L至1:50制剂的1.lg/L。
[0089] 结果表明了对1:150HDL制剂，从300mg/kg开始的剂量，观察到了提高的ALT水 平。1:100HDL制剂从400mg/kg剂量开始，引起了提高的ALT水平，在600mg/kg水平显著 提高。相反，对1:50HDL制剂，直至600mg/kg剂量，也没有观察到ALT活性的提高（图1)。 这些结果表明通过HDL制剂中的PC水平和/或胆酸盐水平降低了肝毒性。为了研究是否 是胆酸盐的水平对ALT活性具有直接作用，进行了进一步的研究，其中将CSL111的胆酸盐 耗尽。结果证明了当以300mg/kg灌输给大鼠时，CSL111制剂中的胆酸盐的降低导致了ALT 水平的降低（图2)。此外，如果之后将胆酸盐加回耗尽的HDL制剂中，以300mg/kg灌输给 大鼠时，重新补充的HDL制剂引起提高的ALT水平（图2)。这些研究证明了将胆酸盐降至 约lg/L实质性地降低了rHDL毒性，但还有另外的作用因素是PC降至约l:50apoAI:PC的 比例。
[0090] 实施例2
[0091] 比较分级的胆酸盐水平和Apo-AI:PC比例的肝毒性研究
[0092] 介绍
[0093] 该研究的目的是为了确定具有分级的胆酸盐浓度和如下的ApoA-Ι与PC比例的 重建HDL制剂（rHDL)肝中毒，rHDLPC1:150 (3g/L胆酸盐）、rHDLPC1:100 (lg/L胆酸 盐）、也01^?(：1:50(38/1胆酸盐）、也01^?(：1 :50(0.28/1胆酸盐）。将有意的大鼠模型用 于测定上述制剂对肝功能的影响。通过测定血清中肝酶活性（ALT和AST)来评价肝中毒。
[0094] 认为Apo-AI是制剂的活性成分，并且Apo-AI的血浆水平是暴露的关键指示。
[0095] 材料和方法
[0096] 测试rHDL制剂的给药
[0097] 测试rHDL制剂1
[0098] 物质/丨INN: rHDL PC 1:150 (3g/L胆酸盐) 制造商: CSL Behring AG，伯尔尼，瑞士 批号： Q.3 剂量： 600mg/kg b.w. 途径： 通过尾静脉的静脉内灌输 频率： 灌输t=0-60分钟 施用体积： 31.25 mL/kg/h
[0099] 测试rHDL制剂2
[0100] 物质/INN: rHDL PC 1:100 ( lg/L胆酸盐） 制造商： CSL Behring AG，伯尔尼，瑞士 批号： 0.3-2 剂量: 600mg/kg b.w. 途径: 通过尾静脉的静脉内灌输 频率： 灌输t=0-60分钟 施用体积： 30.30 ml /kg/h
[0101] 测试rHDL制剂3
[0102] 物质/丨INN: rHDLPC1:50 ( 3g/L胆酸隹） 制造商: CSL Behring AG，伯尔尼，瑞士 批号： P.3 剂量： 600mg/kg b.w. 途径： 通过尾静脉的静脉内灌输 频率： 灌输分钟 施用体积： 31.58 in L/kg/h 到期日： n, a,
[0103] 测试rHDL制剂4
[0104] 物质/INN: rHDL PC丨:50(0.2g/L胆酸盐） 制造商: CSL Behring AG，伯尔尼，瑞士 批号： P.2 剂量： 900mg/kg b.w. 途径： 通过尾静脉的静脉内灌输 频率： 灌输t=0-丨20分钟 施用体积： 23.08 mL/kg/h
[0105] 研究设计
[0106] 将该研究设计为总共14只大鼠的开放式四臂试验。剂量给药方案概括于表1中。
[0107] 处理组
[0108] 表1 :处理组
[0109]
[0110] 实验动物
[0111] mm大鼠
[0112] 品系： CD 性别：雄性 动物数量：14 供应： Charles River Laboratories ( Sulzfeld，德国） 体重： 286~328g 到达时年龄：7-9周 住所： macrolon笼 衬藝: 刨花（Braun, Battenberg，德菌） 水：自来水，随意饮用 食物：标准大鼠膳食（Ssniff-Versuchsdiaten，Soesi，德 国） 光/暗: 12小时/12小时 温度： 21-22Γ 相对湿度:40-50%
[0113]将动物置于约束装置（大鼠固定器）中，并且用静脉内导管刺破侧尾静脉。将测 试物质灌输60/120分钟。
[0114] 从眶后静脉复合物中采取血样并且在基线、静脉内灌输后1小时/2小时和7小时 /8小时时收集至血清管中。将血样加工成血清，存储在-20°C。
[0115] 肝酶的测定
[0116] 使用可购得的酶测光测试盒（GreinerBiochemica)分析样品的AST和ALT活性。
[0117]ApoA-Ι血浆水平的测定
[0118] 通过浊度试验进行了人ApoA-Ι水平的测定。
[0119] 结果
[0120] 所研究的是具有1:50、1:100和l:150ApoA-Ι比PC的比例以及限定的1或3g/L 胆酸盐浓度或耗尽胆酸盐（0. 2g/L)的rHDL制剂。盐水作为载体，并且CSL111作为阳性 对照。在基线（时间点0)和灌输结束（分别1小时或2小时，600和900mg/kg)时以及在 7小时或8小时时采取血样。估算上述时间点的肝酶活性（ALT和AST)和人ApoA-Ι水平。
[0121] 在基线时的AST浓度范围为63至87U/L。除了ApoAI:PC1:50(胆酸盐0. 2g/L)， 对于所有制剂，AST浓度在灌输结束时和在时间点7小时/8小时时升高。
[0122] 基线时的ALT浓度范围为39至45U/L。除了ApoAI:PC1:50(胆酸盐0.2g/L)， 对于所有制剂，AST浓度在灌输结束和时间点7小时/8小时时升高。
[0123] 基线时的人ApoA-Ι浓度低于检测的最低限制。在灌输结束时，对于所有以 600mg/kg给药的制剂，浓度提高至大约13g/L。制剂1:50在900mg/kg时导致了 15g/L的 ApoA-I浓度。
[0124] 表2至4中给出了所有组的平均和标准偏差、剂量和时间点。
[0125] 表2 :AST血清水平（平均值土SD)
[0126]
[0127] 表3 :之后的ALT血清水平（平均值土SD)
[0128]
[0129] 表4:ApoA-Ι血清水平（平均值土SD)
[0130]
[0131] 结论
[0132] 总之，只有900mg/kg的ApoAI:PC比例1:50 (0· 2g/L胆酸盐）的rHDL制剂没有 诱发肝功能测试异常。相反，具有较高胆酸盐水平（3g/L)的相同l:50rHDL制剂在600mg/ kg时显示出升高的AST和ALT水平。这表明通过控制rHDL制剂的脂质和残留去污剂含量 最佳地最小化了肝毒性。
[0133] 实施例3
[0134] 比较rHDL制剂中胆酸盐水平的稳定性试验
[0135] 与现有技术的rHDL制剂CSL111相比，本发明的rHDL制剂的实施方案呈现出降低 的肝毒性，同时保持了至少等于CSL111的生物活性。这种rHDL制剂与CSL111不同之处在 于较低的蛋白质比PC的比例、较低的胆酸盐水平、较高的蛋白质含量和降低的蔗糖浓度。
[0136] 重建的HDL制剂
[0137] 起始材料Apo-AI
[0138] 作为起始材料，使用了纯化的和巴氏杀菌的Ap0-AI溶液。批次大小为30g或35g 蛋白质。
[0139] 脂质溶液
[0140] 以下给出了用于脂质溶液制造的配方。首先，制得了含有10mMTris、10mMNaCl 和ImMEDTA的缓冲液。根据等式1计算了所需的量。
[0141]
[0142] 接着，将胆酸钠（1. 3m〇l/m〇l脂质）加入该溶液中，并且溶解。
[0143] 然后，引入计算量的脂质（等式2)，将混合物温和搅拌6-18小时（脂质溶解），然 后使用预先灭菌的过滤装置 〇· 2μmMillipak40GammaGold(MilliporeArt.MPGL04GH2) 过滤。
[0144]
[0145] M(脂质）：对于PC为 775g/mol;对于SM为 731g/mol
[0146] M(Apo-AI) :28, 078g/mol
[0147] 脂质培养和UF/DF
[0148] 将Apo-AI溶液（30g_35g蛋白质）置于5L双夹套容器中，并且冷却至1_4°C。然 后，加入脂质溶液并且在1-4°C下搅拌2-16小时。对于一些实验，将蛋白质-脂质溶液在 30°C下加热30分钟，冷却，然后在1-4°C下培养2-16小时。
[0149] 为了除去胆酸盐，用相对7-9体积的1 %蔗糖溶液的10kDa盒进行了UF/DF。
[0150] 然后将溶液浓缩至22-28g/L(FP中的蛋白质浓度为20g/L)或32-38g/L(FP中 的蛋白质浓度为3(^/1)并且此后通过加入蔗糖和1?1带至7.5%蔗糖和2(^/1或30 8/ L蛋白质。将rHDL物质无菌过滤（Sartopore2，150cm2，PES，截留0·lμm，Sartorius Art. 5441358K4-00)，并在层流中填充。
[0151] 使用安珀莱特降低胆酸盐
[0152] 安珀莱特的制备
[0153] 所有过滤步骤使用Nalgene(λ2μπιPES滤器（Art. 595-4520)来进行。
[0154] 将安珀莱特XAD-2(400g)加入500mL20% (v/v)甲醇中。将悬浮液搅拌1-2小 时，然后将安珀莱特滤掉。接着，将300ml1MNaOH置于1000mL烧杯中，加入安珀莱特，并 且在搅拌下加热至55-60°C，持续15分钟。将安珀莱特滤掉；此后将该程序再重复两次。然 后，用水（SWA)洗涤安珀莱特，直至pH中性（大约10-15L)，滤掉，加入300mL甲醇中，搅拌 1小时，然后将混合物在2-8°C下放置至少过夜。为了除去甲醇，将安珀莱特滤掉，用大约 10L水（SWA)洗涤，并再次滤掉。然后，将安珀莱特倒入大约4L蔗糖溶液中，7. 5%或10%， 对应于待耗尽的重建HDL的蔗糖浓度。将混合物搅拌几分钟，并且恰在使用前滤掉。
[0155] 使用安珀莱特