Fgf21突变体及其用途的制作方法

专利名称：Fgf21突变体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码FGF21突变多肽的核酸分子，FGF21突变体多肽，包含FGF21突变 多肽的药物组合物，以及使用所述核酸、多肽或者药物组合物治疗代谢紊乱的方法。
背景技术：
FGF21属于成纤维细胞生长因子(FGF)亚族的分泌多肽，所述成纤维细胞生长因 子(FGF)亚族包括FGF19、FGF21和FGF23(Itoh等，2004，1'代11(1 Genet. 20 :563_69)。FGF21 是一种非典型的FGF，其是独立于肝素，并在葡萄糖、脂类调控和能量代谢中作为激素发挥 功能。FGF21作为肝脏分泌因子分离自肝脏cDNA文库。其在肝脏和胰脏中高度表达，也 是FGF家族主要在肝脏表达的唯一成员。过表达FGF21的转基因小鼠显示出了低生长率、 低血糖和甘油三酯水平以及的代谢表型，并且没有出现与年龄相关的2型糖尿病、胰岛增 生与肥胖。对糖尿病鼠模型药物施用重组FGF21蛋白导致血糖水平正常，甘油三酯和胆固 醇水平降低，并改善糖耐受和胰岛素敏感性。此外，FGF21通过增加能量消耗、身体活性和 代谢率减低体重和身体脂肪。实验研究提供了 FGF21用于治疗人类2型糖尿病、肥胖、血脂 异常及其他代谢紊乱的药物学给药的支持。人类FGF21在体内半衰期很短。在小鼠和食蟹猴中，人类FGF21的有效半衰期是1 至2小时。在开发用作治疗2型糖尿病的治疗剂的FGF21蛋白中，需要增加其半衰期。具 有增加的半衰期的FGF21蛋白将允许给药该蛋白的患者的给药频率减少。发明概述在一实施方案，本发明提供了分离的核酸分子，其包括编码SEQ ID N0:4多肽的 核苷酸序列，所述多肽具有至少一个氨基酸置换(a)在36, 72, 77,126和175位中的一个 或多个的赖氨酸残基；(b)在 37,38,46,91,69,77,79,87,91,112,113,120,121,125,126, 175，170和179位中的一个或多个的半胱氨酸残基；(c)在56，59，69和122位中的一个或 多个的精氨酸残基；(d)在170位的甘氨酸残基；(e)在171位的甘氨酸残基；以及(a)-(e) 的组合。在另一实施方案，本发明提供了一分离的核酸分子，其包括编码SEQ ID N0:4多 肽的核苷酸序列，所述多肽具有至少一个氨基酸置换(a)在36，72，77，126和175位中的 一个或多个的赖氨酸残基；(b)在 37,38,46,91,69,77,79,87,91,112,113,120,121,125, 126，175，170和179位中的一个或多个的半胱氨酸残基；(c)在56，59，69和122位中的 一个或多个的精氨酸残基；(d)在170位的甘氨酸残基；(e)在171位的甘氨酸残基；以及 (a)-(e)的组合，其包含使所述多肽与SEQ ID NO :4至少85%—致的增加、缺失或进一步置换，前提条件是权利要求I (a)-(e)所述的至少一种氨基酸置换不进行进一步修饰。本发明还提供包含本发明核酸分子的载体和宿主细胞。在进一步实施方案，本发明提供分离的多肽，其具有下列至少一个氨基酸置换的SEQ ID NO :4的氨基酸序列(a)在36，72，77，126和175位中的一个或多个的赖氨酸残基；(b)在 37,38,4 6,91,69,77,79,87,91,112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一个或多个的半胱氨酸残基；(c)在56，59，69和122位中的一个或多个的精氨酸残基；(d)在170位的甘氨酸残基；(e)在171位的甘氨酸残基；以及(a)-(e)的组合。在进一步实施方案，本发明提供编码多肽的分离的核酸，所述多肽包含具有下列至少一种氨基酸置换的SEQ ID NO 4的氨基酸序列(a)在36，72，77，126和175位中的一个或多个的赖氨酸残基；(b)在 37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170和179位中的一个或多个的半胱氨酸残基；(c)在56，59，69和122位中的一个或多个的精氨酸残基；(d)在170位的甘氨酸残基；(e)在171位的甘氨酸残基；以及
(a)-(e)的组合，以及其包含使所述多肽与SEQID NO :4至少85%—致的增加、缺失或进一步置换，前提条件是权利要求I (a)-(e)所述的至少一种氨基酸置换不进行进一步修饰。在又一实施方案，本发明提供分离的多肽，包含具有下列至少一种氨基酸置换的SEQ ID NO :4的氨基酸序列(a)在36，72，77，126和175位中的一个或多个的赖氨酸残基；
(b)在37,38,46,91,69,77,79,87,91,112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一个或多个的半胱氨酸残基；(c)在56，59，69和122位中的一个或多个的精氨酸残基；(d)在170位的甘氨酸残基；(e)在171位的甘氨酸残基；以及(a)-(e)的组合，以及其包含使所述多肽与SEQ ID NO :4至少85%—致的增加、缺失或进一步置换，前提条件是权利要求I (a)-(e)所述的至少一种氨基酸置换不进行进一步修饰。另外，本发明提供组合物，包含通过接头结合第二多肽的第一多肽，所述第一多肽含有任选地具有下列至少一种氨基酸置换的SEQ ID NO 4的氨基酸序列(a)在36，72，77，126和175位中的一个或多个的赖氨酸残基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170和179位中的一个或多个的半胱氨酸残基；(c)在56，59，69和122位中的一个或多个的精氨酸残基；(d)在170位的甘氨酸残基；(e)在171位的甘氨酸残基；以及(a)-(e)的组合，所述第二多肽包括任选地具有下列至少一种氨基酸置换的SEQ ID NO :4的氨基酸序列的多肽(a)在36，72，77，126和175位中的一个或多个的赖氨酸残基；(b)在 37,38,46,91,69,77,79,87,91,112，113，120，121，125，126，175，170和179位中的一个或多个的半胱氨酸残基；(c)在56，59，69和122位中的一个或多个的精氨酸残基；(d)在170位的甘氨酸残基；(e)在171位的甘氨酸残基；以及(a)-(e)的组合。本发明还提供本发明多肽的化学修饰形式。化学修饰形式的多肽包含附接N-端和/或天然或非天然存在的聚合物附接位点的聚合物。本发明还提供药物组合物和治疗代谢紊乱的方法，例如肥胖症和糖尿病，包括向需要的患者施用本发明的药物组合物。本发明的特定实施方案从某些实施方案的下列详细描述和所附权利要求书中是明显可见的。附图简述图I是具有附接其序列的两种聚合物(例如PEG分子)的FGF21分子的草图。图2包含四种SDS-PAGE凝胶，其示出9种FGF21突变体的PEG化程度，所述FGF21突变体具有单一工程化聚合物附接位点，所述附接位点用PEG化学修饰，即E37C，R77C和H125C(左上)，D38C, D46C 和 D79C(右上)，H87C, E91C, G113C(左下)和 G120C, R126C,N121C (右下)。图3包含SDS-PAGE凝胶，其示出3种FGF21突变体的PEG化程度，所述FGF21突变体具有单一工程化聚合物附接位点，所述附接位点用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子化学修饰，即K69C， R175C和Y179C。图4包括两个图，其示出对FGF21突变多肽进行ELK-荧光素酶测定的结果，所述FGF21突变多肽具有单一工程化聚合物附接位点，所述附接位点通过附接20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子而化学修饰，即E37C，R77C，E91C，野生型FGF21和N-端PEG化FGF21 (上图)和 G113C, N121C, D46C,野生型 FGF21 和 N-端 PEG 化 FGF21 (下图)。图5包括两个图，其示出对FGF21突变多肽进行ELK-荧光素酶测定的结果，所述FGF21突变多肽具有单一工程化聚合物附接位点，所述附接位点通过附接20kDa甲氧基-PEG马来酰亚胺而化学修饰，即H125C，G120C, R126C，野生型FGF21和N-端PEG化FGF21 (上图)和 D79C, D38C,野生型 FGF21 和 N-端 PEG 化 FGF21 (下图)。图6包括两个图，其示出对野生型FGF21和FGF21突变多肽进行ELK-荧光素酶测定的结果，它们具有单一工程化聚合物附接位点，所述附接位点通过附接20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子而化学修饰，即K69C，D79C，野生型FGF21和N-端PEG化FGF21 (上图)和R175C, Y179C，野生型 FGF21 和 N-端 PEG 化 FGF21 (下图)。图7是本发明的系链分子的草图。图8示出在小鼠中在单次注射赋形剂(PBS)，野生型FGF21或N-端PEG化野生型FGF21后从时间O开始血糖水平的改变百分率的图。图9示出在小鼠中在单次注射赋形剂(PBS)或者用20，30或40kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子N-端PEG化的野生型FGF21后从时间O开始血糖水平的改变百分率的图。

图10包括两个图，其示出在小鼠中在单次注射PBS或N-端PEG化FGF21突变多肽后从时间O开始在9天中血糖水平的改变百分率的图，N-端PEG化FGF21突变多肽包含突变体R77C或R126K，其在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子进一步PEG化，融合蛋白包含Fe分子和G170E FGF21突变多肽(上图)；或N-端PEG化FGF21突变多肽，包含突变体R77C，其在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子和P171G(下图)进一步PEG化。图11是示出在单次注射赋形剂(IOmM磷酸钾，5%山梨糖醇，pH 8)或FGF21突变多肽后从时间O开始血糖水平的改变百分率的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E91C/H125C，E91C/R175C，E37C/G120C, E37C/H125C和E37C/R175C ;还研究包含Fe分子和P171G FGF21突变多肽的融合蛋白。图12是示出在单次注射赋形剂(IOmM磷酸钾，5%山梨糖醇，pH 8)或FGF21突变多肽后从时间O开始血糖水平的改变百分率的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E91C/H121C，G120C/H125C或E37C/R77C ;还研究包含Fe分子和G170E FGF21突变多肽的融合蛋白。图13是示出在小鼠中在单次注射赋形剂(IOmM磷酸钾，5%山梨糖醇，pH 8)或FGF21突变多肽后从时间O开始血糖水平的改变百分率的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E37C/R77C，E91C/R175C, E37C/H125C, E37C/R77C/P171G, E91C/R77C/P171G 和 E37C/R125C/P171G。图14是示出在小鼠中在单次注射赋形剂(IOmM磷酸钾，5%山梨糖醇，pH 8)或FGF21突变多肽后从时间O开始血糖水平的改变百分率的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E37C/R77C/P171G和E91C/R125C/P171G，或包含两个相同FGF21突变多肽的系链分子，FGF21突变多肽具有相同的引入突变体，即R77C/P171G(2x)和R78C/P172G (2x)，其通过20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子结合在一起。

图15是在小鼠中在单次注射赋形剂(IOmM Tris HCl,150mM NaCl, pH 8. 5)或FGF21突变多肽后从时间O开始作为剂量函数的血糖水平的改变百分率的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E37C/R77C/P171G,并且以剂量 O. 01mg/kg, O. 03mg/kg, O. lmg/kg, O. 3mg/kg 或 lmg/kg 来施用。图16是示出在小鼠中在单次注射赋形剂(IOmM磷酸钾，5%山梨糖醇，pH 8)或FGF21突变多肽后从时间O开始的体重改变的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E37C/R77C，E91C/R175C，E37/H125C, E37C/R77C/P171G,E91C/R77C/P171G 和 E37C/R125C/P171G。图17是示出在小鼠中在单次注射赋形剂(IOmM磷酸钾，5%山梨糖醇，pH 8)或FGF21突变多肽后从时间O开始的体重改变的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E37C/R77C/P171G和E91C/R125C/P171G，或包含两个FGF21突变多肽的系链分子，FGF21突变多肽具有相同的引入突变体，即R37C/P171G(2x)和R77C/P171G (2x)，其通过20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子结合在一起。图18是在小鼠中在单次注射赋形剂(IOmM Tris HCl,150mM NaCl, pH 8. 5)或FGF21突变多肽后从时间O开始作为剂量函数的体重改变的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E37C/R77C/P171G，并且施加5种不同的剂量。图19A-19F是一系列6个图，其示出在8个星期肾脏液泡研究中小鼠体重改变的图，其使用一周给药赋形剂(方块)，5mg/kg(三角形)和25mg/kg(空心圆)PEG化FGF21分子。使用双半胱氨酸靶向的PEG-FGF21给药的小鼠显示出保持体重减轻，而给药系链分子的那些显示出主要瞬间体重减轻。图20包括两个棒图，其示出在注射赋形剂或FGF21突变多肽的小鼠中8个星期肾脏液泡研究结果的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双 PEG 化，即 E37C/R77C/P171G ；E37/H125C/P171G ；E91C/H125C/P171G ；E37C/P171G ；R77C/P171G ;和 R77C/P171G ;测试两种不同剂量。发明详述人FGF21蛋白，如增加半衰期具有增强特性可以准备使用的方法和标准披露外分子生物学方法。据了解，由一个或多个具有约束力的水溶性聚合物，如聚乙二醇分子，在蛋白的蛋白质半衰期可以延长。因此，在不同的实施例，天然FGF21半衰期可以延长引入蛋白质氨基酸置换的形式在哪个聚合物可附着在FGF21蛋白点。这种修饰的蛋白质，在此统称为FGF21突变体和本发明的形式体现。也可引入聚合物结合的非天然聚合物附接位点引入的N-端的FGF21分子。本文中使用的重组核酸方法包括在实施例中，通常为Sambrook et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)或 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. , eds., GreenPublishers Inc. and Wiley and Sons 1994)中阐述的那些，为了任何目的其通过引用方式全部并入本文。
I.通用定义如本文中使用的，除非另有说明，术语“一种”表示一种或多种。术语“分离的核酸分子“是指该发明的核酸分子(I)已脱离至少约50个蛋白质，脂肪，碳水化合物，或其他材料自然地发现它是从源细胞总核酸分离的，(2)不与全部或部分聚核苷酸对其中的“分离的核酸分子”是联系在一起的性质，(3)可操作地链接到它的聚核苷酸在没有联系的性质，或(4)不发生在自然界作为一个更大的聚核苷酸序列的一部分。优选，分尚的核酸分子的本发明实质上从任何其他污染核酸分子或其他污染物，为它的天然环境，在多肽干预其生产或它的治疗，诊断，预防或研究发现使用自由使用。术语“分离的多肽“是指本发明的多肽，(I)已至少从聚核苷酸约50，脂肪，碳水化合物，百分之分居或其他材料自然地发现它是从源细胞总核酸分离的(2)不链接(共价键或共价相互作用)的全部或一部分的多肽其中“分离的多肽“在本质上是联系在一起，
(3)可操作地链接(共价键或共价交互)到与它没有联系的性质，或(4)不发生在自然界多肽。优选，分离的多肽实质上从任何其他污染多肽或其他污染物，为它的天然环境，干扰其治疗，诊断，预防或研究发现自由使用。术语“载体”是指任何分子(例如核酸，质粒或病毒)，用于传输编码信息到宿主细胞。术语“表达载体“，是指载体，它可以通过一个合适的宿主细胞转化，并包含核酸序列，直接和/或控制插入的外源核酸序列的表达。表达包括但不限于加工，如转录，翻译和RNA的剪接，如内含子存在。术语“宿主细胞“，是用来指已经改变，或者是能够被转化与核酸序列和表达了当时人们感兴趣的某些基因的细胞。术语包括了母细胞后代，不论是在形态的后代在遗传相同或化妆到原来的父母，只要选定的基因存在。术语“自然形成“使用时，如核酸分子，多肽，宿主细胞的生物材料连接，等等，这是指在自然界中发现，并非由人操纵的材料。同样，“非天然“是指这里所用的一个不存在于自然界，或已被修改或人为结构合成材料。使用时与核苷酸的联系，术语“自然发生“是指基地腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)的。使用时，与氨基酸连接，术语“自然发生“是指20种氨基酸丙氨酸(A)，半胱氨酸(C)和天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)和苯丙氨酸(F)的甘氨酸(G)，组氨酸(H)，异亮氨酸(I)，赖氨酸⑷时，亮氨酸(L)和蛋氨酸(M)，天冬酰胺(N)，脯氨酸(P)，谷氨酰胺(Q)，精氨酸(R)，丝氨酸(S)和苏氨酸(T)，缬氨酸(V)，色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。术语“FGF21多肽“是指任何天然野生型多肽在人类表达。就本申请而言术语，“FGF21多肽“可以互换使用来指全长FGF21多肽，它由209个氨基酸残基的(SEQ ID :2)，是由核苷酸编码序列如SEQ ID 1 ;以及多肽成熟的形式，它由181个氨基酸残基的(SEQ ID 4)组成，是由如SEQ ID NO的核苷酸序列编码3，其中28个氨基酸残基或继续其全长的FGF21多肽(即构成的信号肽)已被删除氨基-端。FGF21多肽可表示有或没有的N-端蛋氨酸残基，正如文中提到的，N-端甲硫氨酸残基可以添加设计或作为细菌表达系统的功能。术语“生物活性”，适用于FGF21多肽，包括FGF21突变多肽所述，指的是野生型FGF21多肽，如降低血糖，胰岛素，甘油三酯，或胆固醇的能力，自然发生的活性；减少体重，改善糖耐量，能量消耗，或胰岛素的敏感性。适用于FGF21突变多肽，术语是不是在类型或已纳入FGF21突变多肽引进一些修改而定。例如，一些FGF21突变多肽拥有了 FGF21活性有所下降水平相对于野生型FGF21多肽，但仍然被认为是具 有生物活性的FGF21突变多肽。在一个特定的FGF21突变多肽活性之间的差异可以看出在体内和体外实验，任何此类的差异与使用的特殊检测。这样的观察，但并不影响术语，意思是“生物活性”和FGF21突变多肽露出了野生型FGF21多肽，如降低血糖，胰岛素，甘油三酯，或胆固醇的能力，自然发生的活性；降低体重，改善糖耐量，能量消耗，在任何或胰岛素的敏感性，在体内或体外试验是“生物活性。”术语“有效量“和”治疗有效量“互换使用，并参考了 FGF21突变多肽的使用量，以支持一个或多个生物活性的野生型FGF21多肽，如能够降低，可观察的水平血糖，胰岛素，甘油三酯，或胆固醇水平，降低体重，或改善糖耐量，能量消耗，或胰岛素的敏感性。术语“药学上可接受的载体“或”生理学上可接受的载体“作为此处使用的是指一个或多个配方材料完成或提高FGF21突变多肽交付使用。这种材料的例子中可以在Remington上文找到，通过引入并入本文。术语“系链分子“是指由两个或两个以上建设FGF21分子的一个接头分子拴在一起。一个系链分子至少包括两个FGF21多肽，其中至少一种是FGF21突变多肽所述外，但可以由三，四个或更多的FGF21或FGF21突变多肽接头一起加入，因此，术语系链分子不局限于一个分子组成的只有一个或两个FGF21或FGF21突变多肽组合。术语“高分子附接位点“是指一个多肽主要氨基酸序列(例如一 FGF21多肽)，它适应于有化学聚合物(例如聚乙二醇分子的所有分子量，聚甘露糖，聚糖共价键合区域等)。聚合物附接位点可能意味着一个单一的氨基酸(例如半胱氨酸，赖氨酸，精氨酸或适当的非天然氨基酸)或术语可以指两个或多个相邻氨基酸无论是在相互顺序或空间。术语“化学修饰，“在使用时就一个FGF21野生型或FGF21突变所披露者外多肽，是指一个FGF21多肽已经从它的天然状态的修改由一个或多个外源分子共价附接第外源分子的例子包括聚乙二醇(PEG)的，单甲氧基-聚乙二醇，右旋糖酐，纤维素，聚-(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇，羟基升乙基淀粉(HES)和聚乙烯醇。多肽的化学修饰FGF21的例子包括聚乙二醇化野生型FGF21和FGF21突变多肽。2.FGF21 突变多肽在各方面，本发明公开了一种为定点聚乙二醇化的FGF21和FGF21突变多肽，可提高对FGF21分子药代动力学性质，同时尽量减少对体外培养方法的系列活性的影响。增强这些聚乙二醇化FGF21分子药动学特征具有在体内的分子疗效上通过增加接触到的治疗剂的影响。此外，本文所述的策略与聚乙二醇化创建多个站点，这可能都进一步提高对分子药代动力学特性，降低其液泡形成潜在的不兼容。采用两种主要战略是实现这个目标，如本文所述。一方面，本发明涉及FGF21在其中一个或更多的修改已经实施序列。因此，术语“FGF21突变多肽”和“FGF21突变体”，它可以互换使用，是指一 FGF21多肽在其中野生型FGF21氨基酸序列(例如如SEQ ID 2或4)已被修改。这些修改包括但不限于一个或多个氨基酸置换，包括与非天然氨基酸类似物，截断插入和置换。因此，FGF21多肽突变包括但不限于定点FGF21突变体，如引入非天然聚合物附接位点的人，或传授程度的抵抗蛋白质，如本文所述。为了确定具体的氨基酸突变体的FGF21在本 发明中，氨基酸残基截断或突变编号置换的目的对应于成熟的181个残基的FGF21多肽(即该的N-端序列开始HPIPD，这些残基都分别指定为残基第1，2，3，4和5)。N-端蛋氨酸残基可以但并不需要存在，这N-端甲硫氨酸残基是不是在蛋白质的编码方案包括在内。如上所述，FGF21突变包括截断形式的FGF21包括一个或多个置换或插入，其中包括非天然氨基酸构成本发明实施例体。这样可以插入或置换传授包括聚合物附接地点采取行动的各种属性。在这种情况下，非天然氨基酸可以被纳入除了各种突变体此处描述成一个FGF21序列。因此，一 FGF21突变可以由一个或更多的突变体所述，可以进一步包括一个或多个非天然氨基酸。一个非限制性的非天然存在的，可以插入到FGF21序列或在FGF21序列野生型的氨基酸残基取代的例子清单包括含-氨基酸，均氨基酸，环状氨基酸和氨基酸衍生物侧链。例子包括(L-形或D-形；缩写)对-乙酰基-苯丙氨酸，对-叠氮基-苯丙氨酸，对-溴-苯丙氨酸，对-碘-苯丙氨酸和对-乙炔基-苯丙氨酸，瓜氨酸(CU)，高瓜氨酸(hCit) ,Na-甲基瓜氨酸(NMeCit) ,Na-甲基高瓜氨酸(N a -MeHoCit)，鸟氨酸(Orn)，Na -甲基鸟氨酸(Na -MeOrn或NMeOrn)，肌氨酸(Sar)，高赖氨酸(hLys或hK)，高精氨酸(hArg或hR)，高谷胱甘肽(hQ), Na-甲基精氨酸(NMeR), Na-甲基亮氨酸(Na-MeL或匪eL)，N_甲基高赖氨酸(匪eHoK) ,Na -甲基谷氨酰胺(匪eQ)，异亮氨酸(Nle)，正缬氨酸，(Nva)，1，2，3，4-四氢异喹啉(Tic)，八氢吲哚_2_羧酸(Oic)，3_(1_萘基)丙氨酸(I-Nal)，
3-(2-萘基)丙氨酸(2-Nal)，l，2，3，4-四氢异喹啉(Tic)，2-茚满基甘氨酸(IgI)，对-碘苯丙氨酸(Pl-Phe),对-氨基苯丙氨酸(4AmP或4-氨基-Phe) ,4-胍基苯丙氨酸(Guf),甘氨酰赖氨酸(缩写"K(Ne-甘氨酰)"或"K(甘氨酰)"或"K(gly)")，硝基苯丙氨酸(nitrophe),氨基苯丙氨酸(氨基苯或氨基-Phe),节基苯丙氨酸(节基phe), Y -羧基谷氨酸(Y -羧基glu),轻基脯氨酸(轻基pro), p-羧基I-苯丙氨酸(Cpa), a -氨基己二酸(Aad), Na-甲基缬氨酸(^eVal)，N-a -甲基亮氨酸(NMeLeu), Na-甲基异亮氨酸(匪eNle)，环戊基甘氨酸(Cpg)，环己基甘氨酸(Chg)，乙酰基精氨酸(乙酰基arg)，a，^ - 二氨基丙酸(Dpr), a , Y-二氨基丁酸(Dab)，二氨基丙酸(Dap)，环己基丙氨酸(Cha)，
4-甲基-苯丙氨酸(MePhe) - 二苯基-丙氨酸(BiPhA)，氨基丁酸(Abu) ,4-苯基-苯丙氨酸(或二苯丙氨酸4Bip)，a-氨基-异丁酸(Aib)，￠-丙氨酸，￠-氨基丙酸，哌啶酸，氨基己酸，氨基庚酸，氨基庚二酸，desmosine, 二氨基庚二酸，N-乙基甘氨酸，N-乙基天冬酰胺，轻基赖氨酸，异-轻基赖氨酸，isodesmosine,别-异亮氨酸,N-甲基甘氨酸,N-甲基异亮氨酸，N-甲基缬氨酸，4-羟基脯氨酸(Hyp)，Y-羧基谷氨酸盐，e -N, N，N-三甲基赖氨酸，e -N-乙酰基赖氨酸，0-磷酸丝氨酸，N-乙酰基丝氨酸，N-甲酰蛋氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸，Co -甲基精氨酸，4-氨基-O-邻苯二甲酸(4APA)，和其他类似氨基酸以及那些特定列出的任一种的衍生形式。 在本发明实施例等，FGF21突变多肽包括一个氨基酸序列即至少百分之85至野生型相同FGF21氨基酸序列(例如如SEQ ID 2或4)，但其中的具体残基介绍非天然聚合物附接位点中的FGF21突变多肽本有没有得到进一步的修改。换句话说，随着残基的FGF21异常突变序列已被修改，以便引入非天然聚合物附接位点或一抗突变，提高蛋白质，约15百分之的所有其他氨基酸残基在FGF21突变序列可能会被修改。例如，在FGF21突变多肽G170C，多达15%的所有氨基酸残基的其他比甘氨酸残基的位置170可以修改。还有一些实施方案中，FGF21多肽的氨基酸序列突变包括至少是百分之九十左右，约有95，96，97，或98或百分之99到野生型相同FGF21氨基酸序列(例如的SEQ ID :2，4，6或8)，但其中的具体残基已被修改，那是引入非天然聚合物附接位点或提高蛋白质阻力没有得到进一步的修改。这种FGF21突变多肽具有至少对野生型FGF21多肽一种活性。FGF21突变多肽可产生氨基酸置换引入，无论是保守或不保守的性质和利用自然或不自然产生的氨基酸的FGF21多肽在特定的位置。这种置换可以在设计或置换除了提出一个理想的观察传授属性到FGF21多肽。通过举例的方式，一种FGF21突变多肽能包括设计来实现，如引入非天然聚合物附接位点或增强抗水解一个理想的属性，置换，并能进一步包括一个或更多的保守或不保守的置换可能，但不需要维护野生型FGF21多肽的生物活性。FGF21突变体，可以保守或不保守。一个"保守氨基酸置换"会涉及到与外来的残基取代原生氨基酸残基(即残基中的野生型FGF21多肽序列中指定的位置找到)(即残基是不发现一对野生型FGF21多肽序列中指定位置)等，很少有或没有对氨基酸残基在该位置极性或电荷效应。保守的氨基酸置换也是包括非天然氨基酸残基那通常是由化学合成肽，而不是在生物系统的合成中。这些措施包括肽和氨基酸倒基逆转或其他形式。天然存在的残基可基于通常侧链性质来分类(I)疏水性:异亮氨酸，Met, Ala, Val, Leu, He ；(2)中性亲水性Cys, Ser, Thr ；(3)酸性Asp, Glu ；(4)碱性Asn, Gin, His, Lys, Arg ；(5)影响侧链取向的残基Gly, Pro ;以及(6)芳族Trp, Tyr, Phe。保守的置换可涉及这些类中的一个成员，在同一类的其他成员交换。非保守置换可能涉及的一个成员对这些类的一个成员从另一个类的交换。所需的氨基酸置换的(无论保守或不保守)可以被那些在当时这种置换由本领域技术人员确定的。一种氨基酸置换的例子(但不限于)列表列于表I。表I氨基酸置换
权利要求
1.一种分离的核酸分子，包含编码SEQ ID NO :4的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有下列至少ー种氨基酸置換 (a)在36，72，77，126和175位中的ー个或多个的赖氨酸残基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一个或多个的半胱氨酸残基； (c)在56，59，69和122位中的ー个或多个的精氨酸残基； (d)在170位的甘氨酸残基； (e)在171位的甘氨酸残基； 以及(a)-(e)的组合。
2.ー种载体，包含权利要求I所述的核酸分子。
3.—种宿主细胞，包含权利要求2所述的载体。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其是真核细胞。
5.根据权利要求3所述的宿主细胞，其是原核细胞。
6.一种制备由权利要求2所述的载体编码的多肽的方法,包括在合适的条件下培养包含权利要求2所述的载体的宿主细胞，以表达所述多肽，并且任选地分离所述多肽。
7.一种由权利要求6所述的方法制备的多肽。
8.根据权利要求7所述的多肽，还包含引入所述多肽的C-端的脯氨酸或甘氨酸残基。
9.一种分离的多肽，包含具有下列至少ー种氨基酸置换的SEQ ID NO :4的氨基酸序列 (a)在36，72，77，126和175位中的ー个或多个的赖氨酸残基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一个或多个的半胱氨酸残基； (c)在56，59，69和122位中的ー个或多个的精氨酸残基； (d)在170位的甘氨酸残基； (e)在171位的甘氨酸残基； 以及(a)-(e)的组合。
10.根据权利要求9所述的多肽，还包含引入所述多肽的C-端的脯氨酸或甘氨酸残基。
11.根据权利要求9所述的多肽，其中所述多肽共价连接一种或多种聚合物。
12.根据权利要求11所述的分离的多肽，其中所述多肽共价连接一种聚合物。
13.根据权利要求12所述的分离的多肽，其中所述聚合物是水溶性聚合物。
14.根据权利要求13所述的分离的多肽，其中所述水溶性聚合物是聚こニ醇(PEG)，单甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纤维素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇。
15.根据权利要求14所述的分离的多肽，其中所述水溶性聚合物是PEG。
16.根据权利要求11所述的分离的多肽，其中所述聚合物是分支聚合物。
17.根据权利要求9所述的分离的多肽，其中所述多肽具有共价连接其氨基-端的PEG部分。
18.根据权利要求9所述的分离的多肽，其中所述多肽共价连接两种聚合物。
19.根据权利要求18所述的分离的多肽，其中所述两种聚合物中的ー种是水溶性聚合物。
20.根据权利要求19所述的分离的多肽，其中所述水溶性聚合物是聚こニ醇(PEG)，单甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纤维素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇。
21.根据权利要求20所述的分离的多肽，其中所述水溶性聚合物是PEG。
22.根据权利要求18所述的分离的多肽，其中所述聚合物中的一种是分支的。
23.根据权利要求18所述的分离的多肽，其中所述聚合物中的两种都是分支的。
24.根据权利要求9所述的分离的多肽，其中所述多肽具有共价连接其氨基-端的PEG部分。
25.ー种药物组合物，包含根据权利要求9所述的分离的多肽和药学上可接受的配制齐U。
26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的配制剂是载体、佐齐U、增溶剤、稳定剂或抗氧化剂。
27.ー种治疗代谢紊乱的方法，包括向需要的人患者施用权利要求26所述的药物组合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述代谢紊乱是糖尿病。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述代谢紊乱是肥胖症。
30.一种编码多肽的分离的核酸，所述多肽包括具有下列至少ー种氨基酸置換的SEQID NO 4的氨基酸序列 (a)在36，72，77，126和175位中的ー个或多个的赖氨酸残基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一个或多个的半胱氨酸残基； (c)在56，59，69和122位中的ー个或多个的精氨酸残基； (d)在170位的甘氨酸残基； (e)在171位的甘氨酸残基； 以及(a)-(e)的组合， 以及其包含使所述多肽与SEQ ID NO 4至少85%—致的増加、缺失或进ー步置換，前提条件是权利要求I (a)-(e)所述的至少ー种氨基酸置换不进行进ー步修饰。
31.ー种载体，包含权利要求30所述的核酸分子。
32.—种宿主细胞，包含权利要求31所述的载体。
33.根据权利要求32所述的宿主细胞，其是真核细胞。
34.根据权利要求32所述的宿主细胞，其是原核细胞。
35.一种制备由权利要求30所述的载体编码的多肽的方法，包括在合适的条件下培养包含权利要求30所述的载体的宿主细胞，以表达所述多肽，并且任选地分离所述多肽。
36.一种由权利要求35所述的方法制备的多肽。
37.根据权利要求36所述的多肽，还包含引入所述多肽的C-端的脯氨酸或甘氨酸残基。
38.一种分离的多肽，包含具有下列至少ー种氨基酸置换的SEQID NO :4的氨基酸序列(a)在36，72，77，126和175位中的ー个或多个的赖氨酸残基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一个或多个的半胱氨酸残基； (c)在56，59，69和122位中的ー个或多个的精氨酸残基； (d)在170位的甘氨酸残基； (e)在171位的甘氨酸残基； 以及(a)-(e)的组合， 以及其包含使所述多肽与SEQ ID NO :4至少85%—致的増加、缺失或进ー步置換，前提条件是权利要求I (a)-(e)所述的至少ー种氨基酸置换不进行进ー步修饰。
39.根据权利要求38所述的多肽，还包含引入所述多肽的C-端的脯氨酸或甘氨酸残基。
40.根据权利要求38所述的分离多肽，其中所述多肽共价连接一种聚合物。
41.根据权利要求40所述的分离的多肽，其中所述聚合物是水溶性聚合物。
42.根据权利要求41所述的分离的多肽，其中所述水溶性聚合物是聚こニ醇(PEG)，单甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纤维素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇。
43.根据权利要求42所述的分离的多肽，其中所述水溶性聚合物是PEG。
44.根据权利要求40所述的分离的多肽，其中所述聚合物是分支的。
45.根据权利要求38所述的分离的多肽，其中所述多肽具有共价连接其氨基-端的单一 PEG部分。
46.根据权利要求38所述的分离的多肽，其中所述多肽共价连接两种聚合物。
47.根据权利要求46所述的分离的多肽，其中所述两种聚合物中的ー种是水溶性聚合物。
48.根据权利要求47所述的分离的多肽，其中所述水溶性聚合物是聚こニ醇(PEG)，单甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纤维素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇。
49.根据权利要求48所述的分离的多肽，其中所述水溶性聚合物是PEG。
50.根据权利要求46所述的分离的多肽，其中所述聚合物中的两种都是水溶性聚合物。
51.根据权利要求50所述的分离的多肽，其中所述水溶性聚合物独立地是聚こニ醇(PEG)，单甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纤维素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇、以及它们的组合。
52.根据权利要求46所述的分离的多肽，其中两种所述水溶性聚合物都是PEG。
53.根据权利要求46所述的分离的多肽，其中所述聚合物中的一种是分支的。
54.根据权利要求46所述的分离的多肽，其中所述聚合物中的两种是分支的。
55.ー种药物组合物，包含权利要求38所述的分离的多肽和药学上可接受的配制剂。
56.根据权利要求55所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的配制剂是载体、佐齐U、增溶剤、稳定剂或抗氧化剂。
57.ー种治疗代谢紊乱的方法，包括向需要的人患者施用权利要求56所述的药物组合物。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述代谢紊乱是糖尿病。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述代谢紊乱是肥胖症。
60.一种组合物，包含通过接头结合第二多肽的第一多肽，所述第一多肽含有任选地具有下列至少ー种氨基酸置換的SEQ ID NO 4的氨基酸序列 (a)在36，72，77，126和175位中的ー个或多个的赖氨酸残基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一个或多个的半胱氨酸残基； (c)在56，59，69和122位中的ー个或多个的精氨酸残基； (d)在170位的甘氨酸残基； (e)在171位的甘氨酸残基； 以及(a)-(e)的组合， 所述第二多肽包括任选地具有下列至少ー种氨基酸置换的SEQ ID NO :4的氨基酸序列的多肽 (a)在36，72，77，126和175位中的ー个或多个的赖氨酸残基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170 和 179 位中的一个或多个的半胱氨酸残基； (c)在56，59，69和122位中的ー个或多个的精氨酸残基； (d)在170位的甘氨酸残基； (e)在171位的甘氨酸残基； 以及(a)-(e)的组合。
61.根据权利要求60所述的多肽，其中所述第一、第二或两种多肽还包含引入所述多肽的C-端的脯氨酸或甘氨酸残基。
62.根据权利要求60所述的组合物，其中所述接头是肽。
63.根据权利要求60所述的组合物，其中所述接头是水不溶性聚合物。
64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述水溶性聚合物是聚こニ醇(PEG)，单甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纤维素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇。
65.根据权利要求64所述的组合物，其中所述水溶性聚合物是PEG。
66.根据权利要求60所述的组合物，其中所述第一、第二或两种多肽除了所述接头还共价连接一种聚合物。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述聚合物是水溶性聚合物。
68.根据权利要求67所述的组合物，其中所述水溶性聚合物是聚こニ醇(PEG)，单甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纤维素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇。
69.根据权利要求68所述的组合物，其中所述水溶性聚合物是PEG。
70.根据权利要求63所述的组合物，其中所述聚合物是分支的。
71.根据权利要求60所述的组合物，其中所述组合物具有共价连接其氨基-端的単一PEG部分。
72.根据权利要求60所述的组合物，其中所述组合物共价连接两种聚合物。
73.根据权利要求72所述的组合物，其中所述两种聚合物中的ー种是水溶性聚合物。
74.根据权利要求73所述的组合物，其中所述水溶性聚合物是聚こニ醇(PEG)，单甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纤维素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇。
75.根据权利要求74所述的组合物，其中所述水溶性聚合物是PEG。
76.根据权利要求72所述的组合物，其中所述聚合物中的两种都是水溶性聚合物。
77.根据权利要求76所述的组合物，其中所述水溶性聚合物独立地是聚こニ醇(PEG)，单甲氧基-聚こニ醇，右旋糖酐，纤维素，聚-(N-こ烯吡咯烷酮)聚こニ醇，丙ニ醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧こ烷共聚物，聚氧こ烯化多元醇或聚こ烯醇、以及它们的组合。
78.根据权利要求77所述的组合物，其中两种所述水溶性聚合物都是PEG。
79.根据权利要求72所述的分离的多肽，其中所述聚合物中的一种是分支的。
80.根据权利要求72所述的分离的多肽，其中所述聚合物中的两种是分支的。
81.ー种药物组合物，包含权利要求60所述的组合物和药学上可接受的配制剂。
82.根据权利要求81所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的配制剂是载体、佐齐U、增溶剤、稳定剂或抗氧化剂。
83.ー种治疗代谢紊乱的方法，包括向需要的人患者施用权利要求81所述的药物组合物。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述代谢紊乱是糖尿病。
85.根据权利要求83所述的方法，其中所述代谢紊乱是肥胖症。
全文摘要
本发明提供编码FGF21突变多肽的核酸分子，FGF21突变多肽，包含FGF21突变多肽的药物组合物，以及使用所述核酸、多肽或者药物组合物治疗代谢紊乱的方法。
文档编号C07K14/50GK102625811SQ200980150308
公开日2012年8月1日 申请日期2009年10月8日 优先权日2008年10月10日
发明者C·V·小格格, E·J·贝卢斯基, J·徐, K·W·沃克, M·L·迈克尔斯, M·M·埃利森, R·I·赫希特, Y-S·李 申请人:安姆根有限公司