专利名称：肿瘤抗原特异性t淋巴细胞的体外扩增方法
发明的领域本发明涉及细胞毒性T淋巴细胞及其在抗肿瘤免疫反应中的应用。具体地说，本发明涉及联合使用白介素2、白介素15和激发型抗CD28单克隆抗体以及肿瘤抗原负载的抗原递呈细胞以诱导T细胞变为细胞毒性T淋巴细胞的方法。本发明进一步涉及按照所说的方法制备的细胞毒性T淋巴细胞在抗肿瘤免疫反应中的应用。
发明的背景在机体抗肿瘤免疫应答过程中，细胞免疫处于中心地位。体内肿瘤特异性的细胞免疫功能的低下是肿瘤逃避免疫系统的监视无限制生长的重要原因之一。如何在体外获得足够量可供临床应用的肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是肿瘤过继免疫疗法中首先要面临的问题。
T细胞特别是CD8+和CD4+T细胞在介导抗肿瘤免疫应答中起到不可替代的作用。T细胞的激活和扩增需要一系列免疫细胞和细胞因子的参与。树突状细胞(DC)作为功能最强大的抗原递呈细胞(APC)，将摄取、加工和处理后的抗原递呈给T细胞，赋予T细胞活化的第一信号。同时，DC表面的CD80/CD86(B7-1/B7-2)、CD40等共刺激分子与T细胞表面相应的受体或配体相互作用后，介导T细胞活化的第二信号。此外，CTL的活化还需要CD4+T细胞分泌的IL-2和IFN-γ等细胞因子的参与。
对于肿瘤病人特别是中晚期肿瘤病人而言，由于机体内肿瘤负荷较大而且肿瘤细胞增殖迅速，所以在进行自体免疫治疗时要求能在体外扩增大量的自体抗原特异性CTL，然后回输患者体内以达到抑制或杀灭肿瘤细胞的目的。研究表明，虽然IL-2、IL-7、IL-15和IFN-γ等细胞因子以及激发型抗CD28和CD3单克隆抗体均可用于体外扩增CTL。然而，现有扩增方法的效率仍有待进一步提高，特别是单纯使用这些细胞因子扩增时常常会导致被激活的T细胞的凋亡(AICD)，因而本领域希望建立一种能够避免AICD发生的并且能够以更高的效率体外扩增CTL的方法。
发明的目的本发明的目的是提供一种体外扩增细胞毒性T淋巴细胞的方法，该方法包括(1)由肿瘤病人外周血中分离得到贴壁生长的单核细胞；(2)在适当浓度粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4的存在下，培养步骤(1)得到的单核细胞，以诱导形成未成熟的树突状细胞；(3)于激发型抗CD40单克隆抗体存在下，将步骤(2)得到的未成熟的树突状细胞与肿瘤细胞共育，使所说的未成熟的树突状细胞变为特异性肿瘤抗原负载的成熟的树突状细胞；(4)用步骤(3)得到的抗原递呈细胞与白介素-2、白介素-15和激发型抗CD28单克隆抗体的混合物处理预先分离的T细胞，以促进所说的T细胞的扩增；(5)分离步骤(4)扩增得到的细胞毒性T淋巴细胞。
根据本发明的优选实施方案，其中所说的肿瘤细胞是经处理后凋亡的病人自体肿瘤组织细胞。
根据本发明的优选实施方案，其中所说的肿瘤细胞包括血液系统肿瘤和实体瘤细胞。
根据本发明的优选实施方案，其中所说的细胞毒性T淋巴细胞是肿瘤抗原特异性的。
本发明的另一个目的是提供如上得到的细胞毒性T淋巴细胞在肿瘤的过继性免疫治疗中的应用。
附图简要说明
图1显示不同的生物因子组合诱导的T细胞在不同时间点的表型改变。其中F为RPMI-1640空白对照组；A为IL-2+IL-15+CD28组；B为IL-7+IL-2组；C为IL-15+IL-2组；D为CD28+IL-2组；E为单独的IL-2组。横坐标给出三个不同的检测时间点1为DC激发前；2为DC激发后7天；3为DC激发后14天。纵坐标给出流式细胞仪(FCM)检测的细胞上各表型的百分表达率。
图2显示不同的生物因子组合对T细胞增殖数目的影响。其中F组为RPMI-1640空白对照组；A为IL-2+IL-15+CD28组；B为IL-7+IL-2组；C为IL-15+IL-2组；D为CD28+IL-2组；E为单独使用IL-2组。横坐标为诱导后的天数；纵坐标为细胞数(单位106/ml)。
图3显示不同的生物因子组合对自体T细胞增殖的影响。其中F组为RPMI-1640空白对照组；A为IL-2+IL-15+CD28组；B为IL-7+IL-2组；C为IL-15+IL-2组；D为CD28+IL-2组；E为单独使用IL-2组。纵坐标为刺激指数(SI)。
图4显示不同的生物因子组合对扩增的CTL的细胞毒活性的影响。其中F组为RPMI-1640空白对照组；A为IL-2+IL-15+CD28组；B为IL-7+IL-2组；C为IL-15+IL-2组；D为CD28+IL-2组；E为单独使用IL-2组。Raji为B淋巴瘤细胞株；XG-2为多发性骨髓瘤细胞株；K562为杀伤细胞(NK)敏感株。
图5显示不同生物因子组合激发的T细胞上清中IFN-γ的浓度变化。其中F组为RPMI-1640空白对照组；A为IL-2+IL-15+CD28组；B为IL-7+IL-2组；C为IL-15+IL-2组；D为CD28+IL-2组；E为单独的IL-2组。
发明的具体内容本发明涉及细胞毒性T淋巴细胞及其在抗肿瘤免疫应答中的应用。具体地说，本发明涉及联合使用白介素2、白介素15和激发型抗CD28单克隆抗体以及肿瘤抗原负载的抗原递呈细胞，诱导T细胞扩增为细胞毒性T淋巴细胞的方法。本发明进一步涉及按该方法制备的细胞毒性T淋巴细胞在过继性抗肿瘤免疫中的应用。
在人和哺乳动物的免疫系统中，T细胞介导迟发型超敏反应，移植物排斥和细胞毒活性等一系列细胞免疫反应。某些T细胞与专门的细胞表面蛋白质即MHC分子相互作用以在细胞表面上递呈抗原。专门化的抗原递呈细胞如巨嗜细胞和树突状细胞诱导细胞毒性和辅助T细胞增殖并识别靶细胞表面上表达的相应抗原。进而，T细胞(CTL)杀伤这些靶细胞，或者诱导其他细胞杀伤这些靶细胞。
使用CTL进行肿瘤治疗中的关键技术之一是设法在体外获得大量的肿瘤抗原特异性CTL。传统的体外扩增CTL方法是采用大剂量的IL-2，这样虽然可以在短期内得到大量活化的T细胞，但很容易导致活化诱导的细胞死亡(AICD)，最终难以长时间稳定地获得足够量肿瘤特异性过继免疫治疗所需的细胞毒性T淋巴细胞。
IL-2介导的效应可以分为两个阶段，早期低剂量的IL-2能够介导T细胞的增殖；但是在后期，随着活化T细胞数量的增多和IL-2浓度的逐渐升高，T细胞便很快地进入由Fas/FasL介导的活化诱导的细胞死亡(AICD)过程。因此，单纯使用IL-2并不能使T细胞在体外较长时间的扩增。
作为一种非活化T细胞来源的细胞因子，IL-15主要由粘附性外周血单核细胞产生，并且结构上是由独特的α链以及与IL-2受体共享的β和γ(即γc)链组成的。IL-15可刺激活化的T细胞增殖，诱导CTL和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)产生，促进B细胞分泌IgM、IgG、IgA。已有证据表明，IL-15在促进非抗原依赖性CD8+T细胞的分化和长期存活中起重要作用。IL-15与其受体的相互作用可导致CD8+T细胞的分化。T细胞活化过程中，IL-15和TCR两个途径在某些方面存在有共同点。因此，IL-15与IL-2具有相似的生物学效应，即两者都能促进T细胞的分化增殖。然而，与IL-2不同的是，IL-15与其受体结合后，能够稳定γc链，且上调抗凋亡基因bcl-2，从而表现有抗AICD和延长细胞的存活时间的作用。
CD28可以提供T细胞活化所需的共刺激信号，促进T细胞活化增殖。CD28分子又称Tp44，是一种包括202个氨基酸的I型跨膜糖蛋白。作为免疫球蛋白超家族(IGSF)的成员，CD28分子与CTLA-4同为协同刺激分子CD80和CD86的天然受体。在接到抗原特异性信号后，T细胞上的CD28抗原与B细胞上的B7抗原间的相互作用，以进一步提供激活T细胞、导致高水平细胞因子分泌的第二信号。另外，膜型CD28分子在降低T细胞活化阈值、诱导抗凋亡基因表达、增加细胞因子分泌、促进免疫突触形成及阻止T细胞失能等方面也具有重要作用。因此，无论在体内还是体外，T细胞的生长和增殖不仅需要有IL-2、IL-15等T细胞生长因子的参与，而且CD28等共刺激因子的参与也是不可少的。本发明方法中用于诱导T细胞活化增殖的混合物中除包括白介素-2、白介素-15外，还加有激发型抗CD28单克隆抗体(CD28mAb)，目的即在于激发并提供CD28分子的上述固有活性。
已知树突状细胞是能够通过在细胞表面I和II类MHC分子上递呈抗原而激活T细胞、NK细胞及其他免疫细胞的最强有力的抗原递呈细胞(Banchereau andSchmit，Advances in Experimental Medicine and Biology(Back et al.，eds)volume378，Plenum Press，NY)。除了向T细胞和NK细胞递呈抗原外，树突状细胞还可通过产生T细胞有丝分裂原来刺激T细胞的有丝分裂。传统的体外扩增DC的方法是在体外培养的外周血单核细胞培养物中加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF-α)刺激的CD34+造血前体细胞，以诱导DC细胞生成；或者在体外培养的外周血单核细胞培养物中加入GM-CSF、白细胞介素4(IL-4)和TNF-α等细胞因子，以获得GM-CSF依赖性DC细胞。
为了进一步提高CTL细胞的扩增效率，满足临床肿瘤免疫治疗的需要，并为本发明方法的建立提供充分的基础研究数据，我们深入探讨并比较了各种细胞因子及其不同组合对T细胞活化与增殖的影响。
我们的研究显示，激发型CD28mAb、IL-2、IL-7和IL-15在单独或联合使用时对T细胞的扩增效应不同，而且这些T细胞生长因子表现有的明显的互补性。例如，我们发现，单独使用激发型CD28mAb的前7天T细胞数量的增加明显，由最初的0.2×106迅速增加到4.1×106，但此后7天里T细胞数量的增加明显放慢(4.1×106增加到6.0×106)。该现象提示CD28介导的共刺激信号主要在T细胞的激发和增殖的早期发挥作用。表明CD28mAb激发的T细胞所产生的内源性IL-2并不足以维持其生长和增殖，而必须借助于外源性的IL-2。另外，我们的实验显示，单独使用IL-2，或联合使用IL-2+IL-7或IL-2+IL-15虽可诱导T细胞扩增，但效率不高，而且所诱导产生的CTL对靶细胞的杀伤率也偏低。
相反，联合应用激发型CD28mAb、IL-2和IL-15，不仅T细胞扩增效应最为明显(T细胞数量由0.2×106持续扩增至2.4×107)，而且扩增的T细胞所表达的Fas抗原降低，所诱导的CTL对靶细胞的杀伤率高达35％左右。激发型CD28mAb、IL-2和IL-15联合应用效果最佳的可能原因是，该组合不仅增强了T细胞活化所需的第一和第二信号，同时通过IL-15的抗AICD作用，延长了T细胞的生存期，从而在质量和数量上保证了CTL对靶细胞的杀伤效率。
另一方面，考虑到Th0细胞可在不同条件下分化为主要分泌IFN-γ并介导细胞免疫的Th1细胞，或分泌IL-10并介导体液免疫的Th2细胞。。因此我们还测定了不同扩增方式产生的T细胞培养上清中IFN-γ和IL-10的含量。结果显示，各种不同细胞因子和CD28单抗组合诱导的T细胞上清中含有IFN-γ，而几乎未检测到IL-10。表明Th0细胞主要分化为分泌IFN-γ并介导细胞免疫的Th1细胞。在联合使用CD28mAb、IL-2和IL-15的情况下，扩增得到的T细胞培养物上清中的IFN-γ水平高达6.4ng/ml。
再者，为了使树突状细胞(DC)负载肿瘤特异性抗原，我们采用肿瘤细胞株细胞作为物质基础，由DC从全部细胞抗原中选取肿瘤细胞抗原并对其加工、递呈，可能是一种能够免去繁琐的肿瘤相关抗原筛选步骤的简便而有效的方法。
基于上述基础研究，本发明人成功地建立了一种新的体外扩增细胞毒性T淋巴细胞的方法。本发明的方法中，我们首先基本上按照传统方法由肿瘤病人外周血中分离得到贴壁生长的单核细胞，然后在适当浓度粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4的存在下培养所得到的单核细胞，以诱导形成未成熟的树突状细胞。最后，使用包括白介素-2、白介素-15和激发型抗CD28单克隆抗体以及按上述方法得到的抗原递呈细胞在内的混合物处理分离的T细胞，以扩增得到所需的肿瘤抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞。
因此，本发明的体外扩增细胞毒性T淋巴细胞的方法基本上包括以下步骤(1)由肿瘤病人外周血中分离得到贴壁生长的单核细胞；(2)在适当浓度粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4的存在下，培养步骤(1)得到的单核细胞，以诱导形成未成熟的树突状细胞；(3)于激发型抗CD40单克隆抗体存在下，将步骤(2)得到的未成熟的树突状细胞与同一病人的肿瘤细胞共育，使所说的未成熟的树突状细胞变为特异性肿瘤抗原负载的成熟的树突状细胞；(4)用步骤(3)得到的抗原递呈细胞与白介素-2、白介素-15和激发型抗CD28单克隆抗体的混合物处理预先分离的T细胞，以促进所说的T细胞的扩增；(5)分离步骤(4)扩增得到的细胞毒性T淋巴细胞。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的肿瘤细胞是经处理后凋亡的患者自体肿瘤组织细胞。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中所说的细胞毒性T淋巴细胞是肿瘤抗原特异性的。
根据本发明的再一个优选实施方案，其中所说的肿瘤细胞包括血液系统肿瘤和实体瘤细胞。
本发明进一步提供了按上述方法得到的CTL在肿瘤免疫治疗中的应用。我们的体外细胞学实验显示，分离的T细胞在凋亡的肿瘤细胞负载的抗原递呈细胞、IL-2、IL-15和抗D28单克隆的联合作用下，能够以较高的速率分化并增殖为肿瘤抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。而且，这些经体外诱导扩增的CTL表现有很强的肿瘤细胞杀伤活性。另外，我们对个别中晚期肿瘤病人自愿者的试验治疗结果表明，按照本发明方法扩增得到的CTL可有效的延缓病情的进展，缓解病人的症状。
实施例1肿瘤抗原负载的抗原递呈细胞的制备本实施例描述借助凋亡的肿瘤细胞在树突状细胞(DC)表面负载肿瘤抗原的方法。
1、肿瘤细胞凋亡的诱导在B淋巴瘤细胞株Daudi的培养基(RPMI-1640+10％FCS)中加CD40抗体(CD40mAb)(5μg/ml)，37℃诱导24小时(h)。洗涤细胞后，用放射性核素钴(60Co)(50Gy，剂量率10Gy/min)辐照。然后37℃(5％CO2)继续培养48小时备用。
2、DC的体外诱导和扩增采用健康人肝素抗凝新鲜外周血(购自苏州市中心血站)，Ficoll密度梯度分离获得外周血单个核细胞，用RPMI-1640+10％FCS培养基调整至3～5×106/ml，加入24孔培养板中37℃贴壁培养2h。收集贴壁生长的细胞培养并在添加有rhGM-CSF(1000IU/ml)、rhIL-4(500IU/ml)、L-谷氨酰胺(0.02mmol/L)、2-巯基乙醇(5×10-5mol/L)、青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)和10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中37℃、5％CO2培养。每2-3天半量换液一次。
3、凋亡的Daudi细胞负载树突状细胞DC培养的第7天后，按凋亡Daudi∶DC＝3∶1的比例共同培养16h。洗涤后加入CD40mAb(5μg/ml)，继续培养2天至使树突状细胞成熟。
实施例2抗原特异性CTL的体外扩增及应用本实施例描述使用抗原负载的树突状细胞与多种生物因子的混合物扩增CTL的方法。其中使用流式细胞分析术(FCM)检测细胞表型，使用ELISA试剂盒检测细胞因子的存在及其水平，以3H-TdR掺入实验测定细胞的增殖，并以51Cr释放试验法测定细胞毒活性。
(1)T细胞的纯化由外周血离心分离(Ficoll)得到的PBMC。PBMC细胞经尼龙毛柱层析纯化后，使用流式细胞分析术检测细胞纯度＞85％。
(2)负载了凋亡的Daudi细胞的DC对T细胞的激发活化作用于不同组合的细胞因子的存在下，将成熟的凋亡Daudi负载的DC与纯化的自体T细胞按E/T＝1/10的比例共同培养。共分为六组A.CD28mAb(5μg/ml)+IL-15(5ng/ml)+IL-2；B.IL-7(5ng/ml)+IL-2；C.IL-15(5ng/ml)+IL-2；D.CD28mAb(5μg/ml)+IL-2；E.IL-2；F.空白对照。以未加细胞因子的成熟的DC+自体T细胞作为阴性对照。第一周实验所加IL-2的浓度为30IU/ml，一周后将单独使用的IL-2的浓度提高至100IU/ml。
(3)T细胞表型的FCM分析T细胞在经负载肿瘤抗原的DC活化之前、活化后1周和活化后两周分别用PE标记的CD3、CD4、CD8、CD25、CD28及CD95单抗处理。结果可见，不同组细胞因子和激发型单抗联合诱导T细胞活化过程中，均出现CD3+、CD4+和CD8+T细胞的百分率提高，并且CD25+和CD28+T细胞明显增多。CD28mAb+IL-15+IL-2组T细胞的CD95(Fas)表达水平低于其他各组，IL-15+IL-2组次之(见图1)。这些结果表明，CD28mAb和IL-15介导的信号具有抗T细胞AICD的作用。
(4)T细胞培养上清中IFN-γ、IL-10水平的检测分别收集凋亡Daudi细胞负载的DC与不同生物因子的混合物激发第7天的T细胞培养上清，按照试剂盒说明书所述方法检测IFN-γ、IL-10浓度。ELISA检测结果显示，各实验组上清中均有IFN-γ存在，其中以CD28mAb+IL-15+IL-2组的IFN-γ浓度为最高(见图5)。各组的细胞培养物中均未检测到IL-10。
(5)凋亡的Daudi细胞负载的DC对自体T细胞增殖能力的影响(3H-TdR掺入法)将经凋亡Daudi细胞负载的成熟DC与T细胞(1∶10)置于96孔板的小孔中(2×104/孔)，37℃(5％CO2)培养。培养56小时后，每孔掺入3H-TdR3.7×104Bq，继续培养至72h终止。采用液闪仪测定cpm值，并按下列公式计算刺激指数(SI)SI＝(实验组cpm-本底cpm)/(对照组cpm-本底cpm)。实验结果表明，各不同组合的细胞因子与激发型单克隆抗体的混合物均能刺激CTL增殖，但其中以CD28mAb+IL-15+IL-2组对T细胞体外增殖作用最为显著(参见图3)。
(6)凋亡的Daudi细胞负载的DC激活肿瘤抗原特异性CTL细胞毒作用(51Cr释放试验)按每2×105Daudi细胞掺入3.7×106Bq51Cr，37℃孵育2h。洗涤3次后，将经抗原负载的DC活化后的T细胞与Daudi细胞混合(E/T＝50/1)并培养4h，然后用γ计数器测定cpm值。按下列公式计算杀伤率杀伤率(％)＝100×[(实验组cpm-自然释放组cpm)/(最大释放组cpm-自然释放组cpm)]。用未经抗原负载DC诱导的CTL/Daudi、Ag-DC诱导的CTL/Raji、Ag-DC诱导的CTL/XG-2、Ag-DC诱导的CTL/K562作为对照组。试验结果表明，联合使用凋亡的肿瘤细胞负载的DC、CD28、IL-15和IL-2激发扩增的CTL对Daudi杀伤率最高(39.7±8.2％)；联合使用IL-2/IL-7+IL-2/IL-15+IL-2的其他各组对Daudi细胞亦表现有不同程度的杀伤活性，但对Raji和XG-2细胞则无明显的细胞毒作用(参见图4)。
实施例3按本发明方法得到的CTL在肿瘤治疗中应用本实施例举例说明按照本发明方法扩增得到的细胞毒性T淋巴细胞在治疗临床恶性肿瘤病人中应用。
卵巢癌病人，女，75岁。卵巢肿瘤手术切除前，采集病人的抗凝血1ml，流式细胞计数法检测T细胞表型为CD355％、CD429.7％、CD835.7％CD254.4％、CD2822％。术中保留部分肿瘤组织，用400目筛网制成单细胞悬液，-80℃冷冻保存备用。术后常规化疗，第一疗程(3周)结束后，检测血常规正常。给病人连续肌肉注射GM-CSF(75μg/天)两天，以提高患者外周血中DC前体细胞的数量。第3天取外周抗凝血50ml，分离获得PBMC并常规诱导DC。在DC生长的第6天，复苏部分肿瘤细胞，顺铂(DDP)诱导凋亡并进行DC负载。待DC成熟后，再次抽取患者外周血50ml，获得T细胞并与抗原负载DC共育。按本发明方法得到的CTL的数量达到108时，部分细胞继续扩增，其余细胞用生理盐水洗涤3次，与100ml注射用葡盐水混合，静脉回输至患者体内。此期间加用地塞米松5mg，预防输血反应。继续培养的CTL扩增后再次回输，共回输3次。回输过程中及回输后均未见任何副反应。治疗1月后复查T细胞表型CD368.8％、CD445.5％、CD826.6％、CD2514.9％、CD2851.4％；一年后再次复查CD346.6％、CD430％、CD824.8％、CD2520％、CD2833.1％。
权利要求
1.一种体外扩增细胞毒性T淋巴细胞的方法，该方法包括(1)由肿瘤病人外周血中分离得到贴壁生长的单个核细胞；(2)在适当浓度粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4的存在下，培养步骤(1)得到的单核细胞，以诱导形成未成熟的抗原递呈细胞；(3)于抗CD40单克隆抗体存在下，将步骤(2)得到的未成熟的抗原递呈细胞与肿瘤细胞共育，使所说的未成熟抗原递呈细胞变为特异性肿瘤抗原负载的成熟的抗原递呈细胞；(4)用步骤(3)得到的抗原递呈细胞与白介素-2、白介素-15和激发型抗CD28单克隆抗体的混合物处理预先分离的T细胞，以促进所说的T细胞的扩增；(5)分离步骤(4)扩增得到的细胞毒性T淋巴细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中所说的肿瘤细胞是经处理后凋亡的病人自体肿瘤组织细胞。
3.根据权利要求1的方法，其中所说的肿瘤细胞包括血液系统肿瘤和实体瘤细胞。
4.根据权利要求1的方法，其中所说的细胞毒性T淋巴细胞是肿瘤抗原特异性的。
5.按照权利要求1的方法得到的细胞毒性T淋巴细胞在肿瘤的过继性免疫治疗中的应用。
全文摘要
本发明涉及细胞毒性T淋巴细胞及其在抗肿瘤免疫反应中的应用。具体地说，本发明涉及联合使用白介素2、白介素15和激发型抗CD28单克隆抗体以及肿瘤抗原负载的抗原递呈细胞，诱导T细胞变为细胞毒性T淋巴细胞的方法。本发明进一步涉及按照所说的方法制备的细胞毒性T淋巴细胞在抗肿瘤免疫反应中的应用。
文档编号A61P35/00GK1844372SQ200510038728
公开日2006年10月11日 申请日期2005年4月7日 优先权日2005年4月7日
发明者张学光, 朱一蓓, 席泓 申请人:苏州大学