专利名称：一种用于结直肠癌大量筛查的生物标记物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种结直肠癌筛查的技术领域，具体涉及一种用于结直肠癌大量筛查的生物标记物，即通过对DNA样品中该生物标记物的甲基化状态进行检测以确定罹患结直肠癌的可能性。
背景技术：
结直肠癌是世界最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤的第三位，且呈上升趋势。北美和西欧国家结直肠癌发病率分别达44. 4/10万和42. 9/10 万，我国也已达13. 29/10万。结直肠癌一般会经历7 10年的从正常粘膜组织、腺瘤、再到恶性肿瘤的演变过程。结直肠癌的早期治愈率可达90%，但晚期治愈率仅为5%。因此，早期筛查和手术切除腺瘤或早期恶性肿瘤对降低结直肠癌的死亡率意义重大。
结直肠癌传统的筛查方法包括粪便潜血试验、粪便免疫试验、结肠钡剂灌肠检查、 乙状结肠镜检查及结肠镜检查。其中，粪便潜血试验和粪便免疫试验具有一定的特异性和灵敏性，但前提是患者已存在明显的肿瘤大小，因此不适用于结直肠癌的早期检测。内窥镜检查是目前结直肠癌筛查的最好方法，但由于这种方法侵入性、费用高、风险大、易产生并发症等缺陷限制了其在普查筛选中的应用。因此需要寻找一种方便、经济、无创，且具有较高检出率的方法用于结直肠癌的大规模筛查。
最近研究发现DNA甲基化状态改变与癌症的发生发展关系密切。DNA甲基化主要出现在基因启动子区域的CpG岛中的胞嘧啶，通过阻碍转录因子的结合从而导致基因表达沉默。已经发现在许多癌症中都存在抑癌基因、DNA修复基因、细胞周期调节基因的高甲基化。因此肿瘤相关基因的甲基化是癌症的重要指标，可作为结直肠癌的早期检测与诊断的生物标记物。
随着对结直肠癌研究的深入，发现许多抑癌基因、致癌基因和细胞信号转导通路参与了肠上皮细胞的癌转化以及肿瘤发展，其中Wnt信号通路的调控作用尤为重要。Wnt的途径激活涉及Wnt蛋白与细胞表面受体Frizzled和联合受体LRP5/6的结合，并导致APC/ Axin/CKla/GSK3 β复合物解体，促进β-catenin入核,从而激活下游祀基因表达。研究发现，Wnt信号通路的异常激活在结直肠癌发生发展中起重要作用。Wnt信号通路的两个重要成员APC或β -catenin在80 90%的结直肠癌患中发生了突变。
结直肠癌中Wnt信号通路可受多种机制调控，如通路成员的突变、表观遗传沉默基因表达、配体激活和拮抗基因的抑制等。目前发现多种能调控Wnt信号通路的蛋白，包括SFRP蛋白家族、WIFUWise和DKK蛋白家族等。R-spondin (RSPO)是近年来发现能够调控Wnt信号通路的一个新蛋白家族。RSPO家族由4个富含半胱氨酸的分泌蛋白组成，即 RSP01、RSP02、RSP03和RSP04。RSPO家族蛋白参与了多种生物学进程，如细胞增殖，胚胎发育，骨骼形成，肌肉细胞分化，肿瘤的发生等。
R-spondin2 (RSP02)是RSPO家庭成员之一，其具有多种生物学功能。RSP02基因位点与人类Dupuytren疾病的遗传易感性相关。RSP02通过调节Wnt信号通路影响狗毛的样式。RSP02同时是脊椎动物胚胎发育的关键基因，RSP02基因敲除小鼠在出生后立即死亡，并携带多种生理缺陷，如肢体发育不全，颅面和喉气管畸形，肺发育不良。最近研究发现 RSP02与癌症的发生相关。一项研究表明，RSP02可以影响乳腺上皮细胞的生长和促进肿瘤转移。在结直肠癌中，FOXQl基因的过表达显著改变RSP02的表达。已经发现RSP02的 mRNA和蛋白表达在结直肠癌细胞及组织中明显下调。进一步研究发现，肠癌细胞的RSP02 甲基化水平显著高于对照细胞。对临床样品检测也发现RS0P2的甲基化程度与结直肠癌高度相关。因此，RSP02甲基化可作为结直肠癌早期检测或筛查的有用标记。
目前，现有技术虽然存在对DNA基因甲基化的检测方法但并没有具体对RSP02基因进行甲基化的检测方法进行研究。发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于结直肠癌大量筛查的生物标记物，可以通过该生物标记物筛查人类患结直肠癌的可能性；本发明的另一目的在于提供了一种RSP02基因甲基化的MSP检测方法，实现了 RSP02基因的甲基化检测。
为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案一种用于结直肠癌大量筛查的生物标记物，所述的生物标记物为RSP02基因。
作为优选，用MSP检测结直肠癌细胞中RSP02甲基化状态时使用的引物对为对 RSP02甲基化状态有特异性的上游引物RSP02-M1和下游引物RSP02-M2，引物对的序列如下
权利要求
1.一种用于结直肠癌大量筛查的生物标记物，其特征在于所述的生物标记物为 RSP02基因。
2.根据权利要求I所述的用于结直肠癌大量筛查的生物标记物，其特征在于用MSP 检测结直肠癌细胞中RSP02甲基化状态时使用的对RSP02甲基化状态有特异性的上游引物 RSP02-M1和下游引物RSP02-M2，引物对的序列如下引物名称引物序列RSP02-M1TTGTATTTTTATCGGAAAGTGCRSP02-M2ATATCGCTTCCTACGCTTTC
3.根据权利要求I或2所述的用于结直肠癌大量筛查的生物标记物，其特征在于所述的包含RSP02基因的基因组DNA来源于结直肠癌细胞。
4.一种RSP02基因甲基化的MSP检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)提取包含RSP02基因的基因组DNA，用分光光度计检测DNA纯度与含量；(2)对提取的包含RSP02基因的基因组DNA用亚硫酸氢钠进行处理修饰；(3)以步骤(2)中处理修饰后的DNA为模板，设计RSP02甲基化特异性引物，取RSP02 甲基化特异性引物、DNA聚合酶、PCR反应缓存液、dNTP、去离子水混合，进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性3 min, 940C 30 S、退火45 s、72°C 40 s共37个循环， 72°C延伸 10 min ；(4)PCR反应结束后，取PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测；(5)对检测结果进行分析，对RSP02甲基化的特异性引物扩增出139bp条带的PCR产物为甲基化阳性，即存在RSP02甲基化。
5.根据权利要求4所述的RSP02基因甲基化的MSP检测方法，其特征在于所述的步骤(3)中的RSP02甲基化特异性引物对的序列如下引物名称引物序列RSP02-M1TTGTATTTTTATCGGAAAGTGCRSP02-M2ATATCGCTTCCTACGCTTTC
6.根据权利要求4所述的RSP02基因甲基化的MSP检测方法，其特征在于所述的包含RSP02基因的基因组DNA来源于粪便。
全文摘要
本发明公开了一种用于结直肠癌大量筛查的生物标记物，为RSPO2基因。本发明还公开了一种RSPO2基因甲基化的MSP检测方法，包括以下步骤提取包含RSPO2基因的基因组DNA，检测其纯度与含量；用亚硫酸氢钠进行处理修饰；以步骤处理修饰后的DNA为模板，设计RSPO2甲基化特异性引物，进行PCR扩增，结束后，取PCR产物电泳检测；分析结果，对RSPO2甲基化的特异性引物扩增出139bp条带的PCR产物为甲基化阳性，即存在RSPO2甲基化。本发明利用RSPO2作为结直肠癌大量筛查的生物标记物，并且提供了RSPO2甲基化状态检测方法，可检测患者是否患有结直肠癌，具有非侵入性、样品收集方便灵活等特点。
文档编号C12N15/12GK102936597SQ20121035630
公开日2013年2月20日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者鲁新成, 路立婷, 廖婉琴, 武长杰, 邱孙全 申请人:温州医学院