Flotillin-2作为筛选抑制鼻咽癌转移的药物的靶标及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因和蛋白的功能与应用领域，涉及Flotillin-2的新用途，特别是 涉及Flotillin-2作为筛选抑制鼻咽癌转移的药物的靶标及其应用。
【背景技术】
[0002] 在上皮发生的肿瘤组织中，肿瘤细胞通常尚具有上皮组织的细胞极性，并且细 胞之间被紧密的细胞间连接所束缚。当上皮间叶细胞转换（epithelial-mesenchamal transition，EMT)时，细胞逐渐失去典型上皮细胞的诸多特征，并获得间叶细胞的部分特 性，引起后续一系列肿瘤细胞侵袭和转移事件。这一过程被一系列的细胞外及细胞内信号 分子控制。转化生长因子0 (transforming growth factor-13 )是一种细胞外生长因子， 已被证明能促进多种肿瘤细胞的转移，例如通过激活一些非受体类酪氨酸激酶，如Src，启 动EMT，促进肿瘤转移。然而，TGF-0所引起的EMT以及Src在此过程所起的作用在鼻咽癌 这一高发于中国东南部的癌症中研宄较少。此过程的详细机制在鼻咽癌中尚不明确。
[0003] 平面脂阀是富含胆固醇和鞘磷脂的细胞膜表面微结构域，与多种细胞外或细胞内 信号传导相关。Flotillin-2 (简称Flot2)是细胞膜上平面脂阀的重要组成蛋白，主要分布 于细胞膜的胞质面或是某些内吞囊泡的表面。最近，有研宄证实Flot2与中性粒细胞的细 胞骨架形成及细胞的迀移能力有关。过表达Flot2将低致癌性与低转移性的黑色素瘤细胞 系SB2转变成了高致癌性与高转移性的癌细胞。此外，沉默Flot2在乳腺癌细胞中可导致 平面脂阀的完全缺失，降低乳腺癌肺转移率。近来有研宄提示，Flot2在神经细胞中参与到 Src激酶的激活过程中，而Src激酶已被证明是TGF-0促进癌症转移的重要下游信号。然 而，关于Flot2促进鼻咽癌转移的具体机制尚不十分明确。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种筛选抑制鼻咽癌转移的药物的靶标。
[0005] 在本发明中，发明人对181例鼻咽癌患者的石赌组织标本进行Flotillin-2表 达量进行评估，并在功能学实验中对Flotillin-2的促转移作用进行验证。最后，针对 Flotillin-2在调控TGF-0相关EMT信号通路的分子机制进行研宄。综合有关实验结果表 明，Flotillin-2的表达水平与鼻咽癌转移相关，参与TGF-0入胞信号转导是其机制之一。 因而确定所述的筛选抑制鼻咽癌转移的药物的靶标是Flotillin-2。
[0006] 本发明的另一目的是提供Flotillin-2的新应用。
[0007] 本发明所述的新应用是以Flotillin-2作为药物靶标在筛选抑制鼻咽癌转移的 药物中的应用。
[0008] 本发明还提供了以Flotillin-2为靶标的抑制鼻咽癌转移的药物。
[0009] 根据本发明所述的药物的进一步特征，所述药物是Flotillin-2的siRNA。
[0010] 本发明的创新性在于：首次揭示了在鼻咽癌中Flotillin-2 (Flot2)与TGF-0信 号通路的关系以及二者在鼻咽癌转移中所起的作用。在本研宄中，总共纳入了 181例鼻 咽癌患者，结果显示，Flot2在鼻咽癌组织中的表达量与鼻咽癌患者的转移分期呈正相关。 Flot2的表达量是鼻咽癌患者预后的独立预测指标，Flot2高表达预示患者通常有较短的 总生存时间。在鼻咽癌细胞实验中，沉默Flot2可逆转TGF-0的促转移效应及TGF-0所引 起的Src激活。随着Flot2的沉默，可发现，被TGF-0所抑制的上皮细胞标志物E-cadherin 表达量上升；而在TGF-0刺激下表达量升高的间叶细胞标志物vimentin及信号转导因子 |3-catenin表达量则有明显降低。总的来说，Flot2在鼻咽癌中是患者不良预后的独立预 测因子；是TGF-0信号通路的重要组成部分，是其促进EMT的过程中不可或缺的重要节点。 因此，可以认为，沉默Flot2有可能成为对抗TGF-0所引起EMT的重要手段之一。因此，本 发明为研宄抑制鼻咽癌转移的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础。
【附图说明】
[0011] 图1A是鼻咽癌组织及癌旁组织免疫组化染色代表图（放大倍数：200倍）。
[0012] 图1B是将患者按?M分期分组后不同组别中阴性、弱阳性、强阳性Flot2表达水 平频数示意图。
[0013] 图1C是在不同?M组别中Flot2的均数示意图。
[0014] 图2A至图2C是对鼻咽癌患者的预后分析的Kaplan-Meier曲线图，分别依照（A) N分期，（B)M分期，（C) TW总分期进行分组。
[0015] 图2D至图2F是Flot2的不同表达水平对鼻咽癌患者预后的影响的Kaplan-Meier 曲线图，分析的患者范围分别为（D)全体入组患者，（E)I-III期患者，（F) IV期患者。
[0016] 图3A显示TGF-0在CNE-1细胞系中诱发细胞分散生长并发生形态变化（标尺长 度：50 y m)〇
[0017]图3B是使用TGF-0、SB431542、PP2处理鼻咽癌细胞进行划痕实验的结果图。左 侧为代表图，右侧为定量图。
[0018]图3C是使用TGF-0、SB431542、PP2处理鼻咽癌细胞进行Transwell实验的结果 图。
[0019] 图 3D 是 E-cadherin、vimentin、0-catenin、总 Src 及 p-Src (Tyr416)的 Western blot代表图以及半定量图（#P〈0. 01，+P〈0. 001)。
[0020] 图4A是划痕实验的结果图，显示TGF- 0诱发EMT未对Flot2表达造成影响。
[0021] 图4B是在不同浓度的TGF-0刺激下的Transwell实验的结果图。
[0022] 图 4C 是 Western blot 代表图以及半定量图（*P〈0. 05，#P〈0. 01，+P〈0. 001)，显示 E_cadherin、vimentin、0-catenin、p_Src(Tyr416)的表达量与 TGF-0 呈现浓度依赖关 系，但总Src及Flot2表达量未见明显变化。
[0023] 图5A是PCR验证3条Flot2沉默序列的沉默效率的结果图。
[0024] 图5B至图?显示CNE-1细胞的迀移能力未收Flot2沉默的影响。其中，图5B显 示细胞形态，标尺=50 ym ;图5C是划痕实验；图ro是Transwell实验。
[0025]图 5E 是 Western blot 代表图以及半定量图（#P〈0. 01，+P〈0. 001)，显示 Flot2 沉 默未影响EMT标志物E_cadherin，vimentin及0 -catenin表达。TGF-0受体和总Src表 达量也未见变化。
[0026] 图6A显示TGF-0所引起的CNE-1细胞形态改变被Flot2沉默逆转（标尺= 50 y m)〇
[0027] 图6B是划痕实验结果图，图6C是Transwell实验结果图，这两图显示了 Flot2沉 默对TGF- 0刺激细胞迀移能力的影响。
[0028] 图6D显示TGF- 0引起的EMT标志物以及Src磷酸化水平的变化被Flot2沉默所 逆转。
[0029] 图6E是CNE-1细胞免疫荧光染色图，显示了 E-cadherin、vimentin表达量随 TGF-0 及 Flot2 沉默而变化的趋势（#P〈0. 01，+P〈0. 001)。
[0030] 图7是对本实验的总结图。Flot2对TGF-0信号通路中Src磷酸化是不可缺少的 节点。沉默Flot2通过降低Src活性逆转TGF- 0在鼻咽癌细胞中诱发的EMT。通过此种机 制，E-cadherin表达量升高，vimentin及0 -catenin表达量下降。
【具体实施方式】
[0031] 材料和方法
[0032] 患者及肿瘤组织标本
[0033] 本发明所涉及的所有实验是在南方医科大学南方医院伦理委员会的许可下进行 的，所有的肿瘤组织标本取材都经过了患者同意。石蜡包埋标本是通过手术切除或电子鼻 咽镜从181例鼻咽癌患者中获得的，取材时间从2004年至2008年。所有纳入的患者均依 照nCC/AJCC 1997标准进行了分级。所有患者在取材前均未接受过任何抗肿瘤治疗。
[0034] 免疫组化染色
[0035] 免疫组化的具体步骤可参照了发明人此前所发表的文章（Lin L，Huang H，Liao W, Ma H，Liu J, Wang L，Huang N and Liao Y. MACClsupports human gastric cancer growth under metabolic stress by enhancing the Warburg effect. Oncogene. 2014) ? 在此不做过多赘述。
[0036] 兔多克隆抗Flot2抗体购自Abeam公司（San Francisco，CA，美国），HRP标记二 抗及DAB染色试剂盒购自CWBI0公司。
[0037] 染色深度共分为0分（无色）、1分（淡黄色）、2分（黄色）、3分（棕黄色），每种 染色所占面