IgG1型抗人β₂糖蛋白I单克隆抗体及其制备和应用的制作方法

专利名称：IgG1型抗人β₂糖蛋白I单克隆抗体及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于抗体制备技术范畴，用于相关自身免疫性疾病的研究领域，具体涉及抗人糖蛋白I ( β 2GPI)单克隆抗体的制备、鉴定及应用。背景说明抗磷脂综合征(APS)是以病人体内出现高滴度抗磷脂抗体(APL)为主要特征的一种非器官特异性自身免疫性疾病，可单独发病，也可与其他自身免疫病伴发，尤其是SLE。它的主要临床特点是反复动、静脉血栓形成，多器官缺血及习惯性流产。APL是一组直接针对负电荷磷脂和蛋白辅助因子的非均一性的循环性自身抗体，主要包括狼疮抗凝物(LA)、抗心磷脂抗体(aCL)、抗磷脂酰丝氨酸抗体和抗磷脂酰乙醇胺抗体。研究发现，APL主要识别磷脂结合蛋白，而不是磷脂本身，其中，最重要的磷脂结合蛋白是β2糖蛋白I ( ^2GPI),其 与相应抗体(抗P2GPI)形成复合物，在APS病理过程中发挥重要作用。2005年悉尼举行的国际血栓止血学会(ISTH)会议首次增补抗β 2GPI抗体阳性作为APS实验室诊断指标之
O抗i32GPI/i32GPI复合物可通过激活血管内皮细胞，使其分泌并释放细胞粘附分子、炎性因子、TF等，并可刺激血液单核细胞表达TF。TF为贯穿于细胞膜的单链糖蛋白，是凝血因子YD /Vila的受体，TF/VIIa以复合物的形式激活凝血因子IX、X，从而引发血液凝固。因此,抗P2GPI/P2GPI复合物诱导细胞表达TF是APS血栓形成的重要机理，但具体的作用机制还亟待探讨。本实验室主要从事P2GPI及其抗体刺激单核细胞的胞内信号传导机制的研究，进而阐明抗P2GPI/P2GPI在APS血栓形成机制中的关键作用。在研究中需要使用大量P2GPI及抗P2GPI,但是目前国内市场上还没有抗P2GPI销售，国外此抗体销售价格过高，且购买周期长，制约研究工作的顺利开展。因此，制备抗P2GPI单克隆抗体将大大节约研究的时间成本和经济成本，为这一领域的研究工作顺利进行奠定良好基础，具有重要的应用意义。国内外不同文献报道的正常人血浆中^2GPI的水平稍有差别有200±35m g/L、15(T300m g/L、5(Tl50mgL等，文献报道结果不一有很大的原因在于所用检测方法不同，有的是用ELISA检测，还有的用放射免疫法、免疫电泳等。要想得到统一的结果那么首先得统一检测方法。目前国内还没有检测P2GPI的试剂盒，因此本发明中抗P2GPI单克隆抗体的制备为P2GPI试剂盒的制备奠定了一定基础，以便为国内提供了一个统一检测P2GPI的方法。新近有文献报道，APS患者体内总的P2GPI的水平明显高于健康及其他自身免疫性疾病对照者，且与健康对照组相比，APS患者体内P2GPI含量升高，其血栓形成的风险也相应增加，说明P2GPI的水平与血栓形成的风险有很大的相关性。据还有些文献报道，P2GPI与许多疾病存在一定的关系，不同疾病P2GPI可表现出不同变化，如在肝硬化患者和弥漫性血管内凝血患者体内^2GPI降低，有家族聚集倾向的脑卒中患者i32GPI血清水平的增高，但具体机制不详。综上，本发明所述试剂盒不仅可用于APS患者血栓形成风险的预测而且可以用于中国人群P2GPI水平的普查以及方便研究其与其它疾病之间的关系。本实验室从人血浆中纯化出P2GPI并制备了抗P2GPI多克隆抗体(黄宏亮，周红，俞颖，等.兔抗人β2糖蛋白I多克隆抗体的制备与鉴定[J].临床检验杂志.2009，27(3) :192-194.)，且近年来一直在进行APS致病机制的探讨工作。鉴于单克隆抗体(MAbs)具有特异性强，灵敏度高和易标准化等优点，本发明制备了鼠抗人β 2GPI单克隆抗体并分析其特性，为深入的机制研究奠定了基础。鉴于本实验室已有的抗P2GPI的单抗和多抗，本发明提供了一种人血浆β 2GPI双抗体夹心ELISA检测方法及试剂盒。

发明内容
^2GPI是分子量约45 50KD的糖蛋白，其结构由5个补体调控蛋白样结构区(I V)组成，肝脏是主要合成部位。抗P2GPI/i32GPI复合物在APS病理机制中的作用受到极大关注。鉴于MAbs具有特异性强，灵敏度高和易标准化等优点，本发明的目的在于提供抗^2GPI单克隆抗体，及其在制备检测i32GPI的双抗夹心ELISA测定试剂盒中的应用。本发明所述的IgGl型抗人P2GPI单克隆抗体，是由杂交瘤细胞系AB2-F6分泌，所述杂交瘤细胞系AB2-F6的保藏号为CCTCCNO :C201132。
上述IgGl型抗人β 2GPI单克隆抗体的制备方法是以纯化的人血浆β 2GPI免疫BALB/c小鼠，采用PEG融合技术，间接ELISA法和有限稀释法，制备和筛选杂交瘤细胞。杂交瘤细胞继续扩大培养后注射入BALB/c小鼠制备腹水，经硫酸铵沉淀及Protein G纯化MAbs0秋水仙素阻抑法鉴定杂交瘤细胞株染色体数目，ELISA测定滴度，Ig亚类试剂盒鉴定Ig亚类，Western blot鉴定特异性。本发明用纯化的人血衆β 2gpi免疫后的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后产生的杂交瘤AB2-F6，分泌的单克隆抗体为IgGl/Kappa型，其可与本室制备的P2GPI反应，并与标准抗P2GPI单克隆抗体具有可比性，本发明具有较强的特异性。本发明还公开了所述IgGl型抗人β2糖蛋白I的单克隆抗体在制备人血浆@2糖蛋白I的双抗体夹心ELISA测定试剂盒中的应用。一种人血浆β 2糖蛋白I的双抗体夹心ELISA测定试剂盒，由抗β 2GPI多克隆抗体包被的ELISA板、10%胎牛血清封闭液、抗β 2GPI单克隆抗体、HRP-羊抗鼠IgG、显色液和终止液组成。其中显色液包括A液=H2O2 ；B液四甲基联苯胺(TMB)。上述检测β 2GPI的双抗夹心ELISA测定试剂盒的制备方法是通过对棋盘滴定确定β 2GPI单/多克隆抗体和HRP-羊抗鼠IgG最佳工作浓度、最佳封闭液及封闭时间的确定、最佳抗体温育时间和最佳待检P2GPI浓度的确定，最终建立了 P2GPI的检测方法和试剂盒。本发明所述检测β 2GPI的双抗夹心ELISA测定方法。其步骤包括(I)用包被液CBS将本实验室制备的兔抗人β 2GPI的多克隆抗体稀释到工作浓度(O. OSyg/μ I)加入ELISA板孔内，每孔100 μ I,置于4°C冰箱过夜；(2)弃去孔内液体，用洗涤液PBST冲洗酶标板5次，每次5min,用吸水纸拍干；(3)在各ELISA板孔的孔中加入封闭液10%的胎牛血清250 μ 1，37°C作用2h，按步骤(2)的方法洗涤；(4)用PBS稀释液将稀释后的标准品和待测血浆标本加入包被有多克隆抗体的ELISA板孔中，每孔50 μ 1，37°C作用lh，按步骤(2)的方法洗涤；(5)用PBS稀释液将抗人P2GPI的单克隆抗体稀释到工作浓度(O. 06 μ g/孔)，每孔加入50 μ I, 37°C作用lh,重复步骤(2)的方法洗涤；(6)用洗涤液将HRP-羊抗鼠IgG按工作浓度稀释(按体积比1:10000)，每孔加入50μ 1，37°C作用lh，重复步骤(2)的方法洗涤；(7)在酶标板孔的每孔中加入A、B显色液各50 μ 1，37°C避光显色15min;(8)在酶标板孔的每孔中加入50 μ I终止液终止反应；(9)在酶标仪上于主波长450nm，参考波长630nm处进行双波长比色，测定步骤(8)中的吸光度值(0D值)；(10)绘制标准曲线，计算待检样品中P2GPI的含量。其中步骤(I)所述的ELISA板购自Costar公司的96孔单孔可拆式酶标板； 步骤(I)所述的包被液CBS (O. 05M)配制如下碳酸钠I. 59g，碳酸氢钠2. 93g，用蒸馏水定容至1000ml，用HCL/NaOH调pH至9. 6 ;步骤(2)所述洗涤缓冲液PBST (O. 15M)的配制如下氯化钠8. 0g，氯化钾O. 2g，磷酸氢二钠O. 2g，磷酸二氢钾2. 9g，吐温200. 5ml，用蒸馏水定容至1000ml，调pH至7. 4 ;步骤(3)所述封闭液配制如下洗涤液100ml，胎牛血清10ml，胎牛血清购自GIBCO公司；步骤(4)、(5)所述的抗原、抗体稀释液PBS (O. 01M)的配制如下磷酸二氢钠O. 39g，磷酸氢二钠I. 27g，氯化钠O. 85g，蒸馏水定容至1000ml，调pH至7. 2 ;步骤(6)中所述HRP-羊抗鼠IgG购自博士德生物工程有限公司；步骤(7)所述显色液A、B，以及步骤(8)中所述终止液均来自江苏大学附属医院检验科。


图I为纯化抗β 2GPI单克隆抗体的12%SDS_PAGE分析；图2为杂交瘤细胞染色体分析；图3为MAbs的亚类鉴定(试纸条法)；其中1、3、5为测试带，2、4、6为标准带，检测结果 IgGl/Kappa。图4为抗β 2GPI单克隆抗体特异性分析(Western blot)。图5为人血浆β 2糖蛋白I的双抗体夹心ELISA测定试剂盒的标准曲线。本发明所述的杂交瘤细胞系AB2-F6，于2011年6月14日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO C201132 ;保藏单位地址中国武汉大学。
具体实施例方式下述所使用的P2GPI和抗P2GPI多克隆抗体由发明人制备，制备方法分别见参考文献(黄宏亮，周红，王婷，等.β 2糖蛋白I纯化及其稳定性分析[J].江苏大学学报.2008，18(4) :344-347.)和(黄宏亮，周红，俞颖，等.兔抗人β2糖蛋白I多克隆抗体的制备与鉴定[J].临床检验杂志.2009, 27 (3) : 192-194.)，制备的β 2GPI已鉴定其与标准P2GPI特性相同，制备的抗i32GPI多克隆抗体已经免疫双向扩散试验(IDD)、EL ISA和western-bloting等方法鉴定,具有特异性。实施例1、抗β 2GPI单克隆抗体的制备
(I)小鼠免疫将P2GPI用生理盐水稀释后与等量福氏完全佐剂(Sigma公司)充分乳化后制成免疫原，颈背部皮下多点注射6周龄BALB/c雌性小鼠(50 μ g/只，购自扬州医学比较中心)。以后每隔2周用福氏不完全佐剂(Sigma公司)同等剂量P2GPI乳化后进行加强免疫2 3次(50μ g/只，腹腔注射)。末次加强免疫后7天，小鼠断尾取血，测免疫效价，选择免疫效价高的小鼠于末次加强免疫20天，用生理盐水稀释同等剂量β 2GPI进行尾静脉加强(12. 5 μ g/只)，冲击免疫后3 5天内眼球采血留样用ELISA法测定免疫小鼠血清效价；取脾细胞用于融合。(2)细胞融合和杂交瘤细胞的克隆化SP2/0骨髓瘤细胞(购自上海生物细胞学研究所)于融合前几天扩大培养，挑选对数生长期的细胞用于融合。小鼠摘眼球取血，留血清作阳性对照，小鼠处死后取脾细胞，将脾细胞与SP2/0细胞以4 :1混合于融合管，离心，去上清，沉淀于37°C水浴中滴加lmL50%PEG1450(Sigma公司)，60s内均匀加完，立即于90s内滴加30mL无血清RPMI1640培养基(Gibco公司)终止反应，37°C水浴中静置lOmin，离心去上 清，融合细胞用HAT培养基(Gibco公司)稀释后铺入加有饲养细胞的96孔板(Greiner公司)，置于371，5%0)2培养箱中培养。3天后开始观察克隆生长情况，第4天用HAT培养基半量换液，7天左右用HT培养基(Gibco公司)完全换出孔中HAT培养基。采用间接ELISA法进行筛选，阳性孔转入24孔培养板扩大培养冻存，同时用有限稀释法进行3 4次亚克隆，至阳性率达100%扩大培养，建株保存，该杂交瘤细胞系命名为AB2-F6。(3)间接ELISA法检测抗β 2GPI单克隆抗体时抗原和二抗浓度的确定β 2GPI用O. 05mol/L pH9. 6的碳酸盐溶液稀释后包被酶标板，封闭液为含10%小牛血清(Gibco公司)的O. 02mol/LpH7. 4PBS。以正常鼠血清I :1000作为阴性对照，以β 2GPI免疫鼠的多抗血清I :2000作为阳性对照，用方阵滴定法确定包被抗原和酶标记抗体(羊抗鼠IgG-HRP)的最佳组合。结果判定样品吸光度(A)值大于阴性对照A值的2.1倍判为阳性。最佳条件为I μ g/ml β 2GPI包被酶标板，羊抗鼠IgG-HRP工作浓度I 10000。(4)抗β 2GPI单克隆抗体的制备及纯化取10 12周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡(O. 5mL/只)，7 10天后腹腔注射杂交瘤细胞AB2-F6 (O. 5 I X IO6/只)，7 14天左右抽取腹水，分装后贮存于_70°C冰箱。采用硫酸铵沉淀及Protein G纯化腹水，以SDS-PAGE鉴定纯度。按经验公式蛋白浓度(HigmL)=L 45XA280-O. 74XA26tl计算纯化前后的蛋白浓度和收获率。SDS-PAGE按常规方法操作，12%分离胶，5%浓缩胶，抗体浓度lmgmL，与等量的还原型加样缓冲液混合，IOO0C 5min，25 μ L/孔上样，恒定电流50mA电泳，O. 25%考马斯亮蓝染色，进行蛋白扫描。分析结果见图1，泳道为还原条件下电泳结果，分别为免疫球蛋白重链(约50KD)和轻链(约25KD)，腹水单抗的纯度在90%以上。实施例2、抗β 2GPI单克隆抗体的鉴定(I)单克隆抗体的鉴定用秋水仙素阻抑法获得较多的分裂中期的杂交瘤细胞(AB2-F6)，再经低渗，固定处理后，用10%Giemsa染液染色，镜下观察染色体。如图2显示，杂交瘤细胞染色体数目多于SP2/0细胞的51条，在99-108条之间。用间接ELISA法测定细胞培养上清和腹水效价，间接ELISA法结果显示杂交瘤细胞培养上清和纯化后的腹水单抗对^2GPI的滴度分别为I : 29和I : 215。用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定Ig亚类(按说明书操作)，结果显示细胞分泌IgGl/Kappa型抗体(图3)。用Western blot鉴定抗P2GPI单克隆抗体的特异性用加样缓冲液将β 2GPI配制成lmg/mL，12%SDS_PAGE电泳分离蛋白，再以350mA恒流转印至PVDF膜；膜置于含有5%脱脂牛奶的TBS/T室温封闭Ih ;将膜分别与I :1000稀释的本发明的P2GPI单抗及标准P2GPI单抗(MAB1066，美国Chemicon公司)反应，次日用TBS/T洗涤3次，15min/次，采用HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(I 2000), 37°C孵育lh，TBS/T洗涤3次，15min/次，ECL显色系统定影显色，观察杂交条带。结果见图4 图A为本发明的抗P2GPI单克隆抗体反应结果，结果显示本发明的抗P2GPI单克隆抗体与PVDF膜上约45KD的β 2GPI抗原发生反应，与67KD处的BSA无明显反应，说明单抗只识别β 2GPI，特异性好，图B为购买的标准抗β 2GPI单克隆抗体反应(阳性对照)。(2)杂交瘤细胞株的鉴定复苏液氮罐中冻存6个月的细胞株AB2-F6，经扩大培养后将细胞通过腹腔注射BALB/c小鼠，收集腹水测其对β 2GPI的ELISA滴度，观察杂交瘤细胞分泌抗P2GPI单克隆抗体的稳定性；染色体检查按常规方法进行。结果显示AB2-F6稳定分泌抗P2GPI单克隆抗体，且杂交瘤细胞染色体数目在99-108条之间。实施例3、人血浆β 2GPI双抗体夹心ELISA试剂盒的建立(I)选取合适的封闭剂 将实验分为三组，其中每组又分为不包被只封闭组和包被加封闭组，选取三个常用封闭液用PBST分别配制成5%的脱脂奶粉，2%牛血清白蛋白，10%胎牛血清(FBS)分别封闭以上三组，结果显示，前两个封闭液封闭效果不佳，有较强的非特异性显色，而10%FBS封闭效果较好，几乎没有非特异性显色。(2)抗人β 2GPI单/多克隆抗体及HRP-羊抗鼠IgG最佳工作浓度的确定利用棋盘滴定确定各组分的最佳工作浓度。由于本方法属于间接双抗夹心法，需要确定三个组分的最佳工作浓度，故可分两次棋盘滴定①第一次滴定，固定包被抗体及酶标二抗的浓度以相对保守量O. 05 μ g/ μ I的抗i32GPI多克隆抗体100 μ I包被ELISA板，4°C包被过夜；次日，用PBST洗涤5次，Imin/次，吸水纸拍干；每孔加入250μ 110%FBS，37°C封闭2h ;同上洗涤后，ELISA板横向变化抗原^2GPI 的浓度，分别以 1μ g/μ 1、0· 2μ g/μ 1、0· 04 μ g/μ 1,0. 008 μ g/μ I 和 O. 0016 μ g/μ 15个梯度再加一个空白即只加PBS按每孔50 μ I加入微孔中，37°C温育Ih ;洗涤后，纵向变化单克隆抗体浓度，分另丨J 以 O. 04 μ g/μ 1、0· 02 μ g/ μ 1、0· 01 μ g/ μ 1、0· 005 μ g/μ I、O. 0025 μ g/μ I、0· 0012 μ g/μ I、0· 0006 μ g/μ 17 个梯度再加一个 O 浓度按每孔 50 μ I 力口入微孔，37°C温育Ih ;洗涤后，每孔加入用PBST稀释8000倍的HRP-羊抗鼠IgG50 μ 1，37°C温育O. 5h ;充分洗涤后，每孔加入A、B底物液各5(^1，371反应151^11后，每孔加入5(^1终止液终止反应，酶标仪读取主波长为450nm,参考波长为630nm处的吸光度值。以信噪比(含分析物所测得的OD值与不含分析物所测得的OD值的比值)最大者所对应的抗原抗体浓度为最佳工作浓度。结果见表I表I第一次棋盘滴定结果
权利要求
1.一种IgGl型抗人β2糖蛋白I的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体由杂交瘤细胞系AB2-F6分泌，所述杂交瘤细胞系AB2-F6的保藏号为CCTCC NO :C201132。
2.一种制备IgGl型抗人β2糖蛋白I单克隆抗体的方法，其特征在于包括以下步骤将杂交瘤细胞AB2-F6扩大培养后注射入BALB/c小鼠制备腹水，腹水经硫酸铵沉淀及Protein G纯化后得到抗β2糖蛋白I单克隆抗体。
3.权利要求I所述IgGl型抗人β2糖蛋白I的单克隆抗体在制备人血衆β 2糖蛋白I的双抗体夹心ELISA测定试剂盒中的应用。
4.一种人血浆β2糖蛋白I的双抗体夹心ELISA测定试剂盒，其特征在于由抗i32GPI多克隆抗体包被的ELISA板、10%胎牛血清封闭液、权利要求I所述的抗β 2GPI单克隆抗体、HRP-羊抗鼠IgG、显色液和终止液组成。
全文摘要
本发明涉及一种IgG1型抗人β2糖蛋白I(β2GPI)单克隆抗体的发明。所述IgG1型抗人β2糖蛋白I的单克隆抗体，是由杂交瘤细胞系AB2-F6分泌。所述的单克隆抗体可与本室制备的β2GPI反应，并与标准抗β2GPI单克隆抗体具有可比性，本发明具有较强的特异性。所述单克隆抗体用于制备人血浆β2糖蛋白I的双抗体夹心ELISA测定试剂盒。
文档编号C12N5/20GK102816238SQ20121025600
公开日2012年12月12日 申请日期2012年7月23日 优先权日2011年7月28日
发明者周红, 许国莹, 胥亚, 严金川, 穆原, 王婷, 夏龙飞, 解鸿翔, 刘敬敬, 张晓蕾 申请人:江苏大学