一种用于糖蛋白富集的纳米金掺杂整体材料及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于糖蛋白富集的纳米金掺杂整体材料的制备。所述的纳米金掺杂整体材料是以甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）作为单体，采用原位聚合的方式，得到亲水性聚合物整体材料基质。然后利用基质表面的环氧基团，采用化学衍生法，使基质表面富含巯基，从而，修饰纳米金颗粒；最后在基质中纳米金表面共修饰巯基苯硼酸和巯基乙胺，基于苯硼酸亲和色谱法富集糖蛋白。本发明的材料借助了单体聚乙二醇二丙烯酸酯的亲水性，降低了基质材料对蛋白质的非特异性吸附，提高了富集选择性；并且结合了纳米粒子的高比表面积，提高了富集容量，从而实现了糖蛋白的高效、高选择性富集。
【专利说明】一种用于糖蛋白富集的纳米金掺杂整体材料及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及功能化整体材料用于糖蛋白的富集，具体地说是一种纳米金掺杂整体材料的制备及其用于糖蛋白的高效高选择性富集。
【背景技术】
[0002]蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，据报道目前至少有50%的蛋白质发生了糖基化修饰，其对蛋白质的结构和功能有着重要的影响。然而，由于糖蛋白丰度低、糖肽占总肽段比例小，采用质谱分析检测时往往被高丰度的非糖肽掩盖，若不对糖蛋白进行富集，欲从复杂的生物样品体系中分析糖蛋白几乎是不可能的。文献报道中对糖蛋白常用的分离富集方法主要有凝集素亲和法、硼酸法、酰肼法和亲水作用法等。其中硼酸法是利用苯硼酸能与顺式二羟基化合物在碱性条件下结合形成稳定的络合物，当介质的PH切换为酸性时，络合物解吸释放出顺式二羟基化合物。苯硼酸作为糖蛋白富集的配基具有三个显著的优点:1)共价结合，亲和力强；2)可逆反应，结合/解吸过程容易控制；3)在酸性条件下解吸，解吸条件的质谱兼容，且不会破坏糖链结构，因此，近年来在糖蛋白富集中有很大的应用。
[0003]整体柱由于具有反压小，通透性好，易于实现在线等优势，其应用非常广泛。至今已有成功报道将苯硼酸配基利用共聚或后修饰方法固载于整体材料上，实现了对糖蛋白的有效富集(L Ren, Y Liu, M Dong, Z.Liu.J.Chromatogr.A.2009，1216，8421-8425 ；Z Linj J Pangj H Yang, Z Caij L Zhang, G.Chen, Chem.Commun.2011, 47, 9675-9677 ；Y Liuj L Renj Z Liu.Chem.Commun.2011, 47, 5067-5069;Y Liuj Y Lu，Z Liuj Chem.Sc1.，2012，3，1467-1471)。目前用于硼酸亲和柱的整体材料主要分两类:聚合物基质和硅胶材料基质。其中基于硅胶基质的整体材料比表面积比较大，但由于硅羟基的作用，其对蛋白质存在较强的的非特异性吸附，会影响富集的选择性，且硅胶基质的材料可耐受的PH范围很窄；而采用聚合物基质存在最主要的问题是其比表面积比较小，从而降低富集容量。因此，我们将纳米颗粒掺杂入亲水性整体材料用于富集糖蛋白，可显著提高富集容量及选择性。
【发明内容】
[0004]纳米金具有比表面积大，生物相容性好，稳定性好，易于修饰的优势，将其掺入整体材料中可显著增大比表面积，并且利用其易于修饰的特点可以制备含多种功能基团的整体柱。本发明的目的是提供一种亲水性好的整体基质载体，表面固载纳米金，进一步修饰巯基苯硼酸，从而制备出比表面积大、非特异性吸附小的硼亲和整体柱，用于糖蛋白质的高容量、高选择性富集。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]采用甲基丙烯酸缩水甘油酯和聚乙二醇二丙烯酸酯作为单体，在石英毛细管内进行原位热聚合，得到亲水性聚合物整体基质，经环氧开环反应在聚合物基质表面引入巯基，然后在其表面固载纳米金颗粒，进一步在纳米金颗粒表面共修饰巯基苯硼酸和巯基乙胺。
[0007]所述苯硼酸修饰的纳米金掺杂整体材料的制备，具体步骤如下:
[0008]( I)含环氧基团的亲水性整体材料基质的制备:以甲基丙烯酸缩水甘油酯(质量分数为20-30% (w/w))和聚乙二醇二丙烯酸酯(质量分数为10-20% (w/w))作为单体，加入致孔剂正丙醇和环己醇混合物(质量分数为50-70%(w/w))，以及引发剂偶氮二异丁腈(质量分数占单体总质量的0.05-0.1% (w/w))。震荡超声混匀，通氮气去除溶解氧，灌柱，加热聚合10-24小时后分别用纯甲醇和纯水冲出未反应发的试剂；
[0009](2)基质表面修饰纳米金:向所制备的含环氧基团的毛细管整体柱中连续通入半胱胺溶液，于40-70°C下反应6小时，采用IM Tris-HCl (pH=8)缓冲溶液封尾2_4小时后用纯水冲洗柱子至中性，在室温下连续通入三羧甲基磷酸溶液还原二硫键，用纯水冲洗柱子；最后向富含巯基的整体材料中通入纳米金溶液；
[0010](3)苯硼酸修饰的纳米金掺杂整体材料的制备:向上述制备的纳米金掺杂整体材料中连续通入含4-巯基苯硼酸与巯基乙胺混合物室温下反应1-3天。
[0011]制备的苯硼酸修饰的纳米金掺杂整体材料用于选择性地富集糖蛋白。
[0012]本发明具有如下优点:
[0013]1.本发明采用含聚乙二醇链的亲水性单体聚乙二醇二丙烯酸酯作交联剂，制备的基质材料亲水性好，非特异性吸附小。
[0014]2.本发明采用纳米金掺杂整体材料，大大提高了材料比表面积，修饰上更多的功能基团苯硼酸，使其对糖蛋白的富集选择性高，容量高，且易于实现在线富集。
[0015]3.本发明中共修饰巯基苯硼酸和巯基乙胺，通过B-N间的配位可有效提高材料对糖蛋白的富集能力。
[0016]4.制备的材料刚性，机械强度好，可耐受0_40MPa的压力范围，适用pH范围宽(1-14)。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为苯硼酸修饰的纳米金掺杂整体材料的制备流程图
[0018]图2为制备的含环氧基团的整体材料的扫描电镜图，图A为放大600倍，图B为5000 倍
[0019]图3纳米金掺杂整体材料的EDS元素分析光谱图
[0020]图4苯硼酸修饰的纳米金掺杂整体柱对糖蛋白(辣根过氧化物酶，HRP)与非糖蛋白(牛血清白蛋白，BSA)混合溶液(质量比1:1000)的富集效果图。a)原液；b)上样流出液；c)富集产物。
【具体实施方式】
[0021]下面通过实施例对本发明提供的方法进行详述，但不以任何形式限制本发明。
[0022]实施例1
[0023]1.苯硼酸修饰的纳米金掺杂整体材料的制备
[0024]如图1所示，按如下流程制备:
[0025]I)含环氧基团整体材料基质的制备:按如下配制预聚溶液:240mg甲基丙烯酸缩水甘油酯，160mg聚乙二醇二丙烯酸酯,50mg正丙醇,550mg环己醇,和4mg偶氮二异丁腈。将预聚溶液超声IOmin后，通氮气去除溶液中的溶解氧；导入经过双键修饰的毛细管内，用硅橡胶封住毛细管两端，并在50°C下，引发聚合，聚合时间12小时后分别用纯甲醇和纯水冲出未反应单体和致孔剂；
[0026]2)基质表面修饰纳米金:向所制备的含环氧基团的毛细管整体柱中连续通入IM半胱胺溶液(采用IM NaOH溶液溶解)，于50°C下反应6小时，采用IM Tris-HCl (pH=8)缓冲溶液封尾2小后用纯水冲洗柱子至中性，在室温下连续通入0.25M三羧甲基磷酸溶液(用氨水调pH至中性)还原二硫键，用纯水冲洗柱子；最后向富含巯基的整体材料中通入纳米金颗粒浓度为IO14个/mL的纳米金溶液(纳米金粒径12nm)，至流出液变红为止；
[0027]3)苯硼酸修饰的纳米金掺杂整体材料的制备:向上述制备的纳米金掺杂整体材料中连续通入含4-巯基苯硼酸(IOmM)与巯基乙胺(IOmM)混合物的体积分数为50%乙醇水溶液，室温下反应2天。
[0028]2.所制备的含环氧基团的整体材料的扫描电镜图如图2所示
[0029]3.所制备的纳米金掺杂整体材料金含量是采用EDS元素分析法测定的，所得金质量百分比为37.25% (如图3所示)。
[0030]实施例2
[0031]为考察苯硼酸修饰的纳米金掺杂整体柱对糖蛋白的富集容量，材料用色谱前沿分析法测定。具体测定步骤为，采用IOOmM磷酸盐缓冲溶液作上样缓冲，采用在柱子(实施例1)上没有保留的IM碳酸氢铵溶液测死时间，然后将0.2M HRP连续通入亲和柱中，测得其出峰时间，从而计算出此柱对糖蛋白HRP的吸附容量为2.08mg/g。
[0032]实施例3
[0033]为了考察苯硼酸修饰的纳米金掺杂整体柱对糖蛋白富集的选择性以及非特异吸附，进一步进行干扰实验。
[0034]1.蛋白混合溶液配制
[0035]将糖蛋白(辣根过氧化物酶，HRP)与非糖蛋白(牛血清白蛋白，BSA)按质量比1:1000混合，并溶解于50mM碳酸氢铵缓冲溶液中(pH 10.0),从而制得浓度为10.01mg/mL的蛋白混合溶液。
[0036]2.选择性富集糖蛋白
[0037]取实施例1制备的苯硼酸修饰的纳米金掺杂整体柱(内径150 μ m，长10cm)，采用50mM碳酸氢铵缓冲溶液(pH 10.0)平衡20min。以0.5 μ L.mirT1的流速向柱中通入上述配制的蛋白混合溶液20min,用50mM碳酸氢铵缓冲溶液(pH 10.0)冲洗柱子20min,最后向柱子通入体积分数为0.1%的水溶液进行洗脱，流速为I μ L.mirT1，洗脱时间为20min。分别取原液，上样流出液及洗脱液直接进行MALD1-TOF MS鉴定。
[0038]3.MALD1-TOF MS 分析
[0039]将IyL富集产物与IyL SA基质(20mg/mL芥子酸溶于含0.1%三氟乙酸的60%乙腈溶液)依次点于MALDI靶板上，待样品点干燥后进行质谱鉴定。MALD1-TOF MS实验是在Ultraflex III TOF/TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)上进行，检测时米用线性正离子模式。
[0040]如图4a所示，原液中HRP由于浓度极低，使得质谱响应信号被BSA抑制而无法检测；经苯硼酸修饰的纳米金掺杂整体富集之后，HRP信号强度显著提高(图4c)，且大大消除了干扰蛋白的影响。表明本材料对糖蛋白具有极高的选择性，且仅20ng糖蛋白仍能够得到富集，灵敏度极高。
【权利要求】
1.一种用于糖蛋白富集的纳米金掺杂整体材料，其特征在于: 采用甲基丙烯酸缩水甘油酯和聚乙二醇二丙烯酸酯作为单体，在石英毛细管内进行原位热聚合，得到含有环氧基团的亲水性聚合物整体基质，经环氧开环反应在聚合物基质表面引入巯基，然后通过巯基在其表面修饰纳米金颗粒，进一步在纳米金颗粒表面修饰巯基苯硼酸或共修饰巯基苯硼酸和巯基乙胺。
2.按照权利要求1所述的纳米金掺杂整体材料，其特征在于:含有环氧基团的亲水性聚合物整体材料基质采用甲基丙烯酸缩水甘油酯和聚乙二醇二丙烯酸酯为单体，采用正丙醇和环己醇作为致孔剂，采用偶氮二异丁腈为引发剂，在石英毛细管中原位热聚合而成； 单体甲基丙烯酸缩水甘油酯和聚乙二醇二丙烯酸酯的分别占单体和致孔剂总质量的20-30% (w/w)和10-20% (w/w);致孔剂的用量占单体和致孔剂总质量的50-70% (w/w)； 正丙醇和环己醇的质量比例为1:10-50;引发剂的用量占单体总质量的0.05-0.l%(w/w)； 聚合温度为40-80°C，聚合时间为10-24小时。
3.按照权利要求1所述的纳米金掺杂整体材料，其特征在于: 向含有环氧基团的亲水性聚合物整体材料基质中连续通入半胱胺溶液进行反应；半胱胺采用1-2M NaOH溶液溶解，半胱胺浓度为0.5-2M，反应温度为40_70°C，反应时间为l-12h ； 用0.5-2M Tris-HCl (pH=7_10)缓冲溶液封尾2_4h后用纯水冲洗柱子至中性；然后连续通入三羧甲基磷酸溶液还原二硫键；三羧甲基磷酸(TCEP)溶液用氨水调pH至中性，浓度为0.1-1M，还原二硫键的温度为15-50°C，时间为l-12h ； 再用纯水冲洗柱子后通入纳米金溶液，至流出液变红为止；纳米金溶液中纳米金尺寸为 2_50nm。
4.按照权利要求1所述的纳米金掺杂整体材料，其特征在于: 向制备的纳米金掺杂整体材料中连续通入含4-巯基苯硼酸与巯基乙胺混合物的乙醇水溶液，室温下反应1-3天； 乙醇水溶液中4-巯基苯硼酸的摩尔浓度为0.01-2M，4-巯基苯硼酸与巯基乙胺摩尔比在20:1与1:0之间，乙醇水溶液中乙醇水溶液的体积分数为20-80%。
5.一种权利要求1所述纳米金掺杂整体材料在糖蛋白富集过程中的应用。
【文档编号】C07K1/22GK103877949SQ201210559453
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月19日 优先权日:2012年12月19日
【发明者】张丽华, 吴慈, 梁玉, 杨开广, 张玉奎 申请人:中国科学院大连化学物理研究所