中天然微生物序列的至少多数密码子已被植物更优选的密码子取代。
本发明也提供了包含刚刚描述的合成的DNA序列的DNA构建体。在这个构建体中，合成的DNA序列可操作地连接植物基因表达控制序列。
本发明进一步提供了转基因植物或植物的一部分。该转基因植物或植物的一部分包括与植物基因表达控制序列可操作连接的合成的DNA序列。
本发明也提供了控制含有根据本发明转基因植物的田地中的杂草的方法。该方法包括给田地应用有效控制田地中杂草的量的生长素除草剂。由于包含并表达合成的DNA序列，转基因植物耐受生长素除草剂。的确，第一次，制备了耐受生长素除草剂水平基本高于农业中控制杂草正常使用的水平的转基因植物。
本发明进一步提供了选择转化植物和植物细胞的方法。选择转化植物细胞的方法包括提供植物细胞群。至少群体中有些植物细胞被本发明的DNA构建体转化。接着，所得植物细胞群在含有选择使得转化植物细胞增生和未转化植物细胞不增生的浓度的生长素除草剂的培养基中生长。
选择转化植物的方法包括提供怀疑包含根据本发明转基因植物的的植物群。接着，将生长素除草剂应用于植物群，所选除草剂的量使得转化植物生长和未转化植物的生长被抑制。
附图简述
图1pProPC1SV-SAD的图。
图2pPZP211-PNPT-311g7的图。
图3pPZP211-PNPT-512g7的图。
图4pPZP211-PNPT-311-SAD的图。
图5pPZP211-PNPT-512-SAD的图。
在这些图中，SAD＝为双子叶植物改编的降解2，4-D的合成基因；CDS＝编码序列；AMV-前导区＝来自苜蓿花叶病毒35S转录物的5’非翻译前导序列；PC1SV-启动子＝花生褪绿条死病病毒启动子；T-Left＝根癌土壤杆菌胭脂氨酸Ti质粒pTiT37的T-DNA左侧；35SpolyA＝花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录物的3′聚腺苷酸化(polyA)终止信号序列；NPTII＝新霉素磷酸转移酶II；g7PolyA＝根癌土壤杆菌章鱼氨酸质粒的T左侧内的基因7的3′polyA终止信号；MCS＝多克隆位点；T-Right＝根癌土壤杆菌Ti质粒pTiT37的T-DNA右侧。
本发明优选实施方案的详细描述本发明提供了合成的DNA序列。这里使用的“合成的”是指非天然存在序列的DNA序列。
本发明的合成的DNA序列编码将2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)降解为二氯酚(DCP)的酶。该合成的DNA序列包括编码该酶的天然微生物序列，其中天然微生物序列的至少多数密码子已被植物更优选的密码子取代。
“天然微生物序列”是编码可将2，4-D降解为DCP的酶的天然存在的微生物基因的编码序列。因此，“天然微生物序列”可以是分离自微生物的cDNA或基因组克隆的编码序列，可以是具有与这种克隆相同的编码序列的化学合成的DNA分子，或可以是这种序列的组合。
已经证明了几个细菌属中2，4-D降解的多种酶途径。见如Lyon等Plant Molec.Biol.，13，533-540(1989)，和这里引用的参考文献。富氧产碱菌株(strains of Alcaligenes eutrophus)是这些细菌中研究最广泛的。在A.eutrophus降解途径中的第一个酶将2，4-D转变为DCP。这个酶，通常称作单加氧酶，但是现在已知是二加氧酶(见Fukumori等，J.Bacteriol.，175，2083-2086(1993))，由tfdA基因编码。因此，天然微生物序列可以是编码tfdA二加氧酶的cDNA或基因组克隆的编码序列。Bayley等Theor.Appl.Genet.，83，645-649(1992)，Lyon等Plant Molec.Biol.，13，533-540(1989)，Streber等J.Bacteriology，169，2950-2955(1987)，Perkins和Lurquin，J.Bacteriology，170，5669-5672(1988)和美国专利6,100,446和6,153,401中描述了这种克隆及其分离作用。也见Maniatis等Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，NY(1982)，Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)。
已知很多细菌能够降解2，4-D，包括不动杆菌，Achromobacter，产碱菌属，节杆菌，棒状杆菌，产黄菌，假单胞菌和放线菌株(如诺卡氏菌亚种和绿产色链霉菌)(见如Llewellyn和Last，inHerbicide Resistant Crops，第10章(Stephen O.Duke ed.，CRCPress Inc.(1996))，Bayley等，Theor.Appl.Genet.，83，645-649(1992)，Lyon等，Plant Molec.Biol.，13，533-540(1989)，and Streber等，J.Bacteriology，169，2950-2955(1987)，Loos，in Degradation Of Herbicides，pages 1-49(Kearney andKaufman，主编.，Marcel Dekker，Inc.，New York 1969)，和这些参考文献中引用的参考文献)，和可用本领域熟知的方法(如用富集培养技术使用2，4-D从土壤分离)分离降解2，4-D的另外的细菌菌株(见如Loos，in Degradation Of Herbicides，1-49页(Kearney和Kaufman，主编，Marcel Dekker，Inc.，New York 1969)。以与tfdA克隆类似的方式从这些其它细菌中可获得编码将2，4-D转变为DCP的酶的另外cDNA和基因组克隆。见如Bayley等，Theor.Appl.Genet.，83，645-649(1992)；Lyon等，Plant Molec.Biol.，13，533-540(1989)；Streber等J.Bacteriology，169，2950-2955(1987)，Perkins和Lurquin，J.Bacteriology，170，5669-5672(1988)；美国专利6,100,446和6,153,401。也见Maniatis等MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1982)，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，NY(1989)。此外，或可供选择地，分离的克隆，它们的一部分，或来自它们的序列，可用作探针鉴定和分离另外的克隆。见如Perkins和Lurquin，J.Bacteriology，170，5669-5672(1988)；Bayley等，Theor.Appl.Genet.，83，645-649(1992)；美国专利6,100,446和6,153,401。也见Maniatis等MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1982)，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，NY(1989)。天然微生物序列可以是这些cDNA或基因组克隆之一的编码序列。
也已知酵母和真菌能够降解2，4-D(见如Llewellyn和Last，inHerbicide-Resistant Crops，第10章(Stephen O.Duke ed.，CRCPress Inc.(1996))；Han和New，Soil Biol.Biochem.，26，1689-1695(1994)；Donnelly等，Applied And EnvironmentalMicrobiology，59，2642-2647(1993)；Loos，in Degradation OfHerbicides，1-49页(Kearney和Kaufman，主编Marcel Dekker，Inc.，New York 1969)和这些参考文献中引用的参考文献)，和用本领域熟知方法可获得降解2，4-D的另外的酵母和真菌菌株(如用富集培养技术使用2，4-D从土壤分离)(见如Loos，in Degradation OfHerbicides，1-49页(Kearney和Kaufman，主编，Marcel Dekker，Inc.，New York 1969)；Han和New，Soil Biol.Biochem.，26，1689-1695(1994))。用本领域熟知的方法可从酵母和真菌获得编码将2，4-D转变为DCP的酶的另外cDNA和基因组克隆(见上面从细菌获得克隆的讨论中引用的参考文献)，和天然微生物序列可以是这些cDNA或基因组克隆之一的编码序列。
此外，如上指出，天然微生物序列可以是完全或部分化学合成的。为了这样做，用本领域熟知方法对如前几段所述获得的cDNA或基因组克隆测序。见如Maniatis等Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，NY(1982)，Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)。可以使用本领域熟知方法完全或部分合成包含该cDNA或基因组克隆的编码序列的合成的DNA序列。见如Maniatis等Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1982)，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)。例如，可以用亚磷酰胺(phosphoamidite)化学法在自动DNA合成仪中合成DNA序列。而且，富氧产碱菌JMP134的tfdA基因序列是公众可获得的(见Streber等，J.Bacteriology，169，2950-2955(1987)，美国专利6,100,446和6,153,401，和GenBank(登记号M16730))，并且包含富氧产碱菌tfdA基因的编码序列的合成的DNA序列也可以完全或部分化学合成。
优选的天然微生物序列是天然细菌序列。“天然细菌序列”是编码可将2，4-D降解为DCP的酶的天然存在的细菌基因。因此，“天然细菌序列”可以是分离自细菌的cDNA或基因组克隆的编码序列，可以是具有与这种克隆相同的编码序列的化学合成的DNA分子，或可以是这种序列的组合。最优选的天然细菌序列是分离自富氧产碱菌株的cDNA或基因组克隆的编码序列，具有与这种克隆相同的编码序列的化学合成的DNA分子，或这种序列的组合。
如上指出，天然微生物序列的至少多数密码子被植物更优选的密码子(这里也称作“植物优选密码子”)取代。“植物更优选密码子”或“植物优选密码子”是植物编码特定氨基酸比编码那个氨基酸的微生物密码子更频繁使用的密码子。优选，植物优选密码子是植物编码氨基酸最频繁使用的密码子。植物密码子用法可以是植物一般的密码子用法，一类植物(如双子叶植物)，特殊类型的植物(如棉花或大豆)等。植物的密码子用法或优选可以由本领域已知方法推导出来。见如Maximizing Gene Expression，225-85页(Reznikoff &Gold，主编，1986)，Perlak等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，3324-3328(1991)，PCT WO 97/31115，PCT WO 97/11086，EP 646643，EP 553494，和美国专利5,689,052，5,567,862，5,567,600，5,552,299和5,017,692。例如，植物编码所选择的植物表达的蛋白的所有不同氨基酸所使用的密码子进行列表，优选高度表达的那些蛋白。这可以手工进行或使用为这个目的设计的软件(见PCT申请WO97/11086)。
与使用天然微生物序列相比，使用将表达合成的DNA序列的植物更优选的密码子将改善表达。发表的报道表明密码子用法在mRNA稳定性和转录效率水平上影响基因在植物中表达。见如Perlak等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，3324-3328(1991)；Adang等，PlantMolec.Biol.，211131-1145(1993)；Sutton等，Transgenic Res.，1228-236(1992)。不是所有的天然微生物序列的密码子都需要为了获得改善的表达而改变为植物优选的密码子。然而，优选至少植物最不优选的密码子改变为植物优选的密码子。“植物最不优选的密码子”是天然微生物序列中植物使用讨论中的(in question) 最少的密码子编码特定氨基酸。优选大于大约50％，最优选至少大约80％的微生物密码子改变为植物优选的密码子。
可以用本领域熟知的方法将植物优选的密码子导入天然微生物序列。例如，可以使用定点诱变。见Perlak等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，3324-3328(1991)。也见Maniatis等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1982)，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)。然而，优选使用化学合成编码降解2，4-D的酶的完整DNA序列将植物优选的密码子导入天然微生物序列。尤其是，当大量微生物密码子被植物优选的密码子取代时，非常优选化学合成。此外，化学合成具有很多优点。例如，使用化学合成允许对DNA分子或其编码的蛋白序列进行其它改变，如，优化表达(如除去干扰转录或翻译的mRNA二级结构，除去不需要的潜在聚腺苷酸化序列和改变A+T和G+C含量)，在方便点插入独特限制性位点，删除蛋白酶切割位点等。
植物优选密码子代替至少多数微生物密码子的合成的DNA序列将编码与天然微生物序列相同的氨基酸序列，如果这些置换是合成的DNA序列的序列与天然微生物序列相比的唯一差异的话。然而，合成的DNA序列可以包含与天然微生物序列相比的另外的改变。例如，合成的DNA序列可以编码将2，4-D降解为DCP的酶，但是由于天然微生物序列中一个或多个置换、插入或缺失，其与(未突变)天然微生物序列编码的酶相比，具有改变的氨基酸序列。进行这种置换、插入和缺失的方法是本领域熟知的并且上面描述过。
本领域熟知确定2，4-D是否已降解为DCP的试验。见如Streber等，J.Bacteriol.，169，2950-2955(1987)；Perkins等，J.Bacteriol.，170，5669-5672(1988)；Streber等，Bio/Technology，7，811-816(1989)；Lyon等，Plant Molec.Biol.，13，533-540(1989)；Bayley等，Theor.Appl.Genet.，83，645-649(1992)；Fukumori等，J.Bacteriol.，175，2083(1993)；Lyon等，Transgenic Res，2，162-169(1993)；Llewellyn和Last，inHerbicide-Resistant Crops，第10章，159-174页(Duke，ed..，CRC Press(1996))；Last和Llewellyn，Weed Science，47，401-404(1999)。而且，对2，4-D和其它生长素除草剂的耐受性可以用于证明这个转变。见下和刚才引用的参考文献。
本发明也提供了包含可操作连接植物基因表达控制序列的合成DNA序列的DNA构建体。这里定义的“DNA构建体”是有效将DNA导入宿主细胞的构建的(非天然存在的)DNA分子，并且该术语包括嵌合基因、表达盒和载体。
这里使用的“可操作连接”是指DNA序列以使得所编码蛋白被表达的方式的连接(包括序列的顺序、序列的定位和各种序列的相对间隔)。本领域熟知与编码序列可操作连接表达控制序列的方法。见如Maniatis等，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，NY(1982)，Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)。
“表达控制序列”是以任何方式控制转录或翻译中涉及的DNA序列。本领域熟知合适的表达控制序列和制备和使用它们的方法。
该表达控制序列应该包括启动子。该启动子可以是在所选择的植物细胞、植物的一部分或植物中显示转录活性的任何DNA序列。该启动子可以是诱导型或组成型(constitutive)。它可以是天然存在的，可以由各种天然存在的启动子的一部分组成，或可以部分或完全是合成的。启动子结构的研究提供了设计启动子的指导，如Harley和Reynolds，Nucleic Acids Res.，15，2343-61(1987)的指导。而且，可以优化启动子相对于转录起始的位置。见如Roberts等，Proc.NatlAcad.Sci.USA，76，760-4(1979)。本领域熟知植物中使用的很多合适启动子。
例如，植物中使用的合适的组成型启动子包括源自植物病毒的启动子，如花生褪绿条死病花椰菜花叶病毒(peanut chloroticstreak caulimovirus)(PC1SV)启动子(美国专利5,850,019)，花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(Odell等，Nature 313810-812(1985))，小球藻病毒甲基转移酶基因的启动子(美国专利5,563,328)，和玄参花叶病毒(FMV)的全长转录启动子(美国专利5,378,619)；如大米肌动蛋白的启动子(McElroy等，Plant Cell 2163-171(1990))，泛素(Christensen等，Plant Mol.Biol.12619-632(1989) 和Christensen等，Plant Mol.Biol.18675-689(1992))，pEMU(Last等，Theor.Appl.Genet.81581-588(1991))，MAS(Velten等，EMBO J.32723-2730(1984))，玉米H3组蛋白(Lepetit等，Mol.Gen.Genet.231276-285(1992)和Atanassova等，Plant Journal 2(3)291-300(1992))，Brassica napus ALS3(PCT申请WO 97/41228)；和各种土壤杆菌(Agrobacterium)基因的启动子(见美国专利4,771,002、5,102,796、5,182,200、5,428,147)。
植物中使用的合适的诱导型启动子包括来自对铜产生应答的ACE1系统的启动子(Mett等PNAS 904567-4571(1993))；苯磺酰胺除草剂安全剂产生应答的玉米In2基因的启动子(Hershey等，Mol.Gen.Genetics 227229-237(1991)和Gatz等，Mol.Gen.Genetics24332-38(1994))，和来自Tn10的Tet抑制剂启动子(Gatz等，Mol.Gen.Genet.227229-237(1991)。植物中使用的特别优选的诱导型启动子是一种对植物正常不产生应答的诱导剂产生应答的启动子。这种类型的示例性诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，它的转录活性由糖皮质激素诱导(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810421(1991))或嵌合转录活化剂XVE的最近应用，用于由雌二醇活化的基于雌激素受体的诱导型植物表达系统中(Zuo等，The Plant Journal，24265-273(2000))。EP332104、PCT WO93/21334和PCT WO 97/06269中描述了植物中使用的其它诱导型启动子。
最后，可以使用由其它启动子的一部分和部分或完全合成的启动子组成的启动子。见如Ni等，Plant J.，7661-676(1995)和PCTWO 95/14098描述了植物中使用的这种启动子。
该启动子可以包括，或被修饰包括，一种或多种增强子元件。优选，启动子将包括多数增强子元件。与不包括它们的启动子相比，含有增强子元件的启动子提供更高水平的转录。植物中使用的合适的增强子元件包括PC1SV增强子元件(美国专利5,850,019)，CaMV 35S增强子元件(美国专利5,106,739和5,164,316)和FMV增强子元件(Maiti等，Transgenic Res.，6，143-156(1997))。也见PCT WO96/23898和Enhancers And Eukaryotic Expression(Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1983)。
为了有效表达，优选该编码序列也与3′非翻译序列可操作连接。3′非翻译序列将包括转录终止序列和聚腺苷酸化序列。3′非翻译区可以由来自土壤杆菌、植物病毒、植物或其它真核基因的侧翼区得到。植物中使用的合适的3′非翻译序列包括花椰菜花叶病毒35S基因、菜豆蛋白种子储存蛋白基因、豌豆核酮糖二磷酸盐羧酶小亚单位E9基因、大豆7S储存蛋白基因、章鱼氨酸合成酶基因和胭脂氨酸合成酶基因的那些。
也使用5′非翻译序列。5′非翻译序列是从5′帽位点延伸到翻译起始密码子的mRNA的一部分。mRNA的这个区域是植物中翻译起始必需的并且在基因表达的调节中起作用。植物中使用的合适的5′非翻译区包括苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒包膜蛋白基因和番茄花叶病毒的那些。
如上指出，DNA构建体可以是载体。该载体可以含有一个或多个允许其在宿主细胞复制的复制系统。自我复制载体包括质粒、粘粒和病毒载体。可供选择地，该载体可以是允许将其整合到编码降解2，4-D的酶的合成DNA序列的宿主细胞染色体的整合载体。该载体期望也具有插入DNA序列的独特限制性位点。如果载体不具有独特的限制性位点，那么它可以被修饰导入或除去限制性位点而使其更适合进一步操作。
本发明的DNA构建体可用于转化任何类型的植物细胞(见下)。遗传标记应该用于选择转化的植物细胞(“选择标记”)。选择标记典型地允许负选择(即抑制不含该选择标记的细胞生长)或筛选该选择标记编码的产物来回收转化细胞。
植物转化最普遍使用的可选择标记基因是新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，分离自Tn5，当它置于植物表达控制信号控制下时，赋予对卡那霉素的抗药性。Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，804803(1983)。另一个普遍使用的可选择标记基因是赋予对抗生素潮霉素的抗药性的潮霉素磷酸转移酶基因。Vanden Elzen等，PlantMol.Biol.，5299(1985)。
赋予对抗生素的抗药性的细菌起源的另外的可选择标记基因包括庆大霉素乙酰基转移酶、链霉素磷酸转移酶转移酶、氨基甙类-3′-腺嘌呤基转移酶和博莱霉素抗药性决定物。Hayford等，Plant Physio.861216(1988)，Jones等，Mol.Gen.Genet.21086(1987)，Svab等，Plant Mol.Biol.14197(1990)，Hille等，Plant Mol.Biol.7171(1986)。其它可选择标记基因赋予对除草剂的抗性，如草甘膦，glufosinate或溴苯腈。Comai等，Nature 317741-744(1985)，Stalker等，Science 242419-423(1988)，Hincbee等，Bio/Technology 6915-922(1988)，Stalker等，J.Biol.Chem.2636310-6314(1988)，和Gordon-Kamm等，Plant Cell 2603-618(1990)。
植物转化的其它可选择标记基因不是细菌起源的。这些基因包括，例如，小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-enolpyruvylshikimate-3-磷酸合成酶，和植物乙酰乳酸合成酶。Eichholtz等，Somatic CellMol.Genet.1367(1987)，Shah等，Science 233478(1986)，Charest等，Plant Cell Rep.8643(1990)，EP 154，204。
筛选推定的转化细胞的普遍使用基因包括β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、荧光素酶和氯霉素乙酰基转移酶。Jefferson，R.A.，Plant Mol.Biol.Rep.5387(1987).，Teeri等，EMBOJ.8343(1989)，Koncz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84131(1987)，De Block等，EMBO J.31681(1984)，绿荧光蛋白(GFP)(Chalfie等，Science 263802(1994)，Haseloff等，TIG 11328-329(1995)和PCT申请WO 97/41228)。鉴定相对罕见的转化事件的另一个方法已经使用编码Zea玉米花色甙着色途径的显性组成型调节剂的基因。Ludwig等，Science 247449(1990)。
根据本发明的另一个方面，对生长素除草剂的耐受性可以用作植物和植物细胞的选择标记。这里使用的“生长素除草剂”是指苯氧基生长素(苯氧基除草剂)，它包括2，4-D，4-氯苯氧基乙酸，4，-氯-2-甲基苯氧基乙酸，2，4，5-三氯苯氧基乙酸，2，4-二氯苯氧基丁酸，4-(2-甲基-4-氯苯氧基)丁酸，2-(4-氯苯氧基)丙酸，2-(2，4-二氯苯氧基)丙酸，2-(2，4，5-三氯苯氧基)丙酸，和这些酸的盐(包括胺盐)和酯。生长素除草剂商业上可获得。见Crop ProtectionReference(Chemical & Pharmaceutical Press，Inc.，New York，NY，11th ed.，1995)。优选的生长素除草剂是2，4-D及其盐(包括胺盐)和酯。“耐受性”指当放置于含有防止未转化细胞生长的生长素除草剂水平的培养基时，转化植物细胞能够生长(存活、增生和再生为植物)。“耐受性”也指在应用抑制未转化植物生长的量的生长素除草剂后，转化植物能够生长。
本领域熟知选择转化植物细胞的方法。简言之，植物细胞群(如外植体或胚胎悬浮培养物)中至少有些植物细胞被包含本发明合成的DNA序列的DNA构建体转化。所得植物细胞群放置于含有选择使得转化植物细胞会生长，而未转化植物细胞不生长的浓度的生长素除草剂的培养基中。生长素除草剂的合适浓度可以根据本领域已知的经验确定。至少在2，4-D的情况下，这个量可以进一步需要成为抑制未转化植物细胞偶然形成芽和允许转化植物细偶然形成芽的量，因为这显然是天然存在的细菌tfdA基因的情况。见美国专利5,608,147和PCT申请WO 95/18862。通常，2，4-D应该以范围从大约0.001mg/l至大约5mg/l培养基的量存在，优选大约0.01mg/l至0.2mg/l培养基。
本领域也已知选择转化植物的方法。简言之，生长素除草剂应用于可能包含一个或多个包含本发明提供降解2，4-D的DNA构建体的转基因植物的植物群。选择生长素除草剂的量使得转化植物生长，并且未转化植物的生长被抑制。抑制的水平应该足以使得转化和未转化植物可很容易区别开来(即抑制应该有统计学显著性)。这种量可如本领域已知的经验确定。也见Crop Protection Reference(Chemical&Pharmaceutical Press，Inc.，New York，NY，第11版，1995)。
基于对生长素除草剂耐受性的选择可用于制备对2，4-D和其它生长素除草剂耐受的植物，这种情况下可能不需要使用另一种选择标记。缺乏分开的选择标记是有优点，既然它将表达的外源基因数量减至最小。
基于对生长素除草剂耐受性的选择也可以用于制备表达其它感兴趣基因的转基因植物。已知很多这种基因并且包括编码商业价值的蛋白的基因和给植物赋予改善的农学性状的基因(见如PCT WO97/41228，其全部公开内容并入这里作为参考)。
本发明的DNA构建体可用于转化各种植物细胞。如果使用分开的选择标记，编码降解2，4-D的酶的合成DNA序列和选择标记可以在相同或不同的DNA构建体上。优选，它们安排在单一DNA构建体上作为转录单位，使得所有编码序列一起表达。而且，当对生长素除草剂的耐受性被用作选择标记时，感兴趣的一种或多种基因和编码降解2，4-D的酶的合成DNA序列可以在相同或不同的DNA构建体上。这种构建体以如上所述相同的方式制备。
合适的宿主细胞包括任何类型的植物细胞(见下)。优选，该植物细胞是正常不降解生长素除草剂的细胞。然而，本发明也可以用于增加生长素除草剂在正常降解这种除草剂的植物中的降解水平。
因此，本发明的“转基因”植物、植物的一部分和植物细胞包括正常不降解生长素除草剂，但已根据本发明被转化使得它们能够降解这些除草剂的植物、植物的一部分和植物细胞，以及这种转化植物、植物的一部分和植物细胞的后代。本发明的“转基因”植物、植物的一部分和植物细胞也包括正常降解生长素除草剂，但已根据本发明被转化使得它们能够降解更多这些除草剂或更有效降解它们的植物、植物的一部分和植物细胞，以及这种转化植物、植物的一部分和植物细胞的后代。
“植物”应该理解为是指能够进行光合作用的单细胞生物或多细胞分化生物，包括藻类、被子植物(单子叶和双子叶)、裸子植物、苔藓植物、蕨类植物和拟蕨类植物。“植物的一部分”是多细胞分化植物的一部分，包括种子、花粉、胚芽、花、果实、芽、叶、根、茎、外植体等。“植物细胞”应该理解为是指多细胞植物的结构和生理单位。因此，术语“植物细胞”是指植物或植物的一部分或来源于植物的任何细胞。本发明包括的细胞的一些实例包括活植物的一部分的分化细胞，培养中的分化细胞，培养中的未分化细胞和未分化组织的细胞如愈合组织或肿瘤。
本领域熟知转化植物细胞的方法。例如，已开发了植物转化的很多方法，包括生物和物理转化方案。见，例如，Miki等，″Proceduresfor Introducing Foreign DNA into Plants″in Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，Glick，B.R.and Thompson，J.E.主编.(CRC Press，Inc.，Boca Raton，1993)67-88页。此外，可获得植物细胞或组织转化和再生植物的载体和体外培养方法。见，例如，Gruber等，″Vectors for Plant Transformation″inMethods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick，B.R.and Thompson，J.E.主编(CRC Press，Inc.，Boca Raton，1993)89-119页。
将表达载体导入植物的最广泛利用的机制是基于土壤杆菌的天然转化系统。根癌土壤杆菌和发根(rhizogenes)土壤杆菌是遗传转化植物细胞的对植物致病的土壤细菌。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。见例如Kado，C.I.，Crit.Rev.Plant.Sci.101(1991)。很多参考文献提供了土壤杆菌介导的基因传递的土壤杆菌载体系统和方法。见例如，Horsch等，Science 2271229(1985)，Hoekema等，Nature 303179(1983)，de Framond等，Bio/Technology 1262(1983)，Jordan等，PlantCell Reports 7281-284(1988)，Leple等，Plant Cell Reports11137-141(1992)，Stomp等，Plant Phys io.921226-1232(1990)，Knauf等，Plasmid 845-54(1982))，Gruber等，前述，Miki等，前述，Moloney等，Plant CellReports 8238(1989)，PCT申请WO 84/02913，WO 84/02919和WO 84/02920，EP 116,718，和美国专利4,940,838，5,464,763，和5,929,300。
通常适用的植物转化方法是微粒介导的转化，其中微粒(microprojectiles)表面携带DNA。用微粒加速到足以穿透植物细胞壁和膜的速度的biolistic装置将表达载体导入植物组织。Sanford等，Part.Sci.Technol.527(1987)，Sanford，J.C.，TrendsBiotech.6299(1988)，Sanford，J.C.，Physio.Plant 79206(1990)，Klein等，Biotechnology 10268(1992)，Klein等，Nature32770-73(1987)。
DNA物理传递给植物的另一个方法是靶细胞的超声处理。Zhang等，Bio/Technology 9996(1991)。可供选择地，脂质体或原生质球融合已经用于将表达载体导入植物。Des hayes等，EMBO J.，42731(1985)，Christou等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 843962(1987)。也已经报道了使用CaCl2沉淀法、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将DNA直接摄取到原生质体。Hain等，Mol.Gen.Genet.199161(1985)和Draper等，Plant Cell Physiol.23451(1982)。也已描述了原生质体和完整细胞和组织的电穿孔。Donn等，In Abstracts ofVIIth International Congresson Plant Cell and Tissue CultureIAPTC，A2-38，53页(1990)；D′Halluin等，Plant Cell 41495-1505(1992)，Spencer等，Plant Mol.Biol.2451-61(1994)，和Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825824(1985)。其它技术包括显微注射(microinjection)(Crossway，Mol.Gen.Genetics，202179-185(1985))，聚乙烯乙二醇转化(Krens等，Nature 29672-74(1982))，用其它实体-小细胞、细胞、溶酶体或其它表面脂质的可溶体进行原生质体的融合(Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 791859-1863(1982))，和美国专利5,231,019中阐明的技术)。
选择后，转化植物细胞被再生到转基因植物中。植物再生技术是本领域熟知的并且包括Handbook of Plant Cell Culture，1-3卷，Evans等，主编.Macmillan Publishing Co.，New York，N.Y.(分别在1983，1984，1984)；Predieri和Malavasi，Plant Cell，Tissue，and Organ Culture 17133-142(1989)；James，D.J.等，J.Plant Physio.132148-154(1988)；Fasolo，F.等，PlantCell，Tissue，and Or gan Culture 1675-87(1989)；Valobra和James，Plant Cell，Tissue，and Organ Culture2151-54(1990)；Srivastava，P.S.，等，Plant Science 42209-214(1985)；Rowland和Ogden，Hort.Science 271127-1129(1992)；Park和Son，Plant Cell，Tissue，and Organ Culture 1595-105(1988)；Noh和Minocha，Plant Cell Reports 5464-467(1986)；Brand和Lineberger，Plant Science 57173-179(1988)；Bozhkov，P.V.等，Plant Cell Reports 11386-389(1992)；Kvaalen和yonArnold，Plant Cell，Tissue，and Organ Culture 2749-57(1991)；Tremblay和Tremblay，Plant Cell Tissue，and Organ Culture 2795-103(1991)；Gupta和Pullman，美国专利5,036,007；Michler和Bauer，Plant Science 77111-118(1991)；Wetzstein，H.Y.等，Plant Science 64193-201(1989)；McGranahan，G.H.等，Bio/Technology 6800-804(1988)；Gingas，V.M.，Hort.Science 261217-1218(1991)；Chalupa，V.，Plant Cell Reports9398-401(1990)；Gingas和Lineberger，Plant Cell，Tissue，and OrganCulture 17191-203(1989)；Bureno，M.A.等，Phys.Plant.8530-34(1992)；和Roberts，D.R.，等，Can.J.Bot.681086-1090(1990)中阐明的那些。
根据本发明可以制备任何类型的转基因植物。这种植物包括例如来自属Fragaria，莲花，苜蓿(medicago)，Onobrychis，三叶草，葫芦巴，豇豆，柑橘，亚麻，Ceranium，木薯，胡萝卜，Arabidopsis，Brassica，萝卜，芥属，颠茄(atropa)，辣椒，曼陀罗，莨菪，Lycopersicon，烟草，茄，Petunia，洋地黄，Majorana，菊苣，向日葵，Lactuca，Bromus，芦笋，金鱼草，Hererocallis，Nemesia，天竺葵，Panicum，Pennisetum，毛莨，Sencia，蛾蝶花，黄瓜，Browalia，甘氨酸，Lolium，玉米，小麦，高粱(Malus)，锦葵，芹，曼陀罗的种和木质双子叶森林树种。尤其是，可以转化目前已知被生长素除草剂损害的阔叶植物(包括豆子、大豆、棉花、豌豆、马铃薯、向日葵、番茄、烟草、果树、观赏植物和树)，使得它们变得对这些除草剂耐受。可转化目前认为对生长素除草剂耐受的其它植物(入玉米、高粱、小谷、甘蔗、芦笋和草)增加它们对这些除草剂的耐受性。
仍在另一个实施方案中，本发明提供了控制转基因植物生长的田地中的杂草的方法。该方法包括给田地应用有效量的生长素除草剂来控制杂草。已知应用生长素除草剂的方法和它们有效控制各种类型杂草的量。见Crop Protection Reference(Chemical &Pharmaceutical Press，Inc.，New York，NY，第11版，1995)。第一次，作为本发明的结果，已经制备了对基本高于农业控制杂草正常使用的生长素除草剂水平耐受的转基因植物。
实施例实施例1编码2，4-D二加氧酶的合成的植物优化序列的产生分离自富氧产碱菌的2，4-D二加氧酶(通常也称作单加氧酶；见上)基因的DNA序列得自GenBank序列数据库(登记号M16730)。由这个DNA序列，确定了单一开放阅读框架(ORF)编码的蛋白的氨基酸序列[SEQ ID NO1]。反映双子叶ORFs的密码子用法表是由GenBank数据库提取的棉花、arabidopsis和番茄的随机cDNA序列组合选择得到的。反映单子叶ORFs的密码子用法表是由也从GenBank数据库提取的玉米的cDNA序列随机选择得到的。下面有表1和表2。使用这些植物特异性的密码子用法表，将细菌2，4-D二加氧酶得到的一级氨基酸序列转换为反映双子叶和单子叶植物密码子优选的DNA编码序列[分别是SEQ ID NOS2和3]。
合成的双子叶和单子叶植物优化2，4-D二加氧酶ORFs[SEQ ID NOS2和3]，接着用于设计能够有效在转基因植物中表达的2，4-D二加氧酶基因。对于双子叶和单子叶版本，这些合成基因分别称为SAD(为双子叶改编的的合成基因)和SAM(为单子叶改编的合成基因)。为了产生可翻译的转录物，一旦基因已构建并插入到植物基因组中，代表来自苜蓿花叶病毒(AMV；Gallie等，Nucleic Acids Res.，158693-8711(1987))的35S转录物的5′非翻译前导序列的5′非翻译前导序列就并入合成基因的设计。此外，编码Cys Ala Gly的标记序列添加到每一版本合成基因的合成编码区的3′末端。最后，为了容易克隆，设计的序列在5′末端包括HindIII-特异性突出和在3′末端包括Sal I-特异性突出。SAD和SAM基因的合成部分的完整设计序列是SEQ ID NO4和5。
为构建所设计合成的SAD和SAM基因的一部分，每个序列分成重叠的寡核苷酸，两条链中每一条的十二个寡核苷酸共得到每个DNA序列的二十四个寡核苷酸。下表3A，3B，4A和4B给出了用于构建合成的SAD和SAM基因的一部分的寡核苷酸的完整列表。使用标准亚磷酰胺化学法，用整合DNA技术，Inc.，Coralville，Iowa合成寡核苷酸。使用基于Sutton等1995在万维网(www.epicentre.com)上公开的使用AmpliligaseTM耐热连接酶(Epicentre TechnologiesInc.，Madison，WI)所述方案的步骤装配合成的DNA分子。使用T4多核苷酸激酶(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)作为每个合成DNA构建体的上和下链寡核苷酸的混合物首先磷酰化寡核苷酸。每种混合物含有10pmol每种寡核苷酸，70mM Tris/HCl pH 7.6，10mM MgCl2，5mM二硫苏糖醇(DTT)，0.1mM ATP，和10单位T4多核苷酸激酶，总体积25μl。混合物在37℃下温育30分钟，随后70℃变性温育10分钟，完成磷酸化。为了退火和连接寡核苷酸，每种反应混合物在热力循环仪中70℃再处理10分钟和随后冷却至65℃10分钟以上的时间。向每种混合物中循序加入65μl水，10μl的10XAmpliligase缓冲液(Epicentre Technologies)和2μl Ampliligase(5单位/μl)，三小时以上的时间温度降至40℃。T在这个时阶段，为了提高克隆效率，从它们各自的在MJ ResearchInc.(Waltham，MA)模型PTC-100热力循环仪中使用Amplitaq GoldTMDNA聚合酶，在制造商Perkin Elmer Life Sciences(Boston，MA)提供的条件下进行的聚合酶链式反应(PCR)的退火/连接反应中回收完整合成的SAD和SAM的DNA序列。用于回收每个序列的PCR引物是AGATCCTTTTTATTTTTAATTTTCTTTC[SEQ ID NO6]，代表AMV前导序列5′末端的28mer并用于SAD和SAM回收PCR反应，和CTCCAGCACACTAAACAACAGCGTC[SEQ ID NO7]，SAD序列3′末端特异性的25mer，和CTCCAGCACACTACACCACC[SEQ ID NO8]，SAM序列3′末端特异性的20mer。如Ausubel等，Current Protocols InMolecular Biology(Green/Wiley Interscience，New York，1989)所述凝胶纯化对应于918bp适当大小的PCR片段并克隆到pUCR19中两个XcmI限制性位点之间，pUCR19是为快速克隆PCR片段而设计的修饰的pUC19载体，使用XcmI消化(O′Mahony and Oliver，PlantMolecular Biology，39809-821(1999))产生的T突出端而产生质粒pUCRsynSAD和pUCRsynSAM。一旦克隆进入这些载体，就测序插入物来证实所设计的合成的SAD和SAM基因的一部分的序列完整性。使用dRhodamine终止循环测序试剂盒(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)根据制造商的指令实施DNA测序。使用PerkinElmer/ABI Prism 310自动序列分析仪分析序列反应。
表1双子叶密码子用法
表2单子叶密码子用法
表3A双子叶寡核苷酸正义链AGCTAGATCCTTTTTATTTTTAATTTTCTTTCAAATACTTCCAG [SEQ ID NO13]ATCCATGTCTGTTGTTGCTAACCCTTTGCATCCTTTGTTCGCTGCTGGAGTTGAGGATATTGATCTCAGAGAAGCATTGG [SEQ ID NO14]GTTCTACTGAGGTGAGAGAAATTGAGAGACTCATGGACGAAAAGTCAGTTCTCGTTTTCAGAGGTCAACCACTCTCACAG [SEQ ID NO15]GATCAACAGATTGCTTTTGCTAGGAATTTTGGACCTTTGGAGGGTGGATTCATCAAAGTGAACCAGAGACCATCTAGGTT [SEQ ID NO16]CAAATATGCTGAACTCGCTGATATCTCTAATGTTTCATTGGATGGTAAGGTGGCACAAAGAGACGCTAGAGAAGTTGTGG [SEQ ID NO17]GAAATTTTGCAAATCAATTGTGGCATTCTGATTCTTCATTCCAACAGCCAGCAGCTAGATATTCTATGTTGTCAGCTGTT [SEQ ID NO18]GTTGTGCCTCCTTCTGGAGGTGATACAGAATTTTGTGATATGAGGGCAGCTTACGATGCTCTCCCAAGGGATTTGCAGTC [SEQ ID NO19]TGAACTCGAGGGATTGAGAGCTGAACATTACGCTTTGAACTCAAGATTTCTCTTGGGAGATACTGATTACTCAGAGGCAC [SEQ ID NO20]AGAGAAACGCTATGCCTCCTGTTAACTGGCCTCTCGTTAGGACTCATGCTGGTTCTGGTAGAAAGTTCTTGTTTATTGGA [SEQ ID NO21]GCACATGCTTCACATGTTGAGGGTCTCCCTGTTGCTGAGGGAAGAATGTTGCTCGCTGAATTGCTCGAACATGCTACTCA [SEQ ID NO22]AAGAGAGTTTGTTTATAGACACAGATGGAATGTTGGTGACTTGGTTATGTGGGATAATAGATGTGTGTTGCATAGAGGTA [SEQ ID NO23]GGAGATATGATATTTCTGCTAGAAGGGAACTCAGAAGGGCTACTACTTTGGATGACGCTGTTGTTTAGTGTGCTGGAG [SEQ ID NO24]
表3B双子叶寡核苷酸非正义链GAACAAAGGATGCAAAGGGTTAGCAACAACAGACATGGATCTGGAAGTATTTGAAAGAAAATTAAAAATAAAAAGGATCT [SEQ ID NO25]TCGTCCATGAGTCTCTCAATTTCTCTCACCTCAGTAGAACCCAATGCTTCTCTGAGATCAATATCCTCAACTCCAGCAGC [SEQ ID NO26]CCAAAGGTCCAAAATTCCTAGCAAAAGCAATCTGTTGATCCTGTGAGAGTGGTTGACCTCTGAAAACGAGAACTGACTTT [SEQ ID NO27]CAATGAAACATTAGAGATATCAGCGAGTTCAGCATATTTGAACCTAGATGGTCTCTGGTTCACTTTGATGAATCCACCCT [SEQ ID NO28]AATGAAGAATCAGAATGCCACAATTGATTTGCAAAATTTCCCACAACTTCTCTAGCGTCTCTTTGTGCCACCTTACCATC [SEQ ID NO29]TATCACAAAATTCTGTATCACCTCCAGAAGGAGGCACAACAACAGCTGACAACATAGAATATCTAGCTGCTGGCTGTTGG [SEQ ID NO30]GTTCAAAGCGTAATGTTCAGCTCTCAATCCCTCGAGTTCAGACTGCAAATCCCTTGGGAGAGCATCGTAAGCTGCCCTCA [SEQ ID NO31]CTAACGAGAGGCCAGTTAACAGGAGGCATAGCGTTTCTCTGTGCCTCTGAGTAATCAGTATCTCCCAAGAGAAATCTTGA [SEQ ID NO32]CCTCAGCAACAGGGAGACCCTCAACATGTGAAGCATGTGCTCCAATAAACAAGAACTTTCTACCAGAACCAGCATGAGTC [SEQ ID NO33]GTCACCAACATTCCATCTGTGTCTATAAACAAACTCTCTTTGAGTAGCATGTTCGAGCAATTCAGCGAGCAACATTCTTC [SEQ ID NO34]GCCCTTCTGAGTTCCCTTCTAGCAGAAATATCATATCTCCTACCTCTATGCAACACACATCTATTATCCCACATAACCAA [SEQ ID NO35]TCGACTCCAGCACACTAAACAACAGCGTCATCCAAAGTAGTA [SEQ ID NO36]
表4A单子叶寡核苷酸正义链AGCTAGATCCTTTTTATTTTTAATTTTCTTTCAAATACTTCCAG[SEQ ID NO37]ATCCATGTCCGTGGTGGCCAACCCACTCCACCCGCTCTTCGCGGCCGGCGTGGAGGATATCGACCTCAGGGAGGCGCTGG [SEQ ID NO38]GCAGCACCGAAGTGCGCGAAATCGAGAGGCTCATGGACGAGAAGAGCGTCCTCGTCTTCCGCGGCCAACCACTCTCACAG [SEQ ID NO39]GATCAACAGATTGCTTTTGCTAGGAATTTTGGACCTTTGGAGGGTGGATTCATCAAGGTGAACCAGCGCCCGTCCAGGTT [SEQ ID NO40]CAAGTACGCTGAACTGGCCGACATCAGCAACGTGTCCCTCGATGGGAAGGTGGCCCAGAGGGACGCTAGGGAAGTTGTGG [SEQ ID NO41]GCAACTTCGCCAACCAACTGTGGCACTCCGATAGCTCTTTCCAACAGCCAGCAGCCAGGTACTCCATGCTGAGCGCCGTC [SEQ ID NO42]GTCGTGCCACCATCCGGCGGTGACACCGAGTTCTGCGATATGCGCGCCGCGTACGACGCCCTCCCGAGGGATCTGCAGAG [SEQ ID NO43]CGAGCTGGAGGGCCTCCGCGCGGAGCACTACGCCCTCAACAGCAGGTTCCTCCTGGGGGACACTGACTACTCCGAGGCCC [SEQ ID NO44]AGAGGAACGCGATGCCACCAGTGAACTGGCCCCTCGTCCGCACCCACGCTGGCAGCGGCCGCAAGTTCCTGTTCATCGGG [SEQ ID NO45]GCCCATGCCTCCCATGTGGAGGGTCTCCCTGTCGCGGAGGGCCGCATGCTCCTGGCCGAGCTCCTGGAGCACGCCACCCA [SEQ ID NO46]ACGCGAGTTCGTCTACCGCCACAGGTGGAATGTCGGCGACCTCGTCATGTGGGATAACCGCTGCGTGCTGCACCGCGGCA [SEQ ID NO47]GGCGCTACGATATCAGCGCGCGCAGGGAACTCAGGCGCGCCACCACCCTCGACGACGCGGTGGTGTAGTGTGCTGGAG[SEQ ID NO48]
表4B单子叶寡核苷酸非正义链GAAGAGCGGGTGGAGTGGGTTGGCCACCACGGACATGGATCTGGAAGTATTTGAAAGAAAATTAAAAATAAAAAGGATCT [SEQ ID NO49]TCGTCCATGAGCCTCTCGATTTCGCGCACTTCGGTGCTGCCCAGCGCCTCCCTGAGGTCGATATCCTCCACGCCGGCCGC [SEQ ID NO50]CCAAAGGTCCAAAATTCCTAGCAAAAGCAATCTGTTGATCCTGTGAGAGTGGTTGGCCGCGGAAGACGAGGACGCTCTTC [SEQ ID NO51]GAGGGACACGTTGCTGATGTCGGCCAGTTCAGCGTACTTGAACCTGGACGGGCGCTGGTTCACCTTGATGAATCCACCCT [SEQ ID NO52]AAAGAGCTATCGGAGTGCCACAGTTGGTTGGCGAAGTTGCCCACAACTTCCCTAGCGTCCCTCTGGGCCACCTTCCCATC [SEQ ID NO53]TATCGCAGAACTCGGTGTCACCGCCGGATGGTGGCACGACGACGGCGCTCAGCATGGAGTACCTGGCTGCTGGCTGTTGG [SEQ ID NO54]GTTGAGGGCGTAGTGCTCCGCGCGGAGGCCCTCCAGCTCGCTCTGCAGATCCCTCGGGAGGGCGTCGTACGCGGCGCGCA [SEQ ID NO55]CGGACGAGGGGCCAGTTCACTGGTGGCATCGCGTTCCTCTGGGCCTCGGAGTAGTCAGTGTCCCCCAGGAGGAACCTGCT [SEQ ID NO56]CCTCCGCGACAGGGAGACCCTCCACATGGGAGGCATGGGCCCCGATGAACAGGAACTTGCGGCCGCTGCCAGCGTGGGTG [SEQ ID NO57]GTCGCCGACATTCCACCTGTGGCGGTAGACGAACTCGCGTTGGGTGGCGTGCTCCAGGAGCTCGGCCAGGAGCATGCGGC [SEQ ID NO58]GCGCGCCTGAGTTCCCTGCGCGCGCTGATATCGTAGCGCCTGCCGCGGTGCAGCACGCAGCGGTTATCCCACATGACGAG [SEQ ID NO59]TCGACTCCAGCACACTACACCACCGCGTCGTCGAGGGTGGTG [SEQ ID NO60]实施例2植物可表达SAD基因的构建对于完整和植物-胜任SAD基因的产生，用XbaI消化并用DNA聚合酶I(Klenow大片段)填充突出端，随后用KpnI消化，首先释放合成序列的5′末端来除去pUCRsynSAD中包含的合成的SAD基因的一部分。这个连接入质粒pProPClSV，来自pKLP36(Maiti和Shepherd，Biochem.Biophys.Res.Com.，244440-444(1998)所述)的含有增强花生褪绿条死病病毒(PC1SV)启动子的pUC19质粒，首先用NcoI切割，用DNA聚合酶I(Klenow大片段)处理填充产生的突出端，和随后用KpnI切割。这个产生的质粒pProPC1SV-SAD，其内有合成的SAD基因一部分，包括5′AMV前导和编码Cys Ala Gly标记的3′区域直接与PC1SV启动子的3′末端连接(图1)。这个质粒作为PC1SV-SAD构建的来源，在导入土壤杆菌进行植物转化前，插入二组分载体进行最后基因构建。
选择两个二组分载体-pPZP211-PNPT-311g7(图2)和pPZP211-PNPT-512g7(图3)进行最后基因构建。这两个载体基于Hajdukiewicz等，Plant Molec.Biol.，25989-994(1994)所述载体的pPZP家族，是pPZP211衍生物，其中新霉素耐药性的新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因由PC1SV启动子驱动和g7 polyA终止序列置于与多克隆位点(MCS，图2和3)相邻。这两个载体间唯一的差异是MCS相对于g7 polyA终止序列的位置。g7 polyA终止序列是来自章鱼氨酸根癌土壤杆菌Ti质粒的章鱼氨酸T-Left的基因7的3′polyA终止信号和分离作为来自pAP2034的EcoRI-SalI片段(Velten和Schell，Nucleic Acids，136981-6998(1985))。
从pProPC1SV-SAD除去PC1SV-SAD序列作为HindIII-SmaI片段并插入pPZP211-PNPT-311g7和pPZP211-PNPT-512g7，它们来自首先用BamHI消化并用DNA聚合酶I(Klenow大片段)处理填充突出端序列，和随后用HindIII消化。这些反应产生两个载体，pPZP211-PNPT-311-SAD(图4)和pPZP211-PNPT-512-SAD(图5)，在PC1SV-NPTII-35SpolyA构建体的两个方向之一，它们含有完全植物可表达SAD基因。执行SAD基因插入植物基因组的这种设计，因为关于在相同质粒中具有两个PC1SV启动子序列对转化和所表达性状的有效传递的影响不确定。将SAD基因放入载体使得PC1SV启动子插入作为直接和反转重复，可以避免消极后果的可能性。
构建后，如上所述对每个载体中的SAD基因进行测序以确保真实度。这个测序显示，在pProPC1SV-SAD的构建中，框架外ATG密码子被导入5′非翻译前导序列。这个ATG密码子的存在将改变转录物的可翻译性，它从SAD基因合成并因此由PCR诱变删除而恢复正常AMV前导序列。修复后，为真实度复核该序列。含框架外ATG的原始SAD遗传标记为SAD1(因为有些转化实验使用这个构建体开始)。该修复的SAD基因称作SAD2并且是用于SAD构建体整合到棉花基因的基因的唯一版本。
实施例3SAD2导入棉花通过如Walker-Peach和Velten，in Plant Molecular BiologyManual，B1节1-19(Gelvin，Shilperoort和Verma，主编，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，The Netherlands，1994))所述的直接转化含SAD2基因的两个二组分载体-pPZP211-PNPT-311-SAD2和pPZP211-PNPT-512-SAD2，各自导入根癌土壤杆菌的EHA 105株(Hood等，Transgenic Research，2208-218(1993))。该构建体随后通过土壤杆菌转染导入来自棉花变种Coker312(Coker Seed Inc.)的子叶外植体。这是通过分离无菌子叶组织(来自表面灭菌种子培养中生长的幼苗)，产生外植体(使用无菌钻孔器)，和将外植体浸入含适当构建体，在28℃生长的EHA 105的48小时培养中来完成的。接着该外植体转移到2MST培养基上(MS培养基+0.2mg/L 2，4-D和0.1mg/L激动素)，随后除去过量的EHA 105。感染的cotyledon组织在转移到T1+KCL培养基(MS培养基+0.1mg/L2，4-D和0.1mg/L激动素+50mg/L卡那霉素硫酸盐和250mg/L头孢噻肟)之前，在2MST培养基上28℃温育2天。一旦形成健康愈合组织，就将其放置于新鲜T1+KCL(含0.05mg/L 2，4-D)进行第二轮选择。六周后，从存活的愈合组织中产生体细胞胚芽，如Trolinder和Goodin，Plant Cell Reports，6231-234(1987)所述制备成熟转基因棉花植物。
共产生111株抗卡那霉素的棉花幼苗(pPZP211-PNPT-311-SAD转化中产生了44株，pPZP211-PNPT-512-SAD2转化中产生了67株)。用PCR分析每个植物中SAD合成编码序列和NPTII编码序列的存在以确保插入DNA的完整性。如上所述实施PCR。用于这个分析的引物是，对于SAD编码区是GGAGTTGAGGATATTGATCTCAGAGAAGCATTG[SEQ ID NO9]和GCGATCTGCTGATCCTGACTC(SEQ ID NO10]，对于NPTII编码区是CGTCAAGAAGGCGATAGAAGG[SEQ ID NO11]和GCTATGACTGGGCACAACAGAC[SEQID NO12]。在卡那霉素处理存活的44株pPZP211-PNPT-311-SAD幼苗中，在卡那霉素处理存活的67株pPZP211-PNPT-512-SAD幼苗中，PCR检测14株阴性。
剩余9 5株生长在温室的盆中直到至少正方期(大约18″高)，然后以1lb/英亩酸等价物喷洒2，4-D胺(United Agri Products，Greeley，CO)。这是应用2，4-D的正常田地速度的两倍。在95株植物中，这种处理后22株存活，很少或没有明显的除草剂损害。这些植物中十一株含pPZP211-PNPT-311-SAD2构建体，11株含pPZP211-PNPT-512-SAD2构建体。每种植物在温室中生长至成熟期。
在22株转基因植物中，仅7株产生了种子。剩余植物明显不结果实。推测这种不育症是棉花很普通的再生程序的作用。在七株可繁殖的植物中，3株含pPZP211-PNPT-311-SAD2构建体，4株含pPZP211-PNPT-311-SAD2构建体。
为了证实插入的合成SAD基因可遗传和为了获得基因插入数量的指示，来自七株可繁殖SAD转基因棉花植物的种子植入已用Peters专业水溶肥料(5-11-26 HYDRO-SOL，补充硝酸钙和硫酸镁提供完全营养称赞；Hummert，St.Louis，MO)饱和的hydroponicrock wool slabs(Hummert，St.Louis，MO)。hydroponic rock wool slabs放在温室的台上，使用非循环水耕法浇水系统使营养维持最佳水平。植物在温室条件(28℃+5℃气温)下生长24天。在这点，取出植物喷洒突冠，以1/2 lb/英亩酸等价物的正常田地速度喷洒2，4-D，维持在突冠中24小时，允许2，4-D挥发，接着放回温室。10-14天后视觉估计处理的作用，下表5描述了结果。
表5
比率″Res″/Sens以实验过程中对2，4-D处理显示有些抗性的植物数量除以显示严重损害或死亡的植物组合数量来计算。从组织再生的Coker 312阴性对照不显示抵抗的有些迹象，因此这些比率不能认为是SAD基因孟德尔遗传的确定估量。然而，所有阴性对照植物确实显示出2，4-D诱导的损害，然而各个含有SAD基因的所有转基因系根本没有显示损害。
用2，4-D对没有显示损害的7株的每一株处理24天，发芽后选择其中五株，取各个新形成叶子标本，每个植物一个，如上所述实施PCR检测。PCR检测每个植物SAD构建体阳性。这些植物进一步生长14天，然后以1/2 lb/英亩酸等价物的正常田地速度再次喷洒2，4-D胺。这种处理后，所有35株植物没有显示损害，然而，所有阴性对照没有幸免于这个喷洒事件。35株植物生长至成熟期，并收集种子。
上文提及的每个参考文献的内容，包括出版物、专利和公开的申请并入这里作为参考。
序列表<110>Oliver，Mel<120>合成的除草剂抗性基团<130>3553-30prov<160>60<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>287<212>PRT<213>富氧产碱菌<400>1Met Ser Val Val Ala Asn Pro Leu His Pro Leu Phe Ala Ala Gly Val1 5 10 15Glu Asp Ile Asp Leu Arg Glu Ala Leu Gly Ser Thr Glu Val Arg Glu20 25 30Ile Glu Arg Leu Met Asp Glu Lys Ser Val Leu Val Phe Arg Gly Gln35 40 45Pro Leu Ser Gln Asp Gln Gln Ile Ala Phe Ala Arg Asn Phe Gly Pro50 55 60Leu Glu Gly Gly Phe Ile Lys Val Asn Gln Arg Pro Ser Arg Phe Lys65 70 75 80Tyr Ala Glu Leu Ala Asp Ile Ser Asn Val Ser Leu Asp Gly Lys Val85 90 95Ala Gln Arg Asp Ala Arg Glu Val Val Gly Asn Phe Ala Asn Gln Leu100 105 110Trp His Ser Asp Ser Ser Phe Gln Gln Pro Ala Ala Arg Tyr Ser Met115 120 125Leu Ser Ala Val Val Val Pro Pro Ser Gly Gly Asp Thr Glu Phe Cys130 135 140Asp Met Arg Ala Ala Tyr Asp Ala Leu Pro Arg Asp Leu Gln Ser Glu145 150 155 160
Leu Glu Gly Leu Arg Ala Glu His Tyr Ala Leu Asn Ser Arg Phe Leu165 170 175Leu Gly Asp Thr Asp Tyr Ser Glu Ala Gln Arg Asn Ala Met Pro Pro180 185 190Val Asn Trp Pro Leu Val Arg Thr His Ala Gly Ser Gly Arg Lys Phe195 200 205Leu Phe Ile Gly Ala His Ala Ser His Val Glu Gly Leu Pro Val Ala210 215 220Glu Gly Arg Met Leu Leu Ala Glu Leu Leu Glu His Ala Thr Gln Arg225 230 235 240Glu Phe Val Tyr Arg His Arg Trp Asn Val Gly Asp Leu Val Met Trp245 250 255Asp Asn Arg Cys Val Leu His Arg Gly Arg Arg Tyr Asp Ile Ser Ala260 265 270Arg Arg Glu Leu Arg Arg Ala Thr Thr Leu Asp Asp Ala Val Val275 280 285<210>2<211>864<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_特征<222>(1)..(864)<223>降解2，4-D的双子叶ORF
<400>2atg tct gtt gtt gct aac cct ttg cat cct ttg ttc gct gct gga gtt 48Met Ser Val Val Ala Asn Pro Leu His Pro Leu Phe Ala Ala Gly Val1 5 10 15gag gat att gat ctc aga gaa gca ttg ggt tct act gag gtg aga gaa 96Glu Asp Ile Asp Leu Arg Glu Ala Leu Gly Ser Thr Glu Val Arg Glu20 25 30att gag aga ctc atg gac gaa aag tca gtt ctc gtt ttc aga ggt caa 144Ile Glu Arg Leu Met Asp Glu Lys Ser Val Leu Val Phe Arg Gly Gln35 40 45cca ctc tca cag gat caa cag att gct ttt gct agg aat ttt gga cct 192Pro Leu Ser Gln Asp Gln Gln Ile Ala Phe Ala Arg Asn Phe Gly Pro50 55 60ttg gag ggt gga ttc atc aaa gtg aac cag aga cca tct agg ttc aaa 240Leu Glu Gly Gly Phe Ile Lys Val Asn Gln Arg Pro Ser Arg Phe Lys65 70 75 80tat gct gaa ctc gct gat atc tct aat gtt tca ttg gat ggt aag gtg 288Tyr Ala Glu Leu Ala Asp Ile Ser Asn Val Ser Leu Asp Gly Lys Val85 90 95gca caa aga gac gct aga gaa gtt gtg gga aat ttt gca aat caa ttg 336Ala Gln Arg Asp Ala Arg Glu Val Val Gly Asn Phe Ala Asn Gln Leu100 105 110tgg cat tct gat tct tca ttc caa cag cca gca gct aga tat tct atg 384Trp His Ser Asp Ser Ser Phe Gln Gln Pro Ala Ala Arg Tyr Ser Met115 120 125ttg tca gct gtt gtt gtg cct cct tct gga ggt gat aca gaa ttt tgt 432Leu Ser Ala Val Val Val Pro Pro Ser Gly Gly Asp Thr Glu Phe Cys130 135 140gat atg agg gca gct tac gat gct ctc cca agg gat ttg cag tct gaa 480Asp Met Arg Ala Ala Tyr Asp Ala Leu Pro Arg Asp Leu Gln Ser Glu145 150 155 160
ctc gag gga ttg aga gct gaa cat tac gct ttg aac tca aga ttt ctc 528Leu Glu Gly Leu Arg Ala Glu His Tyr Ala Leu Asn Ser Arg Phe Leu165 170 175ttg gga gat act gat tac tca gag gca cag aga aac gct atg cct cct 576Leu Gly Asp Thr Asp Tyr Ser Glu Ala Gln Arg Asn Ala Met Pro Pro180 185 190gtt aac tgg cct ctc gtt agg act cat gct ggt tct ggt aga aag ttc 624Val Asn Trp Pro Leu Val Arg Thr His Ala Gly Ser Gly Arg Lys Phe195 200 205ttg ttt att gga gca cat gct tca cat gtt gag ggt ctc cct gtt gct 672Leu Phe Ile Gly Ala His Ala Ser His Val Glu Gly Leu Pro Val Ala210 215 220gag gga aga atg ttg ctc gct gaa ttg ctc gaa cat gct act caa aga 720Glu Gly Arg Met Leu Leu Ala Glu Leu Leu Glu His Ala Thr Gln Arg225 230 235 240gag ttt gtt tat aga cac aga tgg aat gtt ggt gac ttg gtt atg tgg 768Glu Phe Val Tyr Arg His Arg Trp Asn Val Gly Asp Leu Val Met Trp245 250 255gat aat aga tgt gtg ttg cat aga ggt agg aga tat gat att tct gct 816Asp Asn Arg Cys Val Leu His Arg Gly Arg Arg Tyr Asp Ile Ser Ala260 265 270aga agg gaa ctc aga agg gct act act ttg gat gac gct gtt gtt tag 864Arg Arg Glu Leu Arg Arg Ala Thr Thr Leu Asp Asp Ala Val Val275 280 285<210>3<211>864<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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<221)misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>23aagagagttt gtttatagac acagatggaa tgttggtgac ttggttatgt gggataatag60atgtgtgttg catagaggta80<210>24<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(78)<223>基因片段
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<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>26tcgtccatga gtctctcaat ttctctcacc tcagtagaac ccaatgcttc tctgagatca60atatcctcaa ctccagcagc80
<210>27<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>27ccaaaggtcc aaaattccta gcaaaagcaatctgttgatc ctgtgagagt ggttgacctc 60tgaaaacgag aactgacttt80<210>28<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>28caatgaaaca ttagagatat cagcgagttc agcatatttg aacctagatg gtctctggtt60cactttgatg aatccaccct80<210>29<211>80<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>29aatgaagaat cagaatgcca caattgattt gcaaaatttc ccacaacttc tctagcgtct60ctttgtgcca ccttaccatc80<210>30<211>80<212>DNA<213)人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>30tatcacaaaa ttctgtatca cctccagaag gaggcacaac aacagctgac aacatagaat60atctagctgc tggctgttgg80<210>31<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段
<400>31gttcaaagcg taatgttcag ctctcaatcc ctcgagttca gactgcaaat cccttgggag60agcatcgtaa gctgccctca80<210>32<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>32ctaacgagag gccagttaac aggaggcata gcgtttctct gtgcctctga gtaatcagta60tctcccaaga gaaatcttga80<210>33<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>33cctcagcaac agggagaccc tcaacatgtg aagcatgtgc tccaataaac aagaactttc60taccagaacc agcatgagtc80
<210>34<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>34gtcaccaaca ttccatctgt gtctataaac aaactctctt tgagtagcat gttcgagcaa60ttcagcgagc aacattcttc80<210>35<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>35gcccttctga gttcccttct agcagaaata tcatatctcc tacctctatg caacacacat60ctattatccc acataaccaa80<210>36<211>42<212>DNA<213>人工序列
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<221>misc_特征<222>(1)..(42)<223>基因片段<400>36tcgactccag cacactaaac aacagcgtca tccaaagtag ta 42<210>37<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(44)<223>基因片段<400>37agctagatcc tttttatttt taattttctt tcaaatactt ccag44<210>38<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段
<400>38atccatgtcc gtggtggcca acccactcca cccgctcttc gcggccggcg tggaggatat60cgacctcagg gaggcgctgg80<210>39<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>39gcagcaccga agtgcgcgaa atcgagaggc tcatggacga gaagagcgtc ctcgtcttcc60gcggccaacc actctcacag80<210>40<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>40gatcaacaga ttgcttttgc taggaatttt ggacctttgg agggtggatt catcaaggtg60aaccagcgcc cgtccaggtt80
<210>41<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>41caagtacgct gaactggccg acatcagcaa cgtgtccctc gatgggaagg tggcccagag60ggacgctagg gaagttgtgg80<210>42<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>42gcaacttcgc caaccaactgtggcactccg atagctcttt ccaacagcca gcagccaggt 60actccatgct gagcgccgtc80<210>43<211>80<212>DNA<213>人工序列
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<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>43gtcgtgccac catccggcgg tgacaccgag ttctgcgata tgcgcgccgc gtacgacgcc60ctcccgaggg atctgcagag80<210>44<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>44cgagctggag ggcctccgcg cggagcacta cgccctcaac agcaggttcc tcctggggga60cactgactac tccgaggccc80<210>45<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段
<400>45agaggaacgc gatgccacca gtgaactggc ccctcgtccg cacccacgctggcagcggcc 60gcaagttcct gttcatcggg80<210>46<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>46gcccatgcct cccatgtgga gggtctccct gtcgcggagg gccgcatgct cctggccgag60ctcctggagc acgccaccca80<210>47<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>47acgcgagttc gtctaccgcc acaggtggaa tgtcggcgac ctcgtcatgt gggataaccg60ctgcgtgctg caccgcggca80
<210>48<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(78)<223>基因片段<400>48ggcgctacga tatcagcgcg cgcagggaac tcaggcgcgc caccaccctc gacgacgcgg60tggtgtagtg tgctggag 78<210>49<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>49gaagagcggg tggagtgggt tggccaccac ggacatggat ctggaagtat ttgaaagaaa60attaaaaata aaaaggatct80<210>50<211>80<212>DNA<213>人工序列
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<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>50tcgtccatga gcctctcgat ttcgcgcact tcggtgctgc ccagcgcctc cctgaggtcg60atatcctcca cgccggccgc80<210>51<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>51ccaaaggtcc aaaattccta gcaaaagcaa tctgttgatcctgtgagagt ggttggccgc 60ggaagacgag gacgctcttc80<210>52<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段
<400>52gagggacacg ttgctgatgt cggccagttc agcgtacttg aacctggacg ggcgctggtt60caccttgatg aatccaccct80<210>53<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>53aaagagctat cggagtgcca cagttggttg gcgaagttgc ccacaacttc cctagcgtcc60ctctgggcca ccttcccatc80<210>54<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>54tatcgcagaa ctcggtgtca ccgccggatg gtggcacgac gacggcgctc agcatggagt60acctggctgc tggctgttgg80
<210>55<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>55gttgagggcg tagtgctccg cgcggaggcc ctccagctcg ctctgcagat ccctcgggag60ggcgtcgtac gcggcgcgca80<210>56<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>56cggacgaggg gccagttcac tggtggcatc gcgttcctct gggcctcgga gtagtcagtg60tcccccagga ggaacctgct80<210>57<211>80<212>DNA<213>人工序列
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<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>57cctccgcgac agggagaccc tccacatggg aggcatgggc cccgatgaac aggaacttgc60ggccgctgcc agcgtgggtg80<210>58<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段<400>58gtcgccgaca ttccacctgt ggcggtagac gaactcgcgt tgggtggccgt gctccaggag 60ctcggccagg agcatgcggc80<210>59<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(80)<223>基因片段
<400>59gcgcgcctga gttccctgcg cgcgctgata tcgtagcgcc tgccgcggtg cagcacgcag60cggttatccc acatgacgag80<210>60<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(42)<223>基因片段<400>60tcgactccag cacactacac caccgcgtcg tcgagggtgg tg 4权利要求
1.一种包含合成的DNA序列的DNA分子，该合成的DNA序列编码将2，4-二氯苯氧乙酸降解为二氯酚的酶，并且该合成的DNA序列包含编码该酶的天然微生物序列，其中天然微生物序列的至少多数密码子已被植物更优选的密码子取代。
2.权利要求1的DNA分子，其中天然微生物序列中植物最不优选的所有密码子已被植物更优选的密码子取代。
3.权利要求1的DNA分子，其中天然微生物序列至少50％的密码子已被植物更优选的密码子取代。
4.权利要求3的DNA分子，其中天然微生物序列至少80％的密码子已被植物更优选的密码子取代。
5.权利要求1-4任一项的DNA分子，其中天然微生物序列是天然细菌序列。
6.权利要求1-4任一项的DNA分子，其中天然微生物序列的密码子已被双子叶植物更优选的密码子取代。
7.包含SEQ ID NO2的核苷酸序列的权利要求6的DNA分子。
8.权利要求1-4任一项的DNA分子，其中天然微生物序列的密码子已被单子叶植物更优选的密码子取代。
9.包含SEQ ID NO3的核苷酸序列的权利要求8的DNA分子。
10.一种包含合成的DNA序列的DNA构建体，该合成的DNA序列可操作连接植物基因表达控制序列，合成的DNA序列编码将2，4-二氯苯氧乙酸降解为二氯酚的酶，并且该合成的DNA序列包含编码该酶的天然微生物序列，其中天然微生物序列的至少多数密码子已被植物更优选的密码子取代。
11.权利要求10的DNA构建体，其中天然微生物序列中植物最不优选的所有密码子已被植物更优选的密码子取代。
12.权利要求10的DNA构建体，其中天然微生物序列至少50％的密码子已被植物更优选的密码子取代。
13.权利要求12的DNA构建体，其中天然微生物序列至少80％的密码子已被植物更优选的密码子取代。
14.权利要求10-13任一项的DNA构建体，其中天然微生物序列是天然细菌序列。
15.权利要求10-13任一项的DNA构建体，其中天然微生物序列的密码子已被双子叶植物更优选的密码子取代。
16.包含SEQ ID NO2的核苷酸序列的权利要求15的DNA构建体。
17.包含SEQ ID NO4的核苷酸序列的权利要求15的DNA构建体。
18.权利要求10-13任一项的DNA构建体，其中天然微生物序列的密码子已被单子叶植物更优选的密码子取代。
19.包含SEQ ID NO3的核苷酸序列的权利要求18的DNA构建体。
20.包含SEQ ID NO5的核苷酸序列的权利要求18的DNA构建体。
21.权利要求10的DNA构建体，它是载体。
22.权利要求10的DNA构建体，它是质粒。
23.权利要求10的DNA构建体，它是pProPC1SV-SAD。
24.权利要求10的DNA构建体，它是pPZP211-PNPT-311-SAD。
25.权利要求10的DNA构建体，它是pPZP211-PNPT-512-SAD。
26.权利要求10的DNA构建体，其中表达控制序列包括花生褪绿条死病病毒启动子。
27.一种包含合成的DNA序列的转基因植物或植物的一部分，该合成的DNA序列可操作连接植物基因表达控制序列，合成的DNA序列编码将2，4-二氯苯氧乙酸降解为二氯酚的酶，并且该合成的DNA序列包含编码该酶的天然微生物序列，其中天然微生物序列的至少多数密码子已被植物更优选的密码子取代。
28.权利要求27的植物或植物的一部分，其中表达控制序列包括花生褪绿条死病病毒启动子。
29.权利要求27的植物或植物的一部分，其中天然微生物序列中植物最不优选的所有密码子已被植物更优选的密码子取代。
30.权利要求27的植物或植物的一部分，其中天然微生物序列至少50％的密码子已被植物更优选的密码子取代。
31.权利要求30的植物或植物的一部分，其中天然微生物序列至少80％的密码子已被植物更优选的密码子取代。
32.权利要求27-31的植物或植物的一部分，其中天然微生物序列是天然细菌序列。
33.权利要求27的植物或植物的一部分，它是双子叶植物或植物的一部分并且天然微生物序列的密码子已被双子叶植物更优选的密码子取代。
34.权利要求33的植物或植物的一部分，其中一个或多个细胞包含SEQ ID NO2的核苷酸序列。
35.权利要求33的植物或植物的一部分，其中一个或多个细胞包含SEQ ID NO4的核苷酸序列。
36.权利要求27的植物或植物的一部分，它是单子叶植物或植物的一部分并且天然微生物序列的密码子已被单子叶植物更优选的密码子取代。
37.权利要求36的植物或植物的一部分，其中一个或多个细胞包含SEQ ID NO3的核苷酸序列。
38.权利要求36的植物或植物的一部分，其中一个或多个细胞包含SEQ ID NO5的核苷酸序列。
39.权利要求27的植物或植物的一部分，它是棉花植物或植物的一部分。
40.权利要求27的植物的一部分，它是种子。
41.权利要求27的植物的一部分，它是果实。
42.一种控制含有转基因植物的田地中的杂草的方法，该方法包括给田地应用有效控制田地中的杂草的量的生长素除草剂，由于包含合成的DNA序列，该转基因植物对生长素除草剂耐受，该合成的DNA序列可操作连接植物基因表达控制序列，合成的DNA序列编码将2，4-二氯苯氧乙酸降解为二氯酚的酶，并且该合成的DNA序列包含编码该酶的天然微生物序列，其中天然微生物序列的至少多数密码子已被植物更优选的密码子取代。
43.权利要求42的方法，其中生长素除草剂是2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)或2，4-D胺。
44.权利要求42的方法，其中植物是单子叶植物。
45.权利要求42的方法，其中植物是双子叶植物。
46.权利要求42的方法，其中植物是棉花植物。
47.一种选择转化植物细胞的方法，包括提供植物细胞群；用权利要求10的DNA构建体转化该群中至少一些植物细胞；和通过在含有选择使得转化植物细胞增生和未转化植物不增生的浓度的生长素除草剂的培养基中培养所得植物细胞群来选择转化植物细胞。
48.权利要求47的方法，其中生长素除草剂是2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)或2，4-D胺。
49.一种选择转化植物的方法，包括提供植物群，它可以包括一种或多种包含权利要求10的DNA构建体的植物；和通过给植物群应用很多生长素除草剂来选择转化植物，所选择的除草剂的量使得转化植物生长和未转化植物的生长被抑制。
50.权利要求49的方法，其中生长素除草剂是2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)或2，4-D胺。
全文摘要
本发明提供了DNA分子，DNA构建体，包含合成的DNA序列的转基因植物和转基因植物的一部分。该合成的DNA序列编码将2，4－二氯苯氧乙酸(2，4－D)降解为二氯酚的酶。该合成的DNA序列包含编码该酶的天然微生物序列，其中天然微生物的至少多数密码子已被植物更优选的密码子取代。本发明也提供了通过给田地应用生长素除草剂，如2，4－D来控制含有根据本发明的转基因植物的田地中的杂草的方法。本发明进一步提供了使用生长素除草剂选择已用根据本发明的DNA构建体转化的植物或植物细胞的方法。
文档编号C12N15/53GK1622996SQ02826070
公开日2005年6月1日 申请日期2002年10月24日 优先权日2001年10月24日
发明者M·J·奥利弗, J·J·伯克, J·P·费尔滕 申请人:美国政府农业部