专利名称：胺羟酰氯色谱衍生试剂及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高灵敏度液相色谱衍生试剂胺羟酰氯及其制备工艺，该种衍生试剂化学名称为2-硝基-4-(2-邻苯二甲酰基)苯甲酰氯，适用于胺基、羟基及氨基酸类化合物的液相色谱柱前衍生紫外及荧光检测。
液相色谱技术已成为科研和技术鉴定部门广泛使用的一种手段，通常可以装配紫外可见、示差折光、荧光、电化学和化学发光检测器。但迄今为止，还没有一种通用型高灵敏度的检测器能完成所有各类物质的定性定量任务。为了使在这些检测器上响应很小的化合物也能被检测出来，近年来发展了多种衍生化方法。使带有氨基(-NH2)、羟基(-OH)、羰基(＞C=O)和羧基(-COOH)的化合物及氨基酸，通过与各类带有发色基团的衍生化试剂相反应，生成的有紫外或荧光吸收的衍生化产物，就能用现有的这几种高灵敏度检测器检测。除此之外，通过被测化合物能否与特定的衍生化试剂相反应，也有利于鉴别这些化合物的结构。因此，液相色谱中的衍生化方法得到了广泛的应用，新的衍生化试剂不断出现。
2,4-二硝基氟苯(UV350nm)适用于仲胺的衍生，对硝基苯甲酰氯(UV254nm)适用于伯胺及仲胺的衍生，茚三酮(VS570nm)适用于氨基酸的衍生，这些衍生试剂属于紫外可见类衍生试剂，一般来讲不及荧光类衍生试剂灵敏度高。常见的荧光类衍生试剂有邻苯二甲醛、荧光胺、丹酰氯、芴代甲氧基酰氯、吡多醛、丹酰肼和4-溴甲基-7-甲氧基香豆素。邻苯二甲醛反应温度低、时间短，对伯胺和氨基酸的检测限可达10-12～10-15，但在反应中需加入硫醇作辅助试剂，并且对羟基化合物不响应。丹酰氯是另一种应用最广泛的荧光衍生试剂，适用于氨基酸、胺类及酚类化合物反应的检测，但其保存期较短。
本发明以邻苯二甲醛和2-硝基-4-氨基苯甲酸为主要原料，分两步合成胺羟酰氯。胺羟酰氯为无色细针状晶体，分子量316，分子式C15H9N2O4Cl，结构式
胺羟酰氯属于酰氯类化合物，对于胺基、羟基及氨基酸类化合物具有较强的反应活性。在胺羟酰氯分子中存在着22中心25电子的大分子共轭体系，有利于吸收紫外光并发射出荧光。实验发现，胺羟酰氯对于300nm紫外光有强吸收特征，并可产生强荧光。当与被检测物衍生后，由于分子结构的增大，其紫外吸收波长将产生不同程度的红移。
丹酰氯是一种常用的衍生试剂，适用于氨基酸及酚类化合物的痕量检测，但其同伯胺和仲胺的反应速度较慢，并且其为液体保存期较短。与丹酰氯相比，胺羟酰氯不仅适用于氨基酸、胺类及酚类化合物的痕量检测，而且其反应活性和检测灵敏度均大于丹酰氯。胺羟酰氯为固体试剂，在室温干燥条件下可保存3年以上。
本发明的主要技术内容在于1在磁力搅拌条件下，邻苯二甲醛和2-硝基-4-氨基苯甲酸在乙醚介质中缩合成2-硝基-4-(2-邻苯二甲酰基)苯甲酸。该操作在室温温避光环境中进行，并以金属钠作为脱水剂和抗氧化剂。
2将上述所得的2-硝基-4-(2-邻苯二甲酰基)苯甲酸风干，以氯仿作介质搅拌成悬浊液，加热至沸腾，以亚硫酰氯进行酰氯化。回馏30分钟，得胺羟酰氯粗品。
3以氯仿洗涤除去墨绿色杂质，活性炭吸附橙色杂质，以苯作溶剂进行重结晶得无色细针状晶体。合成产率41.5％，产品于干燥器中密封保存。
合成实例在500ml棕色试剂瓶中，依次加入500ml乙醚(瓶中空气少，可减轻氧化副反应)、6.8g 2-硝基-4-氨基苯甲酸，金属钠三粒和直径3mm长2cm的铁棒，磁力搅拌至全部溶解，加入邻苯二甲醛5.0g，加盖密封。20℃条件下，避光搅拌1h。过滤，从滤液中回收乙醚，滤渣风干，轻压得白色粉末。
将上述所得白色粉末置于250ml磨口锥形瓶中，加入铁磁针，数粒碎瓷片及氯仿200ml，磁力搅拌成悬浊液，加热至沸腾，回馏，滴加亚硫酰氯20ml。回馏30分钟。反应的颜色将由暗黄色，经紫、深蓝变为绿棕色。将回馏装置改为蒸馏装置，蒸出氯仿回收。小心蒸馏至溶液粘稠，自然冷却，得胺羟酰氯粗品。
将粗产品用氯仿洗涤3次(每次10ml)，至晶体呈现淡紫色，加入100ml苯，加热溶解，调整苯用量至晶体刚好溶解，加入活性炭1g，微沸5min，用4G砂芯漏斗趁热抽滤(可提前在烘箱中预热砂芯漏斗)，得浅黄色溶液，稍冷后即有沉淀析出。加热溶解沉淀，调整苯用量至沉淀刚好溶解，自然冷却至室温则有晶体析出。抽出母液，进行重结晶，可得无色细针状晶体4.9g。合成产率41.5％，将产品于干燥器中密封保存。
应用实例之一尿液中痕量多胺的检测多胺一般指腐胺、精眯和精胺，它不仅是重要的代谢调控物，而且与肿瘤关系极为密切。
取尿液50μL，加入250μL胺羟酰氯乙腈溶液(5×10-3mol/L),50μL碳酸氢钠(0.25mol/L)溶液，于室温下振摇1分钟进行衍生反应，取8μL溶液进行高效液相色谱分析。以乙腈/水(54/46,v/v)为流动相，流量设定0.8ml/min，选定荧光激发波长300nm，发射波长420nm，使用ODS柱(12.5×0.46)，上述衍生产物可在岛津LC-10A高效液相色谱仪上得到良好分离。在0.4-80ng范围内有良好的定量线性关系，检测限为1.2ng/g。
应用实例之二土壤中痕量阿特拉津的检测阿特拉津属于三嗪类化合物，适用于玉米田间除草，1958年申请瑞士专利，1959年投入商业生产，从九十年代起，该除草剂在中国得到广泛应用。今年来发现阿特拉津可使仓鼠卵巢细胞染色体破裂，已被列为可能的人类致癌物。因此，土壤中阿特拉津的残留分析受到人们关注。
取土壤样品100.00克(40目)，加入甲醇100mL，超声波震荡10分钟，抽滤，浓缩萃取液至1mL，加入胺羟酰氯乙腈液(5×10-3mol/L)1mL，振摇20分钟，取10μL进样分析。以甲醇/水(80/20,v/v)为流动相，流量设定0.8ml/min，选定荧光激发波长312nm，发射波长420nm，使用ODS柱(12.5×0.46)，上述衍生产物可在岛津LC-10A高效液相色谱仪上得到良好分离。在0.12-100ng范围内有良好的定量线性关系，检测限为1.0ng/g。
应用实例之三水体中苯酚及卤代酚的检测苯酚及卤代酚广泛地应用于酚醛树脂、农药、塑料、染料、杀菌剂等化工产品的生产。进入环境量不断增加。因其具有生物毒性、降解速度慢及水体中出现概率大等特点而被列在优先控制污染物“黑名单”中。
将水样用G4#沙芯漏斗及0.45μm滤膜过滤。取50μL过滤后水样，加入250μL胺羟酰氯乙腈溶液(5×10-3mol/L)，振摇1分钟，随后加入50μL碳酸氢钠溶液(0.25mol/L)，振摇2分钟，取10μL进样分析。以乙腈/水(71/29,v/v)为流动相，流量设定1.0ml/min，选定荧光激发波长310nm，发射波长410nm，使用ODS柱(12.5×0.46)，苯酚、邻氯酚、间氯酚、2,4-二氯酚、2,4,5-三氯酚及五氯酚六种衍生产物可在岛津LC-10A高效液相色谱仪上得到良好分离。在2.0-120pg范围内有良好的定量线性关系，检测限为15pg/g。
应用实例四茶叶中苯甲醇及水杨醇的检测苯甲醇及水杨醇是不仅可用作香料中的调香剂，而且还是很好的定香剂。茶叶中苯甲醇及水杨醇含量的多少可作为其质量判别的标准之一。
将茶叶研细，过40目筛，取1.000克，加5.0mL乙腈，超声波震荡15分钟，离心分离。取离心清液1.0mL，加入1.0mL胺羟酰氯乙腈溶液(5×10-3mol/L)，振摇5分钟，取10μL进样分析。以乙腈/水(49/51,v/v)为流动相，流量设定1.0ml/min，选定紫外吸收波长300nm，使用ODS柱(12.5×0.46)，苯甲醇及水杨醇的衍生产物可在岛津LC-10A高效液相色谱仪上得到良好分离。在0.5-110ng范围内有良好的定量线性关系，检测限为2.0ng/g。
除上述样品中的被检测物外，胺羟酰氯还可用于亚硝胺、脂肪胺、芳香胺、脂肪醇、芳香醇及多种氨基酸的衍生检测。
综上所述，本发明所制备的胺羟酰氯试剂，已具有优良的反应活性和检测灵敏度，适用于胺基、羟基及氨基酸类化合物的液相色谱柱前衍生紫外及荧光检测，而且制备工艺简便，产品易于保存。
权利要求
1 一种高灵敏度紫外、荧光检测液相色谱衍生化试剂—胺羟酰氯及其制备工艺。其特征在于，胺羟酰氯的化学名称为2-硝基-4-(2-邻苯二甲酰基)苯甲酰氯，无色细针状晶体，分子量316，分子式C15H9N2O4Cl。结构式
胺羟酰氯的制备工艺包括第一步，邻苯二甲醛和2-硝基-4-氨基苯甲酸缩合成2-硝基-4-(2-邻苯二甲酰基)苯甲酸；第二步，以亚硫酰氯进行酰氯化得粗产品；第三步，经分离提纯得到无色细针状胺羟酰氯产品。
2 按照权利要求1所述的制备工艺，在第一步邻苯二甲醛和2-硝基-4-氨基苯甲酸缩合成2-硝基-4-(2-邻苯二甲酰基)苯甲酸的反应中，反应条件为乙醚作反应介质，反应温度20℃，反应时间1小时，避光、搅拌，并以金属钠作为吸水剂和抗氧剂。
3 按照权利要求1所述的制备工艺，在第二步以亚硫酰氯进行酰氯化的反应中，以氯仿作介质，亚硫酰氯逐滴加入并回馏30分钟。
4 按照权利要求1所述的制备工艺，在第三步分离提纯工艺中，先用氯仿洗涤，再用活性炭脱色，最后用苯重结晶。
5 按照权利1～4所述制备的胺羟酰氯试剂用于痕量胺基、羟基及氨基酸类化合物的液相色谱柱前衍生紫外及荧光检测。
全文摘要
本发明涉及一种高灵敏度紫外及荧光检测液相色谱衍生化试剂－胺羟酰氯及其制备工艺。胺羟酰氯化学名称为2－硝基－4－(2－邻苯二甲酰基)苯甲酰氯。本发明主要解决的技术问题是如何用简便、经济的工艺条件来制备反应活性好、检测灵敏度高、易于保存的酰氯类色谱衍生试剂。本发明的主要工艺技术特征在于:在乙醚介质中,邻苯二甲醛和2－硝基－4－氨基苯甲酸缩合成2－硝基－4－(2－邻苯二甲酰基)苯甲酸。然后,在氯仿介质中以亚硫酰氯进行酰氯化得粗品。经分离提纯最终得到无色细针状产品,合成产率41.5%。该衍生试剂在室温干燥条件下可保存3年以上,广泛适用于痕量胺基、羟基及氨基酸类化合物的液相色谱衍生化紫外和荧光检测。
文档编号G01N30/00GK1210262SQ9811777
公开日1999年3月10日 申请日期1998年9月18日 优先权日1998年9月18日
发明者叶常明, 弓爱君 申请人:中国科学院生态环境研究中心