稻的获得的鉴定
[0166] 将T。代转P-MYBLIKE02水稻移栽至人工气候室中，30°C/28 °C，光照16h/黑 暗8h，提取叶片的基因组DNA，用潮霉素（pPLV15载体上有潮霉素）特异引物（hygB FP-2:CATGTGTATCACTGGCAAACTG;hygBRP-2:GTACTTCTACACAGCCATCGGTC)鉴定外源基因是 否存在并整合到基因组上。扩增得到大小为501bp的PCR产物，为阳性T。代转P-MYBLIKE02 水稻。
[0167] 将得到的Τ。代转P-MYBLIKE02水稻和Τ。代转pPLV15水稻收种并播种下一代，得 到代转P-MYBLIKE02水稻和Ti代转pPLV15水稻，而后用上述同样的方法鉴定Ti代转 P-MYBLIKE02水稻并确认阳性植株。
[0168] 二、转P-MYBLIKE02水稻⑶S染色验证启动子功能
[0169] 将灌浆期（开花后第4、7、11、14、21、28天）的阳性的1\代转？-1?^1^11^02水稻 的种子去掉内外稃片后，分别对种子进行横切或纵切。将横切或纵切好的种子放入丙酮溶 液中，丙酮溶液放于冰上预冷，而后抽真空10分钟后将材料放入-20°c冰箱固定1小时。倒 掉丙酮，加入用没有加入X-gluc的⑶S染色液500μ1洗脱两遍，后加入带有X-gluc的⑶S 染色液，放入37°C培养箱反应1小时。于体视镜下观察是否出现GUS信号并拍照。并以?\ 代转PPLV15水稻为对照。
[0170]?\代转P-MYBLIKE02水稻的染色结果如图3所示：其中，a:叶舌；b:叶片；c，d，e: 花序轴，节和节间的横切；f:小花；g:花药和子房；h-m:分别为受精后4天，7天，11天，14 天，21天和28天种子的纵切；n-s:分别为受精后4天，7天，11天，14天，21天和28天种子 的横切。从图中可以看出，?\代转P-MYBLIKE02水稻的GUS基因在种子的背侧糊粉层中具 有表达活性（蓝色），而在种子的其他部分不表达。?\代转pPLV15水稻的GUS基因在任何 部分均无表达。
[0171] 为了进一步确认P-MYBLIKE02是否在种子的背侧糊粉层中表达，将经⑶S染色的 种子进行了半薄切片的观察。具体步骤如下：
[0172] 1、取材：取受精后11天的经PCR鉴定为阳性的?\代转P-MYBLIKE02水稻种子，去 掉内外稃片，而后分别对种子进行横切或纵切。
[0173] 2、固定：将横切或纵切好的种子放入丙酮溶液中，丙酮溶液放于冰上预冷，而后抽 真空10分钟后将材料放入_20°C冰箱固定1小时。
[0174] 3、⑶S染色：倒掉丙酮，加入用没有加入X-gluc的⑶S染色液500μ1洗脱两遍， 后加入带有X-gluc的⑶S染色液，放入37°C培养箱反应1小时或过夜。于体视镜下观察是 否出现GUS信号，若有信号进行下一步脱水处理。
[0175] 4、脱水：30 % - 50 % - 60 % - 75 %，每步处理2小时，停在75 %乙醇中进行拍照， 而后再继续脱水75% - 80% - 90%乙醇，每步处理2小时。
[0176] 5、包埋：将材料放于100 %乙醇中处理2小时，重复两次，后加入乙 醇：Technovit7100基本液=1:1处理过夜，4 °C冰箱保存，配置预处理液，每 100mlTeChn〇Vit7100基本液加入1克HarderI(可4摄氏度保存1个月），将材料放入预 处理液中反应过夜，4 °C保存。
[0177] 6、配置固化液：将预处理液（含有HarderI)加入HarderII，每15ml预处理液 加入1毫升HarderII。将材料放入胶囊中，加入固化液（约300μ1)，盖好盖子后竖直静 置直到其凝固，放置2-3天后切片。
[0178] 7、切片：用半薄切片机切片，厚度为5μπι，而后夹取切片放置于滴有水滴的载玻 片上，而后进行45°C烤片2-3小时。
[0179] 8、PAS (Periodic Acid-Schiff stain)染色观察：57°C烘箱中用 0· 5% 的高鹏酸氧 化切片30分钟。高碘酸及玻璃缸57°C烘箱中提前预热10分钟，用水龙头中流动的自来水 冲洗掉多余的高碘酸，冲洗1分钟，再用去离子水冲洗3-5次，室温条件下用Schiff试剂处 理2-3分钟，时间不能太长，否则颜色太深，同样用自来水冲洗后再用去离子水冲洗3-5次， 一定要冲洗干净再用30%的甘油封片而后显微镜下观察并拍照。
[0180] ?\代转P-MYBLIKE02水稻的半薄切片的结果如图4所示：其中，t:种子背侧，放大 20倍；u:种子背侧，放大40倍；NP:nucellarprojection珠心凸；AL:aleuronelayer糊 粉层。从图中可以看出，?\代转P-MYBLIKE02水稻的GUS基因在种子的背侧糊粉层中具有 表达活性（蓝色），而在种子的其他部分不表达。
[0181] 上述实验证明：P_MYBLIKE02启动子可以驱动目的基因如⑶S报告基因在种子的 背侧糊粉层中特异表达。
【主权项】
1. DNA片段，为如下1) -3)中任一所述的DNA分子： 1) 序列表中序列1所示的DNA分子； 2) 在严格条件下与1)所述DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子； 3) 与1)中所述DNA分子具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。2. 与权利要求1所述的DNA分子相关的生物材料，为下述A1)至A19)中的任一种： A1)含有权利要求1所述的DNA分子的表达盒； A2)含有权利要求1所述的DNA分子的重组载体； A3)含有A1)所述表达盒的重组载体； A4)含有权利要求1所述的DNA分子的重组微生物； A5)含有A1)所述表达盒的重组微生物； A6)含有A2)所述重组载体的重组微生物； A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物； A8)含有权利要求1所述的DNA分子的转基因植物细胞系； A9)含有A1)所述表达盒的转基因植物细胞系； A10)含有A2)所述重组载体的转基因植物细胞系； All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系； A12)含有权利要求1所述的DNA分子的转基因植物组织； A13)含有A1)所述表达盒的转基因植物组织； A14)含有A2)所述重组载体的转基因植物组织； A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织； A16)含有权利要求1所述的DNA分子的转基因植物器官； A17)含有A1)所述表达盒的转基因植物器官； A18)含有A2)所述重组载体的转基因植物器官； A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官。3. 扩增权利要求1所述的DNA片段的引物对。4. 根据权利要求3所述的引物对，其特征在于：所述引物对由序列表中序列2所示的 单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。5. 权利要求1所述的DNA片段在启动目的基因在植物中表达中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物为植物的种子。7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述种子为种子的糊粉层。8. 根据权利要求5-7中任一所述的应用，其特征在于：所述糊粉层为背侧糊粉层。9. 权利要求1所述的DNA片段在植物的遗传育种中的应用。10. 根据权利要求5-9中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物；所述 单子叶植物为水稻。
【专利摘要】本发明公开了一种水稻种子背侧糊粉层特异表达的启动子P-MYBLIKE02及其应用。本发明的启动子P-MYBLIKE02为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所述DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)中所述DNA分子具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。利用本发明的水稻背侧糊粉层中特异表达的启动子可以驱动目的基因的表达，该启动子不仅对于研究糊粉层的发育调控和生产应用具有重要的意义，而且将为提高水稻种子蛋白质、脂肪酸、铁、锌、维生素B1等营养成分的含量提供理论指导。
【IPC分类】C12N15/113, C12N15/11, C12N15/82
【公开号】CN105274115
【申请号】CN201510830545
【发明人】刘春明, 刘金鑫, 白爱宁
【申请人】中国科学院植物研究所
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月25日