专利名称：：一种普鲁兰酶突变体及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种普鲁兰酶的突变体及其制备方法，特别是利用蛋白质工程的定点突变方法来提高普鲁兰酶的比活力和热稳定性的技术，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术：
：普鲁兰酶(Pullulanase,EC3.2.I.41)是一种脱支酶,能够专一'I"生切开普鲁兰多糖、可溶性淀粉、支链淀粉和一些寡聚糖中的α-1，6_糖苷键，应用于淀粉加工工业中，可极大提高淀粉的利用率和生产效率。普鲁兰酶主要用于和糖化酶复配制备葡萄糖。由于糖化酶对支链糊精中α-1，6_糖苷键切割效率很低，导致糖化时间长、葡萄糖收率低、生产成本高。而普鲁兰酶可以切断淀粉中的分支点，加速糖化反应，缩短糖化反应时间，提高葡萄糖得率，降低糖化酶的使用量，从而达到增加产量、提高设备利用率、降低生产成本的目的。为了与糖化酶更好的协同作用，普鲁兰酶的最适pH、温度和热稳定性是其能否应用于淀粉糖化生产的关键。工业生产中为了发挥糖化酶的最大效率，减少糖化过程中染菌几率，糖化过程一般在高温、低pH值下进行，糖化过程温度和pH控制在60°C和pH4.5，糖化时间一般48h左右。因此，普鲁兰酶必须具备在60°C和pH4.5条件下保留较高的活性和良好的稳定性才能满足糖化过程的需要。近年来国内外学者把普鲁兰酶的开发研究作为非常重要的研究主题。国外学者从极端嗜热微生物中分离出具有可以耐受接近100°C高温的普鲁兰酶，但是这些酶往往只有在PH6.O以上才具有较高的活性。国内主要研究了产普鲁兰酶野生菌的筛选鉴定、重组菌构建、发酵条件优化以及在淀粉原料酶解中的应用。苏品等实现了来源于Thermotogamaritima的普鲁兰酶编码基因在枯草芽孢杆菌中的成功表达，该酶最适温度90°C，最适pH6.0，发酵酶活可达89.lU/mL(ZheSu,Fu-PingLu，QiangGaojXiao-GuangLiujBin-ZheWang,TaoNiu.CloningandexpressionofathermostablepullulanasegenefromThermotogamaritimaMSB8inBacillussubtilisWB600.2010全国生物材料大会论文集，2010,141-144.)。目前能够与糖化酶进行较好配合的商品化淀粉脱支酶主要是美国杰能科公司的OptimaxL-1000。我国虽然对普鲁兰酶进行了大量的研究，但是还没有实现该酶的工业化生产，仍然依赖进口。发明人前期克隆并表达了来源于脱支芽孢杆菌(Bacillusderamifican)的普鲁兰酶(NCBI登录号AX203845)，该酶最适pH4.5，最适温度55°C，在pH4.5、60°C条件下半衰期为23h。通过与糖化酶复配应用实验，发现其能够与糖化酶复配并提高葡萄糖得率。但是该酶在最适温度和热稳定性还不能完全满足糖化过程的需要，且催化效率偏低。因此，进一步提高该酶的最适温度、热稳定性及催化效率将赋予其在工业上更好的应用潜能。
发明内容本发明所要解决的一个技术问题是提供一种普鲁兰酶的突变体，包括含有括一个、两个或三个相对于脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶活性氨基酸残疾的取代，与亲本普鲁兰酶相比有更高比活力和热稳定性。所述脱支芽孢杆菌普鲁兰酶的亲本基因与NCBI数据库中的脱支芽孢杆菌普鲁兰酶一致(登录号AX203845)。所述的突变体是将亲本普鲁兰酶基因中第437位的天冬氨酸(Asp)突变成了组氨酸(His)，命名为D437H;将普鲁兰酶基因中第503位的天冬氨酸(Asp)分别突变成了精氨酸(Arg)，苯丙氨酸(Phe)，色氨酸(Trp)或酪氨酸(Tyr)分别命名为D503R，D503F,D503W及D503Y;将普鲁兰酶基因中第589位的谷氨酸(Glu)突变成了酪氨酸(Tyr)，命名为E589Y。所述的突变体是将单突变体酶D437H基因中第503位的天冬氨酸(Asp)突变成了苯丙氨酸(Phe)，色氨酸(Trp)或酪氨酸(Tyr)，分别命名为D437H/D503F，D437H/D503W,D437H/D503Y;将单突变体酶D437H基因中第589位的谷氨酸(Glu)突变成了酪氨酸(Tyr)，命名为D437H/D589Y。所述的突变体是在双突变体酶D437H/D503Y基因中第589位的谷氨酸(Glu)突变成了酪氨酸(Tyr)，命名为D437H/D503Y/D589Y。本发明所要解决的的另一个技术问题是提供提高来源于脱支芽孢杆菌普鲁兰酶(NCBI登录号AX203845)突变体的比活和热稳定性的制备方法，包括如下步骤I)在脱支芽孢杆菌普鲁兰酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，设计定点突变的突变引物，以携带普鲁兰酶基因的载体为模板进行定点突变并构建含突变体的质粒载体；2)将突变质粒转化进宿主细胞；3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化普鲁兰酶突变体D437H、D503R,D503F,D503W、D503Y、E589Y、D437H/D503F、D437H/D503W,D437H/D503Y、D437H/D589Y及D437H/D503Y/D589Y。所述质粒载体为PUC系列，PET系列，或PGEX中的任——种。所述的宿主细胞包括细菌、酵母和真菌细胞，其也为本发明要求保护的范围。所述的细菌为革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。本发明构建了十一个有意义的突变体，实现了普鲁兰酶比活力和热稳定性的提高。单突变体酶的比活力均有所提高，其中D437H、E589Y和D503Y比活力提高最多，分别达到411.3,425.6和452.8U/mg。双突变体D437H/D503Y、D437H/D589Y和三突变体D437H/D503Y/D589Y比活分别为430.8,415.9和421.5U/mg。在ρΗ4·5，60度的水浴中野生型酶的半衰期为2011，0437!^589￥、0503￥半衰期为4011左右，双突变体0437!1/1)503￥、0437!1/1)589￥和三突变体D437H/D503Y/D589Y半衰期都超过70h。其中D437H/D503Y和D437H/D503Y/D589Y热稳定性最好。突变体比野生型普鲁兰酶更适合应用于工业化的淀粉糖化过程。图I野生型普鲁兰酶和突变型酶的热稳定性。具体实施例方式实施例I:重组菌构建根据NCBI上登录的pulA的基因序列(NCBI登录号AX203845)，采用化学全合成方法合成淀粉脱支酶基因序列pulA。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b(+)，带有T7启动子。将pET20b(+)质粒和含有pulA基因的质粒分别进行NcoI和HindIII双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产物转化E.coliJM109感受态细胞，经37°C培养8h，挑转化子在含有100mg/L氨苄青霉素液体的LB中振荡培养，提取质粒，酶切验证得到表达质粒pulA/pET20b(+)。将质粒pulA/pET20b(+)转化E.coliBL21(DE3)宿主菌，涂布含氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板上，37°C培养8h，命名为pulA/pET20b(+)/BL21(DE3)。挑单菌落至液体LB中，37°C培养过夜，保存甘油管。实施例2:突变体的制备。(I)单突变来源于B.deramificans的普鲁兰酶的六种单突变体酶D437H，D503R,D503F,D503W,D503Y及E589Y在不同来源普鲁兰酶序列比对分析的基础上，对脱支芽孢杆菌普鲁兰酶蛋白结构进行模拟及理性分析，再结合普鲁兰酶热动力学分析的结果，发现了脱支芽孢杆菌普鲁兰酶分子中三个对该酶热稳定性具有潜在影响的氨基酸位点(Asp437、Asp503和Glu589)。将普鲁兰酶基因中第437位的天冬氨酸(Asp)突变成了组氨酸(His)，命名为D437H;将普鲁兰酶基因中第503位的天冬氨酸(Asp)分别突变成了精氨酸(Arg)，苯丙氨酸(Phe)，色氨酸(Trp)或酪氨酸(Tyr)分别命名为D503R，D503F，D503W及D503Y;将普鲁兰酶基因中第589位的谷氨酸(Glu)突变成了酪氨酸(Tyr);突变体相比于野生型普鲁兰酶具有更高的比活力和热稳定性。六种单突变体酶D437H，D503R,D503F,D503W,D503Y及E589Y的制备方法，根据B.deramificans普鲁兰酶基因序列，分别设计并合成引入D437H，D503R,D503F,D503W,D503Y或E589Y突变的引物，对普鲁兰酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列，分别鉴别出第437位Asp密码子变成His密码子,第503位Asp密码子分别变成Arg,Phe,Trp或Tyr密码子的突变体，第589位Glu密码子变成Tyr密码子。将突变体基因置于适当的表达载体中并导入枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌或大肠杆菌中进行表达，得到单突变普鲁兰酶。单突变D437H，D503R,D503F,D503W,D503Y及E589Y的定点突变利用快速PCR技术，以表达载体pulA/pET-20b(+)为模板，引入D437H突变的定点突变引物为正向引物5’-ATCTATGAAATGCATGTCCGTGACTTT-3’(下划线为突变碱基)反向引物5’-AAAGTCACGGACATGCATTTCATAGAT-3’(下划线为突变碱基)引入D503R突变的定点突变引物为正向引物5’-GATCCAACCCAACGTAATTGGGGTTAT-3’(下划线为突变碱基)反向引物5’-GTAACCCCAGTTACGTTGGGTCGGATC-3’(下划线为突变碱基)引入D503F突变的定点突变引物为正向引物5’-GATCCAACCCAATTTAATTGGGGTTAT-3’(下划线为突变碱基)反向引物5’-GTAACCCCAGTTAAATTGGGTCGGATC-3’(下划线为突变碱基)引入D503W突变的定点突变引物为正向引物5’-GATCCAACCCAATGGAATTGGGGTTAT-3’(下划线为突变碱基)反向引物5’-GTAACCCCAGTTCCATTGGGTCGGATC-3’(下划线为突变碱基)引入D503Y突变的定点突变引物为正向引物5’-GATCCAACCCAATATAATTGGGGTTAT-3’(下划线为突变碱基)反向引物5’-GTAACCCCAGTTATATTGGGTCGGATC-3’(下划线为突变碱基)引入D589Y突变的定点突变引物为正向引物5’-GGTACTGGAAATGAAATTGCAGCCGAA-3’(下划线为突变碱基)反向引物5’-TTCGGCTGCAATTTCATTTCCAGTACC-3’(下划线为突变碱基)PCR反应体系均为5XPSbuffer10μL,dNTPsMix(2.5mM)4μL，正向引物(10μΜ)IμL，反向引物(10μΜ)IμL，模板DNAIμL,PrimeStarHS(5U/μL)O.5μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件均为94°C预变性4min;随后进行30个循环(98°CIOs,58。C5s，72。C6min);72。C继续延伸lOmin。PCR产物经DpnI(Fermentas公司)消化，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养，后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，所有突变质粒均测序正确。(2)双突变B.deramificans普鲁兰酶的四种双突变体酶D437H/D503F，D437H/D503W,D437H/D503Y或D437H/D589Y:将单突变体酶D437H基因中第503位的天冬氨酸(Asp)突变成了苯丙氨酸(Phe)，色氨酸(Trp)或酪氨酸(Tyr)，分别命名为D437H/D503F，D437H/D503W,D437H/D503Y;将单突变体酶D437H基因中第589位的谷氨酸(Glu)突变成了酪氨酸(Tyr)，命名为D437H/D589Y，突变体相比于野生型普鲁兰酶具有更高的比活力和热稳定性。四种双突变体酶D437H/D503F，D437H/D503W,D437H/D503Y或D437H/D589Y的制备方法，以单突变体酶D437H编码基因为模板，分别设计并合成引入D437H，D503R,D503F,D503W或D503Y突变的引物，对单突变体酶D437H编码基因进行定点突变，测定序列，鉴别出503位的Asp突变成Arg，Phe,Trp或，Tyr的突变体。将突变体基因置于适当的表达载体中并导入枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌或大肠杆菌中进行表达，得到双突变普鲁兰酶突变体。双突变D437H/D503F，D437H/D503W,D437H/D503Y和D437H/D589Y，的定点突变利用快速PCR技术，以表达载体D437H/pET-20b(+)为模板，引入D503F突变的定点突变引物为正向引物5’-GATCCAACCCAATTTAATTGGGGTTAT-3’(下划线为突变碱基)反向引物5’-GTAACCCCAGTTAAATTGGGTCGGATC-3’(下划线为突变碱基)引入D503W突变的定点突变引物为正向引物5’-GATCCAACCCAATGGAATTGGGGTTAT-3’(下划线为突变碱基)反向引物5’-GTAACCCCAGTTCCATTGGGTCGGATC-3’(下划线为突变碱基)引入D503Y突变的定点突变引物为正向引物5’-GATCCAACCCAATATAATTGGGGTTAT-3’(下划线为突变碱基)反向引物5’-GTAACCCCAGTTATATTGGGTCGGATC-3’(下划线为突变碱基)引入D589Y突变的定点突变引物为正向引物5’-GGTACTGGAAATGAAATTGCAGCCGAA-3’(下划线为突变碱基)反向引物5’-TTCGGCTGCAATTTCATTTCCAGTACC-3’(下划线为突变碱基)PCR反应体系、反应条件及突变基因的测序方法同单突变体的方法。(3)三突变B.deramificans普鲁兰酶的三突变体酶D437H/D503Y/D589Y:将双突变体酶D437H/D503Y基因中第589位的谷氨酸(Glu)突变成了酪氨酸(Tyr)，命名为D437H/D503Y/D589Y，突变体相比于野生型普鲁兰酶具有更高的比活力和热稳定性。三突变体酶D437H/D503Y/D589Y的制备方法，以双突变体酶D437H/D503Y编码基因为模板，用引入D589Y突变的引物，对双突变体酶D437H/D503Y编码基因进行定点突变，测定序列，鉴别出589位的谷氨酸(Glu)突变成了酪氨酸(Tyr)的突变体。将突变体基因置于适当的表达载体中并导入枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌或大肠杆菌中进行表达，得到三突变普鲁兰酶突变体。三突变D437H/D589Y/D589Y的定点突变利用快速PCR技术，以表达载体D437H/D503Y/pET-20b(+)为模板，引入D589Y突变的定点突变引物为正向引物5’-GGTACTGGAAATGAAATTGCAGCCGAA-3’(下划线为突变碱基)反向引物5’-TTCGGCTGCAATTTCATTTCCAGTACC-3’(下划线为突变碱基)PCR反应体系、反应条件及突变基因的测序方法同单突变体的方法。(4)突变体酶的表达与纯化挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的阳性单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)生长810h，按5%接种量将种子发酵液接到TB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素);大肠杆菌在30°C摇床培养至0D_=0.6，加入O.OlmM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25°C摇床继续培养发酵50小时后，将发酵液于4°C、IOOOOg离心IOmin除菌体,收集离心上清液。调节普鲁兰酶突变体的发酵上清液pH到4.5，置于水浴锅中55°C热处理I小时，4°C、IOOOOg离心20min，收集上清液。往上清液中缓慢加入70%的(NH4)2SO4,4°C放置盐析过夜。4°C、IOOOOg离心20min,收集沉淀。用20mmol/L磷酸缓冲液复溶沉淀后,在20mmol/L磷酸缓冲液中透析过夜，期间更换2-3次透析缓冲液，通过O.22μm膜过滤后制成上样样品。采用AKTA蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化，整个纯化过程在层析柜中进行，控制温度为4°C。阴离子交换色谱纯化步骤⑴平衡用5倍体积的20mmol/L磷酸缓冲液平衡DEAE阴离子交换色谱柱；(2)上样预先处理好的样品以lmL/min的流速上样；(4)洗脱，流速I.OmL/min，进行梯度洗脱，检测波长为280nm，分部收集含普鲁兰酶酶活的洗脱液；活力组分在50mMpH4.5醋酸缓冲液中透析过夜后，分别得到纯化突变体酶D437H，D503R,D503F,D503W,D503Y,D437H/D503R,D437H/D503F,D437H/D503W及D437H/D503Y。实施例3:本实施例说明酶活分析。I)酶活测定方法普鲁兰酶酶活性的测定采用3，5_二硝基水杨酸发(DNS法)。普鲁兰酶在一定条件下，催化水解普鲁兰糖生成还原糖，3，5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原为显棕红色的氨基络合物，在一定范围内其颜色的深浅与还原糖的量成正比，故可以在540nm的波长下进行比色，计算酶活。酶活单位定义在上述条件下，每分钟催化产生Iymol葡萄糖的酶量作为一个活力单位。酶活力测定步骤A.预热取2ml的O.5%普鲁兰溶液(50mMpH4.5醋酸bufffer)于试管中，置于60°C水浴锅预热IOmin左右，B.反应加入O.Iml样品酶液,振荡混勻,准确计时IOmin,加入3mlDNS混勻,放入冰水中终止反应,沸水浴7min,冷却。C.测量向上述反应体系中加入蒸懼水并定容至15ml的,混勻。在540nm下测量其吸光值并计算酶活力。2)比酶活比较实验结果列于表1，将突变体纯酶与野生型纯酶相比，可以发现单突变体酶的比活力均有所提高，其中D437H、E589Y和D503Y比活力提高最多，分别达到411.3,425.6和452.8U/mg0双突变体D437H/D503Y、D437H/D589Y和三突变体D437H/D503Y/D589Y比活分别为430.8,415.9和421.5U/mg。表I权利要求1.一种普鲁兰酶突变体，其特征在于包括一个、两个或三个相对于脱支芽孢杆菌普鲁兰酶活性氨基酸残基的取代，所述氨基酸与普鲁兰酶的热稳定性相关。2.权利要求I所述的突变体，其特征在于所述氨基酸分别为第437位的天冬氨酸、第503位的天冬氨酸或第589位的谷氨酸。3.根据权利要求I或2所述的突变体，其特征是在普鲁兰酶基因中第437位的天冬氨酸突变成组氨酸，命名为D437H;普鲁兰酶基因中第503位的天冬氨酸分别突变成精氨酸，苯丙氨酸，色氨酸或酪氨酸分别命名为D503R，D503F,D503W及D503Y;普鲁兰酶基因中第589位的谷氨酸突变成酪氨酸，命名为E589Y。4.根据权利要求3所述的突变体，其特征在于在单突变体D437H基因中第503位的天冬氨酸突变成苯丙氨酸，色氨酸或酪氨酸，分别命名为D437H/D503F，D437H/D503W,D437H/D503Y;单突变体D437H基因中第589位的谷氨酸突变成酪氨酸，命名为D437H/D589Y。5.根据权利要求4所述的突变体，其特征在于在双突变体酶D437H/D503Y基因中第589位的谷氨酸突变成酪氨酸，命名为D437H/D503Y/D589Y。6.权利要求I所述的突变体的制备方法，包括如下步骤1)在脱支芽孢杆菌普鲁兰酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带普鲁兰酶基因的载体为模板进行定点突变并构建含突变体的质粒载体；2)将突变质粒转化进宿主细胞；3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化普鲁兰酶突变体。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任--种。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述宿主细胞为细菌、酵母和真菌细胞。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述细菌为革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。全文摘要本发明公开了一种具有高比活和高热稳定性普鲁兰酶突变体及其制备方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明通过定点突变提高了普鲁兰酶比活力和热稳定性，提供了能够使来源于脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶催化比活力及热稳定性都得到提高的突变方案。所述普鲁兰酶突变体，至少以下性质之一发生改变1)最适反应温度提高；2)在pH4.0-5.0热稳定性提高；3)在pH4.0-5.0比活力提高。这些突变体比野生型普鲁兰酶更适用于淀粉糖化生产过程。文档编号C12N9/44GK102876650SQ20121025680公开日2013年1月16日申请日期2012年7月23日优先权日2012年7月23日发明者吴敬,陈晟,段绪果,陈坚申请人:江南大学