一种判别烟草代谢组学新鲜烟叶样品质量的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及烟草化学和分析化学领域。涉及一种判别烟草代谢组学新鲜烟叶样品 质量的方法及检测代谢组学烟草鲜叶质量的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 植物代谢组学是通过考察植物受刺激或扰动后其代谢产物的变化或其随时间的 变化,来研究植物体系的一种技术。通过对植物体内小分子化合物代谢的轮廓分析可直接 获得植物的生理生态变化。在植物代谢组学研究中，样品的质量决定着分析数据的真实可 靠性；而样品的保存条件决定样品质量的好坏。对于不能在取样后立刻进行代谢组学分析 的植物样品，通常建议超低温保存；即在-80°C以下的极低温度环境下保存生物样品。在超 低温环境下植物样品的代谢过程会大大减缓，以此来保持样品的稳定性。
[0003] 烟草作为模式生物和重要的经济作物，近几年来针对烟草的代谢组学研究越来越 多。但由于烟草样品保存不当而导致的质量发生变化而导致代谢物含量失真的情况时有发 生。急需一种简单、快速的分析方法对植物代谢组学研究中的烟草样品质量进行判别。
[0004] 本发明确定的葡萄糖和绿原酸是烟草中的重要代谢物，具有重要的生物学功能。 葡萄糖是一种重要的单糖类物质，可以参与烟草体内物质代谢和能力代谢即为其他生物有 机分子提供碳架或释放能量供应植物生长发育及繁殖等所需。绿原酸是一种烟叶中重要的 多酚类化合物，具有调节植物自身生长、抗病毒、抗逆等生理功能，在烟草的生长、烟草病毒 的防治、烟叶的调制、分级及卷烟香气等方面都起着重要作用。但到目前为止，未曾有人提 出将新鲜烟叶中的葡萄糖和绿原酸的含量用于代谢组学新鲜烟叶样品质量的判别。
【发明内容】
[0005] 本发明涉及一种判别烟草代谢组学新鲜烟叶样品质量的方法及检测代谢组学烟 草鲜叶质量的试剂盒。该方法和试剂盒可对代谢组学研究中所需的新鲜烟叶样品质量进行 判别。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007] 1.收集质量合格的新鲜烟草样本25个以上，取样后放入液氮中冷冻（取样时间不 超过IOmin)，在-80°C超低温冰箱中保存至样本分析。收集质量不合格的新鲜烟草样本25 个以上，由于取样过程中液氮缺乏或常温暴露等原因导致样本不合格。
[0008] 2.新鲜烟叶样品提取液的制备：
[0009] 1)将l-20mg的新鲜烟叶样品浸泡于l-20ml提取溶剂中2分钟以上，取上清 液；所述提取溶剂为乙臆：异丙醇：水=3 :3 : 2v/v/v混合溶液，于提取溶剂中添加有 0· 00025-0. 8mg内标香草酸；
[0010] 2)上清液冻干后用衍生化试剂处理：
[0011] 将0. l_2ml上清液的冻干物加入到20-500 μ 1甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液中 30-60°C反应2分钟以上，甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液中甲氧胺盐酸盐浓度为20mg/mL ;再加 入15-400 μ I N-甲基-N-(三甲基硅基）三氟乙酰胺溶液，在30-60°C反应2分钟以上。
[0012] 3.代谢物的检测方法：
[0013] 气相色谱质谱联用包括安捷伦DB-5MS毛细管柱（30m X0. 25mm X0. 25 μ m)和气相 色谱串联质谱仪；
[0014] 1)气相色谱检测条件：气相色谱质谱联用的分析在岛津QP2010气质联用系统 完成；色谱柱为安捷伦DB-5MS毛细管柱（30mX0. 25mmX0. 25μπι);氦气作为载气，流量 I. 2mL/min ;进样口温度300°C，分流比10 :1 ;程序升温：初始70°C，保持3分钟，5°C /min升 至310°C，保持5分钟，进样量1 μ L。
[0015] 2)质谱检测条件：ΕΙ电离模式（70eV)，传输线温度280°C，离子源240°C，质量扫 描范围33-600m/z，溶剂延迟时间5. 6分钟。
[0016] 4.基于质谱检测数据的判断模型：
[0017] 1)采用气相色谱质谱联用方法，对代谢组学研究中的合格新鲜烟叶样品和不合格 的新鲜烟叶样品进行了代谢组指纹分析，发现并定性17种代谢物对合格样品和不合格样 品的区分有重要贡献并且存在显著性差异；
[0018] 2)使用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归分析方法（文献I :Bewick V，Cheek L, Ball J, Critical care2005, 9 (1):112-118),结合代谢物生理功能在 17 个 差异代谢物中随机组合，回归出代谢物组合的概率预测值。用R〇C(receiver operating characteristic)曲线来评价组合物的灵敏性和特异性。特异性和灵敏度均较高，同时兼顾 简便性（即参与组合的代谢物个数比较少）的代谢物筛选出来用于建立二元逻辑回归判别 模型，最后筛选出葡萄糖和绿原酸。在合格的新鲜烟叶样品中绿原酸的浓度增加，而葡萄糖 的浓度降低。通过二元逻辑回归分析方法，将葡萄糖和绿原酸的含量回归为分类概率预测 值P，构建的二元逻辑回归判别模型如下：
[0019] 方程 1 :
[0020] P = l/(l+e (K*a L*b))
[0021] 其中，a为新鲜烟叶样品提取液中绿原酸的含量，b为新鲜烟叶样品提取液中的葡 萄糖的含量；K、L分别代表二元逻辑回归方程计算过程中获得的绿原酸及葡萄糖的浓度系 数；
[0022] 当绿原酸和葡萄糖的含量以相对峰面积（相对内标，内标为香草酸，内标含量为 0. 25 μ g/mg烟叶干重）计算时，二元逻辑回归判别模型为方程2 :
[0023] p = l/(l+e (2·345*3 °-834*b))
[0024] 其中，a为新鲜烟叶样品提取液中绿原酸对内标的相对峰面积比值，b为新鲜烟叶 样品提取液中的葡萄糖对内标的相对峰面积比值；
[0025] 所得分类概率预测值P在不合格样品中降低，该概率预测值可用于判别代谢组 学研究中的新鲜烟叶样品的质量。在此，基于试验涉及的样本，根据诊断灵敏度和特异性最 佳的原则，即ROC曲线下面积（AUC)最大的原则，该组合物概率预测值的临界值（cut-off 值）设为〇. 5,低于该临界值则有可能为不合格样品。也可以根据实验样品的实际结果通过 二元逻辑回归得到新的方程，并定义该组合物概率预测值的最佳临界值。
[0026] 4.采用新鲜烟叶样本测试本发明的应用效果。分别采用2批次的合格样品和不合 格代谢组学研究中的新鲜烟叶叶片样本。使用上述组合物对合格样本和不合格样本可以得 到很好的区分，灵敏度和特异性及曲线下的面积（AUC)见下表1.
[0027] 表 1
[0028] L0029」 b.佛足试刑笪最住组成：
[0030] a.标准品：葡萄糖，绿原酸和香草酸（均购自sigma公司，纯度大于95% )。葡萄 糖和绿原酸标准品用于对应的新鲜烟叶代谢物的定性和定量标准曲线绘制和代谢物的定 性，香草酸为内标。
[0031] b.用于新鲜烟叶样品预处理的提取液：包含香草酸的乙腈：异丙醇：水=3 :3 : 2V/V/V混合溶液，用于新鲜烟叶样本预处理。香草酸为内标，用于校正绿原酸和葡萄糖；
[0032] c.衍生化试剂：衍生化试剂包含：20mg/mL甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液和N-甲 基-N-(三甲基硅基）三氟乙酰胺溶剂；
[0033] 具体来说，本发明提供下述各项：
[0034] 一种判别烟草代谢组学新鲜烟叶样品质量的方法，
[0035] 1)采用气相色谱质谱联用分析方法，对新鲜烟叶样品提取液中葡萄糖和绿原酸的 含量进行分析；然后利用二元逻辑回归建立烟草代谢组学新鲜烟叶样品质量判别模型；2) 在相同的样本预处理和分析条件下，分析质量未知的烟草样本中葡萄糖和绿原酸的含量， 将含量带入已建立的二元逻辑回归判别模型得到未知样本的分类概率预测值，该概率预测 值可用于判别烟草代谢组学研究中未知新鲜烟叶样本的质量。
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