生产软骨素的细菌及生产软骨素的方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2008年4月24日的中国专利申请200880013071. 8"生产软骨 素的细菌及生产软骨素的方法"的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及生产软骨素的细菌及生产软骨素的方法。
【背景技术】
[0003] 软骨素是一种包括葡糖醛酸（GlcUA)残基和N-乙基-D-半乳糖胺（GalNAc)残基 的二糖重复结构的多糖（-GlcUAf3 (1-3)-GalNAcf^ (1-4)-，在本说明书中，也称为软骨素糖 骨架）。硫酸软骨素是由软骨素的硫酸化组成的多糖。
[0004] 传统上从动物的软骨、器官等提取和纯化软骨素和硫酸软骨素。然而，近年来，因 为诸如软骨和器官之类的材料不足，已经研宄了人工合成对于软骨素和硫酸软骨素而言常 见的糖骨架的技术。
[0005] 已经报道了软骨素合酶，其通过交替地将GlcUA和GalNAc从它们的供体底物转移 至受体寡糖而产生软骨素，并且已经提出了应用该酶生产软骨素的方法。
[0006] J. Biol. Chem. 275 (31)，24124-24129 (2000)公开了衍生自多杀性巴氏杆菌 (Pasteurella multocida)的软骨素合酶。
[0007] 此外，WO 2003/102193和WO 2003/102194公开了衍生自人类的软骨素合酶。
[0008] 此外，US 2003-0109693 (JP 2003-199583 A)公开 了由大肠杆菌（Escherichia coli)K4株产生的新软骨素合酶（KfoC)。
[0009] 然而，在通过酶方法生产软骨素的情况下，需要制备昂贵的材料，诸如作为受体的 寡糖和作为GlcUA和GalNAc的供体的糖核苷酸，因此期望应用更便宜的材料生产软骨素的 方法。
[0010] 已知大肠杆菌K4株产生具有软骨素骨架结构的多糖作为荚膜。然而，其结构由 包括GalNAc残基、GlcUA残基和果糖残基的三糖的重复单元组成，其中所述的果糖残基与 GlcUA残基的C3-羟基连接。此外，在大肠杆菌中已经检测到了超过100种化学上不同的 荚膜多糖。例如，大肠杆菌K5株产生具有肝素/硫酸乙酰肝素的糖骨架的荚膜多糖K5 (J. Biol. Chem.，272 (5)，p2682-2687,1997)。然而，还不知道有产生软骨素本身的大肠杆菌的 存在。因此，应用大肠杆菌生产软骨素的方法是未知的。
[0011] 尽管美国公开专利申请2007-0281342公开了通过应用引入了衍生自多杀性巴氏 杆菌的软骨素合酶基因的重组革兰氏阳性菌生产软骨素的方法，然而期望在软骨素的发酵 生产中有更进一步的发展。
【发明内容】
[0012] 本发明的一个目的是提供能够生产软骨素的新微生物，以及应用该微生物生产软 骨素的新方法。
[0013] 本发明的发明人进行了深入的研宄，结果发现引入了衍生自大肠杆菌K4株kfoA 和kfoC基因的产生UDP-葡糖醛酸的细菌诸如大肠杆菌K5株高效地产生软骨素，因此完成 了本发明。
[0014] 本发明的一个目的是提供引入了衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因和衍生自大肠 杆菌K4株的kfoC基因并且具有产生软骨素的能力的产生UDP-葡糖醛酸的细菌。
[0015] 在本文中，所述的衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因优选为编码选自由以下（A) 和（B)所组成的组的蛋白的基因：
[0016] ⑷包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的蛋白质；以及
[0017] ⑶包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的蛋白质，其包括一个或几个氨基酸的替换、 缺失、插入或添加并具有UDP-葡萄糖-4-差向异构酶活性。
[0018] 所述的衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因优选为选自由以下（a)和（b)组成的组 的 DNA :
[0019] (a)包含SEQ ID NO :1的核苷酸序列的DNA ;和
[0020] (b)在严格条件下与包含和SEQ ID NO :1互补的核苷酸序列的DNA杂交并编码包 含Μ)Ρ-葡萄糖-4-差向异构酶活性的蛋白的DNA。
[0021] 此外，所述的衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因优选为编码选自由以下（C)和（D) 所组成的组的蛋白的基因：
[0022] (C)包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列的蛋白质；以及
[0023] (D)包含SEQ ID NO :4氨基酸序列的蛋白质，其包括一个或几个氨基酸的替换、缺 失、插入或添加并具有软骨素合酶活性。
[0024] 此外，所述的衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因优选为选自由以下（c)和（d)组 成的组的DNA :
[0025] (c)包含SEQ ID NO :3的核苷酸序列的DNA ;和
[0026] (d)在严格条件下与包含和SEQ ID NO :3互补的核苷酸序列的DNA杂交并编码具 有软骨素合酶活性的蛋白的DNA。
[0027] 此外，所述的衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因优选为编码选自由以下（E)和（F) 所组成的组的蛋白的基因：
[0028] (E)包含SEQ ID NO :6氨基酸序列的蛋白质；以及
[0029] (F)包含SEQ ID NO :6氨基酸序列的蛋白质，其包括一个或几个氨基酸的替换、缺 失、插入或添加并具有软骨素合酶活性。
[0030] 此外，所述的衍生自大肠杆菌K4株的kfoC基因优选为选自由以下（e)和（f)组 成的组的DNA :
[0031] (e)包含SEQ ID NO :5的核苷酸序列的DNA ;和
[0032] (f)在严格条件下与包含和SEQ ID NO :5互补的核苷酸序列的DNA杂交并编码具 有软骨素合酶活性的蛋白的DNA。
[0033] 所述的产生UDP-葡糖醛酸的细菌优选为大肠杆菌K5株。
[0034] 本发明的另一目的是提供生产软骨素的方法，其至少包括以下步骤（1)和（2):
[0035] (1)培养如上所述的细菌；以及
[0036] (2)从该培养物中收集软骨素。
[0037] 本发明的另一目的是提供生产硫酸软骨素的方法，其包括：通过如上所述的方法 生产软骨素；以及然后将该软骨素硫酸化以产生硫酸软骨素。
[0038] 本发明的另一目的是提供包含衍生自大肠杆菌K4株的kfoA基因和衍生自大肠杆 菌K4株的kfoC基因的载体。
【附图说明】
[0039] 图1是显示了用于表达kfoA和kfoC基因的载体结构的图。
[0040] 图2是显不了 kfoA和kfoC蛋白表达的图（照片）。泳道1显不没有引入质粒的 菌株（对照），泳道2显示引入了 pTrcHis-kfoCA的菌株，以及M显示分子量标记。
[0041] 图3显示了对于用软骨素酶ABC (cABC)处理的级分L(A)、没有用cABC处理的级分 L(B)以及用热灭活的cABC处理的级分L(C)，采用荧光HPLC系统的二糖组成分析的结果。
[0042] 图4显示了对于用cABC处理的级分E(A)、没有用cABC处理的级分E (B)以及用热 灭活的cABC处理的级分E (C)的荧光二糖分析的结果。
[0043] 图5显示了对于用cABC处理的级分S(A)、没有用cABC处理的级分S (B)以及用热 灭活的cABC处理的级分S(C)的荧光二糖分析的结果。
[0044] 图6显示了对于用cABC处理的软骨素标准品（A)、用cABC处理的软骨素标准品和 用cABC处理的级分L的混合物（B)的荧光二糖分析的结果。
[0045] 图7是显示了应用（A)抗-KfoC抗体（EK-C)作为一抗、（B)抗-KfoA抗体（EK-A) 作为一抗以及（C)正常兔血清，KfoA、KfoC和Kfo Λ C蛋白表达的图（照片）。泳道1和5 显示分子标记MagicMarkXP标准品（Invitrogen)，泳道2显示引入了 pTrcHis-kfoCA的菌 株，泳道3显示引入了 pTrcHis-kfoACA的菌株，以及泳道4显示引入了 pTrcHis-kfoA的 菌株。
【具体实施方式】
[0046] 在下文中，将详细地描述本发明。
[0047] 〈1>本发明的细菌
[0048] 本发明的细菌是引入了衍生自大肠杆菌K4株的kfoA和kfoC基因的产生UDP-葡 糖醛酸且具有产生软骨素的能力的细菌。
[0049] "产生UDP-葡糖醛酸的细菌"提供了 UDP-葡糖醛酸，其可被用于产生包含葡糖 醛酸的多糖。对"产生UDP-葡糖醛酸的细菌"没有限制，只要其产生UDP-葡糖醛酸，并 且其实例包括属于葡糖酸醋杆菌属的细菌，诸如汉森葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter hansenii)和木葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus);属于根瘤菌（Rhizobium) 属的细菌，诸如Rhizobium meffloti;属于醋酸杆菌（Acetobacter)属的细菌，诸如木 醋杆菌（Acetobacter xylinum);属于欧文氏菌（Erwinia)属的细菌，诸如解淀粉欧文 氏菌（Erwinia amylovora);属于硫杆菌（Thiobacillus)属的细菌，诸如氧化亚铁硫杆 菌（Thiobacillus ferrooxidans);属于木杆菌属（Xylella)属的细菌，诸如苛养木杆菌 (Xylella fastidiosa);属于中华根瘤菌属（Sinorhizobium)属的细菌，诸如苜蓿中华根 瘤菌（Sinorhizobium meliloti);属于红球菌（Rhodococcus)属的细菌，诸如玫瑰色红球 菌（Rhodococcus rhodochrous);属于克雷伯氏菌（Klebsiella)属的细菌，诸如产气克雷 伯氏菌（Klebsiella aerogenes);属于肠杆菌（Enterobacter)属的细菌，诸如产气肠