专利名称：一株具有百草枯抗性的硝化还原假单胞杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株对百草枯(Paraquat, PQ)具有抗性的硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonas nitroreducens)菌株,属于生物技术领域，具体为一株能在含强氧化剂PQ(50mmol/L)或者硝普钠(Sodium nitroprusside, SNP, 200 u mol/L)的培养基上生长的革兰氏阴性短杆菌菌株。该菌株中分离得到一个基因PnPQR，该基因转化到大肠杆菌中，获得对大肠杆菌具有抗性的菌株，通过农杆菌介导法转化烟草，能提高烟草对百草枯的抗性。
背景技术：
除草剂百草枯(paraquat，PQ)是世界范围内应用最为广泛的除草剂之一，目前在 100多个国家的100多种作物中除草(http://www. paraquat, com/Chinese),其应用面积仅次于草甘膦。草甘膦在全球市场近乎垄断的地位，从某种程度上讲，也得益于转基因抗草甘膦作物的培育成功。单一除草剂压力势必引发杂草的抗性问题。培育新型抗除草剂作物既是新的知识产权和市场竞争的需求，也是保护优异除草剂的迫切需要。国际市场上百草枯仅次于草甘膦，但是尚未见抗百草枯作物出现。为了获得丰富百草枯抗性资源，我们从百草枯污染的土壤中筛选抗性微生物，继而从中分离抗性基因。本发明从抗性土壤中分离了 I个百草枯抗性菌株(S3)并对其进行了一些列的生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，对其进行了系统分类。本发明还从S3中分别克隆了 I个基因PnPQR，该基因ORF全长均为1233bp，编码410个氨基酸残基，含有11个跨膜区(TMS)，属于非典型的主要易化超家族(Majorfacilitator superfamily, MFS)。该基因在大肠杆菌BL21菌株中异源表达,能提高大肠杆菌对百草枯的抗性。过量表达的PnPQR转基因烟草植株TO代叶片分析初步表明，该基因能赋予烟草百草枯抗性。
发明内容
本发明的目的是获得一株具有百草枯(Paraquat，PQ)抗性的菌株并了解该菌株的特征特性。本发明的菌株是一种利用稀释平板法从PQ污染的土壤悬浮液中分离得到的具有高抗百草枯(PQ)的硝化还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)菌株,是能够在含强氧化剂 PQ (50mmol/L)或者硝普钠(Sodium nitroprusside, SNP, 200 u mol/L)的培养基上生长的革兰氏阴性，短杆菌，具有硝化还原特性和反硝化还原特性，接触酶阳性、吲哚实验阴性。—株对百草枯(Paraquat, PQ)具有抗性的硝化还原假单胞杆菌菌株,该菌株是利用稀释平板法从PQ污染的土壤悬浮液中分离得到的，该菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 6300。本发明还公开了一种植物表达载体pCAMBIA2301_PnPQR，是通过下述步骤制备(I)从硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonas nitroreducens) CGMCC 6300 中分离百草枯抗性基因PnPQR 以Pl :5’ -CCACTCCGATGTCCAATC-3’ 和 P2 :5’ -TTACCCGCTCGTCCCTAT-3’ 为引物，通过PCR从硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonas nitroreducens) CGMCC 6300中分离序列如SEQ ID NO. I所示的目标基因PnPQR，将PnPQR连接到pMD18_T载体中，构成pMD-PnPQR载体；(2) pCAMBIA2301载体启动子和终止子的添加以pBI121 为模板，应用引物 35SF :5’ -AATTCGATTAGCCTTTTCAATTTCAG-S'和 35SR
5’ -GAGCTCAGGAAGITCAITTCAITTGGAG-3’，扩增 CaM 35S 启动子片段；用 EcoR I 和 SacI 对PCR产物和pCAMBIA2301同时进行双酶切，用T4 Iigase连接成pCAMBIA2301_35S ;再以PBI121 为模板，用引物 NOSF :5’ -GCATGCATCGITCAAACAITTGGCAATAA-3’ 和 NOSR :5’ -GANTCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3’，扩增 NOS 终止子片段，再用 Sph I 和 HindIII 对 PCR 产物和 pCAMBIA2301-35S-N0S 同时进行双酶切，用 T4 Iigase 连接成 pCAMBIA2301-35S_N0S。(3) pCAMBIA2301-PnPQR植物表达载体的构建以pMD-PnPQR 为模板 P3 :5’ -GAAGGATCCTCCACTCCGATGTCCAATC-3’ 和 P4 :5’ -CTAGAGCTCTTACCCGCTCGTCCCTAT-3’为引物，扩增包括PnPQR编码区全长片段，用BamHI和SacI对PCR产物和pCAMBIA2301-35S-N0S载体同时进行双酶切，用T4 Iigase连接成pCAMBIA2301-PnPQR。上述植物表达载体pCAMBIA2301-PnPQR用于烟草的农杆菌介导转化。本发明菌株能在含强氧化剂百草枯PQ(50mmol/L左右)或者硝普钠(Sodiumnitroprusside, SNP, 200 u mol/L左右)的培养基上生长；具有硝化还原特性和反硝化还原特性，接触酶阳性。本发明菌株属硝化还原假单胞菌；对多种抗生素具有抗性。本发明菌株对于抗氧化性、硝化还原和反硝化机制的研究是不可多得的资源。本发明菌株对于杂草的控制和其它农业化学工业的研究也起着重要作用。PnPQR基因在大肠杆菌BL21菌株中异源表达，能提高大肠杆菌对百草枯的抗性；过量表达的PnPQR转基因烟草植株TO代叶片分析初步表明，该基因能赋予烟草百草枯抗性。
图I是S3在含有不同PQ浓度的培养基上的生长曲线。图2是JM109在含有不同PQ浓度的培养基上的生长曲线。图3是S3在含有不同SNP浓度的培养基上的生长曲线。图4是JM109在含有不同SNP浓度的培养基上的生长曲线。图5是S3菌株的16S rDNA序列的系统发生分析。图6是重组菌BL21/pET32a_PnPQR在不同浓度的PQ培养基上的生长。图7是转基因植株(T0代)的百草枯抗性分析。CK :野生型，PQR :转PnPQR植株，I 1000 Ii mol/L, 2 100 u mol/L, 3 :5 u mol/L。菌株S3于2012年6月20保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路I号3号院中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 6300 ;分类命名是硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens。
具体实施例方式I)百草枯(Parauqat, PQ)污染土壤的采集土壤样品(沙壤土，含水量7%)主要采集于南京红太阳集团公司和深圳诺普信农化股份有限公 司，采集地离生产车间约200m，采集深度(T30cm。2)菌株的分离与筛选采用稀释平板分离法(李顺鹏.微生物实验指导[M]. 2003)将土壤悬浮液平铺于含有不同浓度百草枯(0，1，10，20，50臟01/1)的牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿(直径90mm)上，将培养皿置于30°C培养48h，观察生长情况。从土壤悬浮液中成功地分离了 4个抗20mmol/L PQ (百草枯标样购自德国Dr. Ehrenstorfer-Schafers’ s实验室)的单克隆,经过进一步的筛选，选择了 I个抗50mmol/L PQ的单克隆进行纯化,用于进一步的研究工作。此单克隆命名为S3。纯化的菌株在琼脂平板划线，30°C培养36h后，进行观察。S3单克隆菌落直径约
2.1_，浅黄色，圆形半透明，边缘光滑而整齐；革兰氏染色后在光学显微镜下观察，菌体红色，为革兰氏阴性菌，短杆状。结晶紫染色无芽孢。3)分离菌株的生化鉴定使用细菌ATB自动化仪(bio-Merieux ATB Expression, France)鉴定分离菌株的碳源利用情况，具体步骤参考说明书(ID 32 GN V3. I) (ID32 GN试剂盒购自法国梅里埃，Lennart Meri,公司)，并利用Database V3. 0.进行分析。表明它能够分解衣康酸、辛二酸盐、乙酸盐、DL-乳酸盐、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、丙酸盐、癸酸盐、戊酸盐、柠檬酸盐、3-羟基-丁酸盐、4-羟基-苯甲酸盐、L-脯氨酸共13种碳源；不能分解李糖、N-乙酰葡萄糖胺、D-核糖、肌醇、蔗糖、麦芽糖、丙二酸盐、L-丙酸盐、甘露醇、水杨酸、D-蜜二糖、L-岩藻糖、D-山梨酸、组氨酸、5-酮基-葡萄糖酸盐、糖原、3-羟基-苯甲酸盐、2-酮葡萄糖酸盐、L-丝氨酸共19种碳源。常规的生理生化鉴定参考伯氏细菌学鉴定手册(Holt J G.Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology, (9th edition) [M]，1984，500pp),其中包括革兰氏染色试验、厌氧生长试验、接触酶实验、脲酶试验、硝化还原试验、反硝化试验、吲哚反应、硫化氢试验、氧化酶试验等。鉴定结果表明S3是一种兼性厌氧、非葡萄糖发酵型细菌。它的最适生长温度为30° C，4° C和41° C都不能正常生长。其它生理生化特性见表I。表I S3的其它生化特性
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a* “ + ” 阳性；阴性。4)分尚菌株的系统发生树分析按照细菌基因组DNA提取试剂盒(杭州博日科技公司)说明书提取细菌基因组DNA。利用16S rDNA的保守序列设计引物(许敬亮等，中国环境科学，2006，26 (3) :307 310)，16sF:5’-AGTTTGATCCTGGCTCA-3’ (SEQ ID NO. I )，和16sR:5’-TACCTTGTTACGACTT-3’ (SEQID NO. 2)，用于扩增分离菌株的 16s rDNA 基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO. 3)。PCR扩增程序如下94°C预变性5min ;94°C变性40s，53°C退火40s，72°C延伸lmin，共35个循环;最后72°C延伸IOmin0 PCR产物直接利用3730测序仪进行测序(中国上海英杰)，获得1441-bp的核苷酸片段。以此片段为种子，在NCBI进行Blastn比对，下载同源序列进行系统发生分析。下载序列的多序列比对和系统发生分析采用 ClustalX 软件(Thompson et al Nucleic. Acids Res, 1997，25 (24) : 4876 4882)和UPGMA (MEGA version 3. I)程序进行，16sDNA基因的核苷酸序列的系统发生树分析表明(图5), S3与Pseudomonas亲缘关系较近,其中与Pseudomonas nitroreducens的一致性为96%,与其他Pseudomonas的一致性为在87-93%之间，而与Gammaproteobacteria中其它属 的同源性都在77-84%之间。5)发明菌株对百草枯和硝普钠抗性的分析将分离到的菌株划线，挑取单克隆至牛肉膏蛋白胨培养基里，30°C震荡培养至0D600=0. 6时，取40 ii L上述0D600=0. 6的培养物接种于含40mL不同浓度的PQ(0, 0. 05, 0. I, 0. 5, 5, 20 and 50mmol/L)和 SNP (0，20，200 y mol/L)的牛肉膏蛋白胨培养基于IOOmL的三角瓶中，30°C，200rpm震荡培养，取不同培养时间用分光光度计(Beckman)测量0D600值，并用Excel 2003绘制生长曲线图(图I)，以大肠杆菌工程菌株JM109(Novagen)和 BL21 (DE3) (Novagen) (Openwetware. 2008. Citing online sources:E.coli genotypes, 2008,购于上海英潍捷基贸易有限公司)做对照。结果表明，与不含PQ的培养基相比，在对数生长期(即20h前)低浓度PQ (0. 5mmol/L以下)，培养基上S3的生长没有得到明显地抑制，高浓度PQ (20 and 50mmol/L)生长受到了一定程度的抑制，在SNP(20，200 u mol/L)培养基上的生长没有受到明显的影响(图3);然而，工程菌株Escherichiacoli JM109在0. lmmol/LPQ (图2)的培养基上几乎没有生长，在含SNP (20，200 y mol/L)的培养基上它的生长也受到了严重的抑制(图4)。分离菌株的最小抑菌浓度(minimuminhibitory concentrations, MICs)测量米用肉汤稀释法。将菌株接种后震荡培养至0D600=0. 6，然后转接至含30mL培养基的IOOmL三角瓶中使其终浓度为5X105CFU ^mL-U 30°C，200rpm震荡培养60h后用分光光度计(Beckman)测量0D600，0D600彡0. 4记为阳性，0D600<0. 4记为阴性。介于阳性和阴性之间的PQ的浓度被称为MICs。培养基中含如下浓度的PQ : 0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100mmol/L。结果表明S3能够生长在含有低于70mmol/L PQ的培养基上，但是在高于80mmol/L PQ的培养基上，不能生长，因此S3的MIC为70-80mmol/L，而对照E. coli JM109的 MIC 为 0-0. lmmol/L0 S3 的抗性是 E. coli JM109 的 700 倍。6)发明菌株的药敏实验对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、四环素类等的药敏实验采用药敏纸片扩散法，以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)作为质控菌株。具体操作标准参考Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; SeventeenthInformational Supplement (NCCLS，2007)。将细菌培养物涂布于MH琼脂培养基上，培养48h后统计抑菌圈的大小。对于抑菌圈的解释依据NCCLS CLSI对于Pseudomonasaeruginosa 和 non-Enterobacteriaceae 的标准。对于 NCCLS CLSI 没有的抗生素(青霉素G10IU,苯唑青霉素I U g，氨节青霉素10 V- g,头孢氨节30 u g,头孢唑林30 u g,头孢拉定30 u g，头孢呋新30 u g，舒普深75/75 y g，四环素30 y g，强力霉素30 u g，美满霉素30 u g，红霉素15y g，麦迪霉素30ii g，氯霉素30ii g，氯洁霉素g，复方新诺明23. 75/1. 25u g),按如下标准确定抗/感抗性R :抑菌圈直径< 13_，中介I :抑菌圈直径为14-16mm，敏感S :抑菌圈直径> 17mm。从药敏试验的结果来看(表2)，S3对青霉素G (100 y g)，氨基糖苷类抗生素(丁胺卡那30 y g和庆大霉素IOyg)及喹诺酮类(奥复星(氟嗪酸)5 u g，环丙沙星(奔克)和亚胺(配能)硫霉素(IOy g)敏感。而对多数青霉素类(青霉素G除外)、头孢菌素类(除复达欣和菌必治为中间状态)、氯霉素、他唑巴坦/哌拉西林，多粘菌素B，复方新诺明(SMZ/TMP)，痢特灵和万古霉素。
表2药敏纸片法检测分离菌株对抗生素的敏感性
权利要求
1.一株对百草枯具有抗性的硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonas nitroredu_cens)菌株S3，它的保藏号为CGMCC6300。
2.一种植物表达载体pCAMBIA2301-PnPQR，其特征在于通过下述方法制备 (1)从硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonasnitroreducens) CGMCC 6300中分离百草枯抗性基因PnPQR 以 Pl :5’ -CCACTCCGATGTCCAATC-3’ 和 P2 :5’ -TTACCCGCTCGTCCCTAT-3 '为引物，通过PCR从硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonas nitroreducens) CGMCC 6300中分离序列如SEQID NO. I所示的目标基因PnPQR，将PnPQ连接到pMD18_T载体 中，构成pMD-PnPQR载体； (2)pCAMBIA2301载体启动子和终止子的添加以 pBI121 为模板，应用引物 35SF :5’ -GAATTCGATTAGCCTTTTCAATTTCAG-3'和 35SR :5’-GAGCTCAGGAAGITCAITTCAITTGGAG-3’，扩增 CaM35S 启动子片段；用 EcoR I 和 SacI 对 PCR产物和PCAMBIA2301同时进行双酶切，用T4 Iigase连接成pCAMBIA2301_35S ;再以pBI121为模板，用引物 NOSF :5’ -GCATGCATCGITCAAACAITTGGCAATAA-3’ 和 NOSR :5’ -GANTCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3’，扩增NOS终止子片段，再用Sph I和HindIII对PCR产物和PCAMBIA2301-35S-N0S 同时进行双酶切，用 T4 Iigase 连接成 pCAMBIA2301-35S_N0S ； (3)pCAMBIA2301-PnPQR植物表达载体的构建以 pMD-PnPQR 为模板 P3 :5’-GAAGGATCCTCCACTCCG ATGTCCAATC-3’ 和 P4 :5’-CTAGAGCTCTTACCCGCTCGTCCCTAT-3 '为引物，扩增包括PnPQR编码区全长片段，用BamHI和SacI对PCR产物和pCAMBIA2301-35S-N0S载体同时进行双酶切，用T4 Iigase连接成pCAMBIA2301-PnPQR。
全文摘要
本发明涉及一株对百草枯(PQ)具有抗性的硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonasnitroreducens)菌株，菌株编号为S3。它从PQ污染的土壤分离获到，属革兰氏阴性短杆菌，能在含强氧化剂PQ或者硝普钠(SNP)的培养基上生长，具有硝化还原特性和反硝化还原特性，接触酶阳性、吲哚实验阴性；有利于研究细菌抗氧化性、硝化还原和反硝化机制；同时对于杂草的控制和其它农业化学工业的研究也起着重要作用。本发明从S3中克隆了PnPQR基因，该基因编码一个非典型的主要易化超家族(MFS)成员。PnPQR在大肠杆菌BL21菌株中表达，能提高其对百草枯的抗性。过量表达PnPQR的转基因烟草植株具有百草枯抗性。
文档编号C12R1/38GK102747022SQ201210256009
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者倪万潮, 巩元勇, 张香桂, 徐鹏, 束红梅, 沈新莲, 郭书巧 申请人:江苏省农业科学院