一种发酵制备柠檬酸的方法

专利名称：一种发酵制备柠檬酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵制备柠檬酸的方法。
背景技术：
柠檬酸是目前可以用微生物代谢生产的重要有机酸，其用途非常广泛，主要用于食品工业，其次是医药、纺织、建筑等工业部门；在各种重要器材的清洗、除锈和日用化工等方面也有重要用途。现有技术的柠檬酸发酵过程中，当将黑曲霉种子液培养成熟并移入发酵罐后，通常在发酵的整个过程中对发酵液的pH值不加控制，而在柠檬酸发酵液中，一方面，由于发酵原料(例如，玉米粉和甘薯粉等)中含有丰富的碳源、氮源，所以随着发酵菌种对发酵液中 碳源、氮源地利用，以及柠檬酸和其他代谢产物的积累，会导致发酵液的PH值迅速下降；另一方面由于发酵液所用的原料各不相同(例如，原料的产地、品种、晾晒程度等)，会导致发酵液PH值变化的差异性较大，从而导致黑曲霉菌体不能发挥其最佳效应，进而影响发酵菌种的代谢活动和朽1檬酸的合成。由此可见，发酵液的pH值是发酵过程控制的难点，也是导致发酵效率不稳定的重要因素，从而会影响柠檬酸的发酵酸度、发酵转换率和发酵强度。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术在柠檬酸发酵过程中对发酵液pH值控制的不易，发酵效率不稳定，柠檬酸的发酵酸度低、发酵转化率低和发酵强度低的缺点，提供一种发酵制备柠檬酸的方法，以达到在发酵过程中对发酵液PH值的有效控制，稳定发酵效率，从而提高柠檬酸的发酵酸度、发酵转化率和发酵强度。本发明的发明人发现，由于黑曲霉朽1檬酸的发酵适宜在低pH值(一般pH值低于
2.5)的条件下进行，所以现有技术对整个发酵过程的pH值不加控制，以致在发酵前期发酵液的PH值便迅速下降并接近2. 2，甚至更低，但是，研究发现，黑曲霉的最适生长的pH值为2. 8-4. 5，而在发酵前期，黑曲霉正处于生长的对数期和其自身代谢的糖化酶体系发挥作用的关键时期，较低的PH值严重地影响了黑曲霉的生长和代谢活动，所以采用现有技术生产朽1檬酸，朽1檬酸的发酵效率不稳定，发酵酸度、发酵转化率和发酵强度较低的一个重要原因是在发酵前期发酵液的PH过低，一方面，使正处于生长对数期的黑曲霉的生长受到了抑制，从而导致了菌体生长不足和菌体早衰，影响了柠檬酸的发酵酸度、发酵转化率和发酵强度及后续对柠檬酸的压滤、中和提取等程序；另一方面，此阶段内主要依靠发酵菌种自身代谢的糖化酶体系将发酵液进行糖化，因此，过低的PH值也影响了其自身代谢的糖化酶体系对发酵液进行有效地糖化，从而导致了原料的利用率过低。因此，在发酵前期对发酵液的PH值进行适当的调节，使其有利于菌体的生长和自身代谢糖化酶体系作用的发挥，可有效地稳定发酵效率，从而提高柠檬酸的发酵酸度、发酵转化率和发酵强度。因此，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括，在生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种到发酵培养基中进行发酵并产生柠檬酸，其中，在发酵前期对发酵液的PH值进行调节，并维持所述发酵液的pH值不低于2. 8 ;所述发酵前期为将黑曲霉接种到发酵培养基中开始至发酵20小时的时间段。优选地，维持所述发酵液的pH值为2. 8-4. 5，更优选地，维持所述发酵液的pH值为
3.0_3· 5 ο通过上述技术方案来生产柠檬酸，实现了在发酵前期对发酵液pH值的有效控制，保证了菌体的正常生长和自身代谢的糖化酶体系作用的发挥，从而稳定了发酵效率，有效地提高了柠檬酸的发酵酸度、发酵转化率和发酵强度。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式
部分予以详细说明。
具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式
进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式
仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。根据本发明，所述柠檬酸制备的方法包括在生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种到发酵培养基中进行发酵，其中，在发酵前期对发酵液的PH值进行调节，并维持所述发酵液的PH值不低于2. 8 ;所述发酵前期为将黑曲霉接种到发酵培养基中开始至发酵20小时的时间段。根据本发明，在所述发酵前期，黑曲霉正处于生长的对数期，也是菌体自身代谢的糖化酶体系发挥作用的关键时期，但随着发酵菌种产柠檬酸速率的加快和其它代谢产物的积累，所述发酵液的PH值呈迅速下降趋势，甚至低于2. 2。通常情况下，黑曲霉最适生长的pH值为2. 8-4. 5，而黑曲霉柠檬酸发酵的最适pH值为I. 8-2. 8，由于此阶段主要用于发酵菌种的生长和其自身代谢的糖化酶体系的作用，所以，在发酵前期对发酵液的PH值进行调节是保证黑曲霉生长和其自身代谢的糖化酶体系作用的关键。根据本发明，在发酵前期为了使黑曲霉迅速生长并达到最大量并且使其自身代谢的糖化酶体系发挥最大的作用，所以，在发酵前期对发酵液的PH值进行调节后，优选情况下，维持所述发酵液的PH值为2. 8-4. 5 ;更优情况下，维持所述发酵液的pH值为3. 0-3. 5。在此PH值范围内可以确保黑曲霉顺利生长和其自身代谢的糖化酶体系作用的发挥。根据本发明，在所述发酵前期对发酵液进行pH值调节的方法为向所述发酵液中添加碱性物质，所述碱性物质的可选范围较宽，例如，可以选自氨水、碳酸钙、碳酸氢钙等碱性或弱碱性物质中的一种或多种。根据本发明，所述碱性物质的加入形式可以以固体形式加入,也可以以其水溶液和/或悬浊液的形式加入，优选情况下，以其水溶液和/或悬浊液的形式加入到所述发酵液中。同时，一方面为了不使所述碱性物质水溶液和/或悬浊液加入到发酵液中时引起发酵液局部PH值过高而对菌体造成杀伤作用；另一方面，为了不使所述碱性物质水溶液和/或悬浊液由于浓度过低而加入的量过多，从而对发酵液造成稀释，所以，优选情况下，所述碱性物质水溶液的浓度和/或悬浊液的固含量，例如，氨水为2-5体积％、碳酸钙悬浊液的固含量为3-6重量％、碳酸氢I丐悬池液的固含量为4-8重量％。根据本发明，所述碱性物质水溶液和/或悬浊液的配制方法为本领域技术人员所公知，例如，可以在量筒中量取和/或在分析天平上称取所述碱性物质，并将其溶于无菌水中，搅拌将其溶解或使其成悬浊液匀浆。本发明的发明人发现，从将黑曲霉接种到发酵液中开始至发酵3小时的时间段内，由于黑曲霉处于对发酵环境的适应调整阶段，所述发酵液的PH值变化较小，基本保持在3. 3-3. 6，但随着适应调整阶段的结束，产酸阶段的开始，发酵液的pH值迅速下降，且不再适合黑曲霉的生长，所以，优选情况下，开始向所述发酵液中添加所述碱性物质的时机为发酵3-5小时之间(包括发酵至第3小时和第5小时的时间点)，以保证在所述发酵前期所述发酵液的pH值一直维持在上述优选范围内。根据本发明，向所述发酵液中添加所述碱性物质的方法为下述方法中的任意一种方法(I):向所述发酵液中连续添加所述碱性物质；方法(2):向所述发酵液中分多次添加所述碱性物质，相邻两次添加的时间间隔为2-5小时； 方法(3)向所述发酵液中一次性添加所述碱性物质，一次性添加所用的时间为30_60mino根据本发明，方法(I)中，当以连续添加的方式加入碱性物质时，通常以碱性物质水溶液和/或悬浊液的形式加入，并优选使所述碱性物质水溶液的浓度和/或悬浊液的固含量在上述优选范围内，其流速的控制可以根据发酵液的pH值，以及通过对发酵液的pH值进行实时监控得到的数据进行实时调整，以使在发酵前期发酵液的PH值始终维持不低于
2.8，优选pH值为2. 8-4. 5，更优选pH值为3. 0-3. 5，通常情况下，以每升发酵液为基准，所述碱性物质的流速为(O. 4-0. 8) X 10_3L/(L · h)。根据本发明，方法(2)中，当以分多次添加的方式加入碱性物质时，所述碱性物质的加入形式可以以固体形式加入，也可以以其水溶液和/或悬浊液的形式加入，但通常以其水溶液和/或悬浊液的形式加入，并优选使所述碱性物质水溶液的浓度和/或悬浊液的固含量在上述优选范围内，其每次的添加量和相邻两次添加的间隔时间可以根据发酵液的PH值，以及通过对发酵液的pH值每隔一段时间进行检测得到的数据进行调整(例如，添加一次后，每隔1-2小时对发酵液的pH值进行检测，当发酵液的pH值下降至接近
2.8时，再次进行添加)，以使在发酵前期发酵液的pH值始终维持不低于2. 8，优选pH值为
2.8-4. 5，更优选pH值为3. 0-3. 5，通常情况下，以每升发酵液为基准，其每次的添加量为(I. 6-3. 2) X 10_3L/L，相邻两次添加的时间间隔优选为2-5小时，更优选为3_4小时。根据本发明，方法(3)中，当以一次性添加的方式加入碱性物质时，所述碱性物质的加入形式可以以固体形式加入，也可以以其水溶液和/或悬浊液的形式加入，但通常以其水溶液和/或悬浊液的形式加入，并优选使所述碱性物质水溶液的浓度和/或悬浊液的固含量在上述优选范围内，一次性的添加量可以为(4-8) X 10_3L/L发酵液，并在30-60min时间内加完所述碱性物质，此添加量范围可保证在发酵前期发酵液的PH值始终维持不低于2. 8，优选pH值为2. 8-4. 5，更优选pH值为3. 0-3. 5。本发明的发明人发现，由于方法(I)采用连续性的方法向发酵液中添加碱性物质，同时对发酵液的PH值进行实时监控，可使发酵前期发酵液的pH值始终维持在本发明的最优范围内。因此，最优选情况下，采用方法(I)对发酵液的pH值进行调节。优选情况下，在发酵前期对发酵液的pH值进行调节的同时对发酵液进行搅拌，以使发酵液和碱性物质快速混合均匀。根据本发明，对所述发酵液pH值进行测定的方法和设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用PH计(购自梅特勒-托利多，型号为DELTA320)对所述发酵液的pH值进行测定。根据本发明，对发酵培养基的成分没有特别的要求，只要可以用于柠檬酸发酵的发酵培养基即可。优选地，所述发酵培养基含有淀粉质原料酶解产物氮源含量为O. 06-0. 14重量％，磷源含量为O. 005-0. 07重量％，无机盐含量O. 1-2. 6重量％，水含量为77-86重量％ ；所述发酵液的总糖含量为10-20重量％。一般地，淀粉质原料酶解得到液化液，液化液经过分离得到淀粉质原料酶解残渣和淀粉质原料酶解液化清液，通常可以将淀粉质原料酶解液化清液用于制备发酵培养基，也可以将淀粉质原料酶解液化清液与淀粉质原料酶解残渣混合后用于制备发酵培养基，还可以将淀粉质原料酶解液化清液与液化液混合后用于制备发酵培养基。本发明所述淀粉质原料酶解产物优选由液化液和淀粉质原料酶解液化清液与水混合或不与水混合得到，且进一步优选以所述发酵培养基的总重量为100重量份为基准， 所述淀粉质原料酶解液化清液的用量为75-85重量份，所述液化液的用量为15-20重量份，水的用量为0-5重量份。根据本发明，所述淀粉质原料酶解液化清液可以通过多种方法制备得到，例如，可以通过如下方法制备得到将淀粉质原料粉碎，将粉碎后的产物进行酶解，得到酶解产物，将酶解产物固液分离，得到淀粉质原料酶解液化清液和淀粉质原料酶解残渣，所述固液分离的条件使淀粉质原料酶解残渣的固含量为5-60重量％，更优选为30-50重量％。根据本发明，所述淀粉质原料可以为本领公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或几种，优选情况下，所述淀粉质原料为玉米。所述酶解步骤可以通过本领域常用的方法完成，比如向粉碎产物中添加产酶微生物和/或酶，在产酶微生物的生长温度和/或酶有活力的温度下保温完成。所述产酶微生物为能够分泌淀粉酶的产酶微生物。所述酶包括淀粉酶。由于微生物生长会产生副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克粉碎后的粉碎产物的干重计，所述淀粉酶的用量为15-50个酶活力单位。本发明所述酶的酶活力单位的定义为在pH值为6. O、温度为70°C的条件下，I分钟将I毫克淀粉转化为还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。所述酶解的温度可以在很大范围内改变，优选为80_120°C，更优选为90_105°C。所述酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选所述酶解的时间为90-150分钟，更优选为100-120分钟。所述酶解的pH值可以在很大范围内改变，优选为5. 0-7. 0，更优选PH值为5. 6-6.0。淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，其具体选择为本领域技术人员所公知，例如，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和异淀粉酶。根据本发明，优选使用α -淀粉酶和/或异淀粉酶。根据本发明，所述黑曲霉的接种量可以在很大范围内改变，优选情况下，以每毫升发酵液为基准，黑曲霉的接种量为I X 104-2. 5 X IO5个孢子，更优选3 X IO4-L 5 X IO5个孢子。所述孢子数可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数。本发明发酵所使用的黑曲霉可以为商购的黑曲霉固体制剂或黑曲霉菌种，例如，黑曲霉Co827 (上海工业微生物研究所)和黑曲霉TOl (天津工业微生物所)。所述黑曲霉可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至发酵液中之前，将所述黑曲霉经过种子培养处理，之后将得到的种子液加入到发酵液中。黑曲霉种子培养的程度可以通过取样显微镜镜检、酸度测定和PH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2. 0-2. 5、酸度O. 8-2. 0%、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时停止培养。优选情况下，所述种子培养处理的方法包括将黑曲霉接种在黑曲霉培养液中进行培养，所述黑曲霉培养液中含有10-17重量％的玉米粉，接种后黑曲霉培养液中黑曲霉的浓度为3X 105-4X 105个孢子/毫升。 根据本发明，所述黑曲霉培养液的制备方法没有特别的限制，只要得到的培养液能够适用于黑曲霉的培养即可。根据本发明，所述黑曲霉种子的培养条件可以在很大范围内改变，例如所述培养的条件可以包括培养的温度可以为30-42°C，pH值可以为1-7，通气量可以为O. 1-1. O体积体积 分钟，压力可以为0-0. IMpa，培养的时间可以为18-35小时；更优选的情况下，培养的温度为32-40°C，pH值为2-6，通气量为O. 1-0. 8体积体积 分钟，压力为0-0. 08Mpa,培养的时间为20-30小时；进一步优选的情况下，培养的温度为33-38°C，pH值为2_5，为了进一步提高种子的质量，在种子培养的0-10小时的时间段内，通气量为O. 1-0. 3体积体积·分钟，压力为0-0. 03Mpa，在种子培养的10-16小时的时间段内，通气量为O. 3-0. 5体积体积 分钟，压力为O. 03-0. 05Mpa，在种子培养的16小时以后，通气量为O. 5-0. 8体积体积·分钟，压力为O. 05-0. 08Mpa，培养的时间为24-30小时。根据本发明，所述发酵的条件除发酵前期的pH值在本发明所述的范围内之外没有特别的限制，可以为本领域常规的发酵条件，例如，所述发酵的条件可以包括温度为30-400C，优选为34-38°C ;通气量为O. 1-1体积体积 分钟，优选为O. 3-1. O体积体积 分钟，为了进一步缩短发酵时间以及提高发酵效率，更优选为在发酵0-6小时的时间段内，通气量为O. 6-0. 8体积体积·分钟，在发酵6-24小时的时间段内，通气量为O. 8-1. O体积体积 分钟，在发酵24-40小时的时间段内，通气量为O. 6-0. 8体积体积 分钟,在发酵的40小时以后，通气量为O. 3-0. 6体积体积·分钟；压力为O. 01-0. 06，优选为O. 03-0. 05 ；时间为50-65小时，优选为55-62小时。术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(V / V · min)，例如通气比为1:0. 1_1，简称通气量为O. 1-1体积体积·分钟。所述培养的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐进行培养。按照本发明的方法制备得到的发酵产物柠檬酸可以用常规的方法，根据不同工业产品的要求分离并精制，比如中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式
中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。下面根据制备例、实施例和对比例详细说明本发明提供的柠檬酸的发酵方法。其中，发酵酸度、发酵转化率及发酵强度通过如下方法计算。发酵酸度根据GB 1987-2007标准检测发酵后发酵液的浓度(简称酸度)。发酵转化率通过上述发酵酸度计算柠檬酸的转化率，转化率(％)=发酵液的浓度 (简称酸度)X发酵液的体积/总糖的重量X100%，其中，总糖的重量包括种子罐用糖重量和发酵罐用糖重量。发酵强度单位体积的发酵液在单位时间内所生成的柠檬酸的质量。制备例I发酵用发酵液的制备I)原料的粉碎将收获的玉米在热水槽浸润，直至玉米的含水量为15重量％，然后通过粉碎机(江苏牧羊集团有限公司，968-3型)进行粉碎，得到淀粉质原料粉碎产物(粉碎颗粒中50重量％的颗粒直径小于O. Icm)；2)调浆将水与在I)中得到的淀粉质原料粉碎产物混合进行调浆得到淀粉浆液，所述淀粉质原料粉碎产物与水的重量比为I :3，淀粉浆液的pH值为5. 5 ；3)酶解在2)得到的淀粉浆液与淀粉酶(诺维信公司，α _淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶)混合，在90°C、pH为5. 5的条件下进行酶解100分钟，相对于每克粉碎后的产物，淀粉酶的用量为40酶活力单位，得到玉米液化液；4)过滤将3)得到的80重量％的酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出玉米液化清液和玉米酶解残渣；5)配制发酵培养基将上述玉米液化清液和玉米液化液以80 15的体积比混合后加入到发酵罐中，高温高压灭菌后得到发酵培养基，所述发酵培养基中总糖的含量为15. 5重量％，氮源含量为O. I重量％,磷源质量含量为350mg/L。制备例2发酵菌种种子液的制备将制备例I的步骤3)中的部分玉米液化液加水稀释至总糖的含量为11重量％，将培养液投入种子罐，加热到121 °C消毒，维持20分钟后快速降温至36°C，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为每毫升培养液为基准，接种IXlO5个孢子)，温度为37°C，从第0-10小时的时间段内通气量为O. IV /V ·π η、通入的空气压力为0-0. 02Mpa，并在此阶段内维持此罐压，第10-16小时的时间段内通气量为O. 3V / V · min、通入的空气压力为O. 03-0. 04Mpa，并在此阶段内维持此罐压，16小时以后的通气量为O. 3V / V ·π η、通入的空气压力为O. 05-0. 06Mpa,并在此阶段内维持此罐压的条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和PH测定对黑曲霉的生长进行观察，24小时之后，当pH在2. O、酸度I. Og/L、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。
制备例3碱性物质水溶液和/或悬浊液的制备氨水将液氨和水在通风橱内以一定体积比进行混合，配制浓度为3体积％的氨水溶液；碳酸钙在分析天平上称取一定量的碳酸钙粉末，并加入无菌水配制成浓度为5重量％的碳酸I丐悬池液；碳酸氢钙在分析天平上称取一定量的碳酸氢钙粉末，并加入无菌水配制成浓度为7重量％的碳酸氢I丐悬池液；实施例I
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。将制备例2中培养的黑曲霉种子液加入到制备例I的发酵培养基中开始发酵，其中，以每毫升发酵培养基计，黑曲霉的接种量为3. OX IO4个孢子，发酵条件包括温度为37°C，培养的压力为O. 04Mpa，从第0_6小时的时间段内通气量为O. 8体积体积·分钟，第6-24小时的时间段内为I. O体积体积·分钟，第24-40小时的时间段内为O. 8体积体积·分钟，40小时以后为O. 6体积体积·分钟。在发酵的第3小时开始向发酵液中连续性添加浓度为7重量％碳酸氢钙悬浊液，其中，以每升发酵液计，碳酸氢钙悬浊液添加的流速为(O. 4-0. 6) X 10_3L/(L · h)，维持发酵液的pH值为3. O (整个过程对发酵液的pH值进行实时监控，根据监控数据实时调整添加流速，以保证在整个发酵前期，发酵液的PH值均维持在3. O)。在发酵至20小时的时候停止加入碳酸氢钙悬浊液，发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。根据GB 1987-2007标准检测实施例I中所得柠檬酸溶液的浓度(简称酸度)，计算柠檬酸的转化率和柠檬酸的发酵强度，转化率(％) =柠檬酸溶液的浓度(简称酸度)X柠檬酸溶液的体积/总糖的重量X 100%,柠檬酸的发酵强度(单位体积的发酵液在单位时间内所生成的柠檬酸质量)，结果如表I所示。实施例2本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。按照与实施例I相同的方法和条件向发酵培养基中进行接种并培养，其中，不同在于在发酵的第5小时开始向发酵液中连续性添加浓度为3体积％氨水溶液，其中，以每升发酵液计，氨水溶液添加的流速为(O. 7-0. 8)X 10_3L/(L *h)，维持发酵液的pH值为3. 5 (整个过程对发酵液的PH值进行实时监控，根据监控数据实时调整添加流速，以保证在整个发酵前期，发酵液的PH值均维持在3. 5)。在发酵至20小时的时候停止加入氨水溶液，发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。按照与实施例I相同的方法检测实施例2中所得的柠檬酸溶液的酸度，并计算柠檬酸的转化率和柠檬酸的发酵强度，结果如表I所示。实施例3本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。按照与实施例I相同的方法和条件向发酵培养基中进行接种并培养，其中，不同在于在发酵的第4小时开始向发酵液中连续性添加浓度为5重量％碳酸钙悬浊液，其中，以每升发酵液计，碳酸钙溶液添加的流速为(O. 6-0. 7) X IO-3L/ (L-h),维持发酵液的pH值为
3.2 (整个过程对发酵液的pH值进行实时监控，根据监控数据实时调整添加流速，以保证在整个发酵前期，发酵液的PH值均维持在3. 2)。在发酵至20小时的时候停止加入碳酸钙悬浊液，发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。按照与实施例I相同的方法检测实施例3中所得的柠檬酸溶液的酸度，并计算柠檬酸的转化率和柠檬酸的发酵强度，结果如表I所示。实施例4本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。按照与实施例I相同的方法和条件向发酵培养基中进行接种并培养，其中，不同在于在发酵的第4、8、12、16小时向发酵液中分4次添加浓度为5重量％碳酸I丐悬池液,其 中，以每升发酵液计，每次添加的碳酸钙悬浊液的添加量为(2. 5-2. 8) XlO-VL (保证开始添加时发酵液的PH值不高于3. 5，下一次开始添加前发酵液的pH值不低于3. O)并每隔I小时对发酵液的PH值进行检测，根据检测数据调整添加量，以保证在整个发酵前期，发酵液的PH值均维持在3. 0-3. 5之间。发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。按照与实施例I相同的方法检测实施例4中所得的柠檬酸溶液的酸度，并计算柠檬酸的转化率和柠檬酸的发酵强度，结果如表I所示。实施例5本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。按照与实施例I相同的方法和条件向发酵培养基中进行接种并培养，其中，不同在于在发酵的第4小时时向发酵液中一次性添加浓度为5重量％碳酸I丐悬池液,其中，以每升发酵液计，碳酸钙溶液的添加量为6X 10_3L/L (保证开始添加时发酵液的pH值不高于
4.5，发酵20小时时发酵液的pH值不低于2. 8)，在60min时间内加完添加上述量的碳酸钙悬浊液，以保证在整个发酵前期，发酵液的pH值均维持在2. 8-4. 5之间,发酵至60小时,对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。按照与实施例I相同的方法检测实施例5中所得的柠檬酸溶液的酸度，并计算柠檬酸的转化率和柠檬酸的发酵强度，结果如表I所示。对比例I本对比例用于说明现有技术提供的发酵柠檬酸制备的方法。按照与实施例I相同的方法和条件向发酵培养基中进行接种并培养，其中，不同在于整个发酵过程中均不向发酵液中添加碱性物质，发酵至60小时，对发酵产物进行固液分离得到柠檬酸溶液，并通过中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装等过程精制得到的柠檬酸溶液。按照与实施例I相同的方法检测对比例I中所得的柠檬酸溶液的酸度，并计算柠檬酸的转化率和柠檬酸的发酵强度，结果如表I所示。表I
实施例编号酸度(％)转化率(％)发酵强度(kg/(m3h))
实施例 I15.0597. 102. 595
实施例 215. 1197.482.605
实施例 3 Γ096. 772. 586
实施例 414.8896.002.480
实施例 514.8095.432.420
对比例 I14. 5694. 322.249 从上表I的数据可以看出，与对比例I相比，实施例1-5采用本发明提供的柠檬酸的制备方法，在发酵前期向发酵培养基中添加碱性物质来对发酵液的PH值进行调节，并将PH值控制在本发明的范围内，有效地提高了发酵终点时柠檬酸的发酵酸度、发酵转换率和发酵强度；其中，实施例1-3采用连续性的方法向发酵液中添加碱性物质，效果最佳；实施例4采用分多次向发酵液中添加碱性物质，效果次之；实施例5采用一次性向发酵液中添加碱性物质，效果最差。
权利要求
1.一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括，在生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种到发酵培养基中进行发酵，其特征在干，在发酵前期对发酵液的PH值进行调节，并维持所述发酵液的PH值不低于2. 8 ;所述发酵前期为将黑曲霉接种到发酵培养基中开始至发酵20小时的时间段。
2.根据权利要求I所述的方法，維持所述发酵液的pH值为2.8-4. 5。
3.根据权利要求2所述的方法，維持所述发酵液的pH值为3.0-3. 5。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，pH值的调节方法为向所述发酵液中添加碱性物质，所述碱性物质选自氨水、碳酸钙和碳酸氢钙中的ー种或多种。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，开始向所述发酵液中添加所述碱性物质的时机为发酵3-5小时之间。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述碱性物质的添加方式为下述方法中的任意ー种 方法(I):向所述发酵液中连续添加所述碱性物质； 方法(2):向所述发酵液中分多次添加所述碱性物质，相邻两次添加所述碱性物质的时间间隔为2-5小时； 方法(3):向所述发酵液中一次性添加所述碱性物质，一次性添加所用的时间为.30_60mino
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中，所述发酵培养的条件包括培养的温度为33-40°C，通气量为O. 1-1体积体积·分钟，培养的时间为50-65小吋。
8.根据权利要求I所述的方法，其中，以每毫升发酵液为基准，黑曲霉的接种量为1Χ104-2. 5X IO5 个孢子。
9.根据权利要求I所述的方法，其中，所述发酵液含有淀粉质原料酶解产物，所述淀粉质原料酶解产物中，氮源含量为O. 06-0. 14重量％，磷源含量为O. 005-0. 07重量％，无机盐含量O. 1-2. 6重量％，水含量为77-86重量％ ;所述发酵液的总糖含量为10-20重量％。
全文摘要
本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括，在生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种到发酵培养基中进行发酵，其特征在于，在发酵前期对发酵液的pH值进行调节，并维持所述发酵液的pH值不低于2.8；所述发酵前期为将黑曲霉接种到发酵培养基中开始至发酵20小时的时间段；本发明通过向发酵液中添加碱性物质来对发酵液的pH值进行调节。采用本发明提供的柠檬酸的制备方法，有效地稳定了发酵效率，从而提高了发酵终点时柠檬酸的发酵酸度、发酵转换率和发酵强度。
文档编号C12R1/685GK102851330SQ201210356188
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者夏令和, 卢宗梅, 邵引刚, 杨儒文, 钟华 申请人:中粮生物化学(安徽)股份有限公司