8] 具体步骤：
[0149] 1.构建过表达Wnt4的慢病毒载体(构建方法同实施例3)
[0150] 2.过表达Wnt4的慢病毒颗粒的制备：将慢病毒包装载体质粒pCMVAR8. 2， pCMV-VSV-G质粒(可以从addgene购买）和过表达Wnt4的慢病毒载体质粒共同转入293T 细胞(质粒比例为6 :4 :10 ;每4X106细胞中转入20 μ g质粒)，转染后16至24小时更换 新鲜培养液；更换新鲜培养液后24小时和48小时分别收取含有慢病毒颗粒的上清，并以 20000RPM，超速离心2小时进行制备浓缩过表达Wnt4的慢病毒颗粒。同时制备pWPI空载 体的慢病毒颗粒。
[0151] 3.如前所述，通过流式分选得到野生型Balb/c小鼠的乳腺管腔细胞，并以悬浮感 染的方式利用步骤2中浓缩的pWPI载体的慢病毒颗粒和过表达Wnt4的慢病毒颗粒进行感
[0152] 染；感染时间为16至24小时；
[0153] 4.如前所述，通过流式细胞分选得到Actin-DsRed小鼠的乳腺干细胞，并将步骤3 中感染后的乳腺管腔细胞与之混合(混合比例：管腔细胞：干细胞=3 :1)。混合后的两种细 胞放入基质胶中进行3D培养；培养分为三组：一组为感染pWPI空载病毒颗粒的管腔细胞 与干细胞共培养；一组为感染过表达fct4病毒颗粒的管腔细胞与干细胞共培养；一组为感 染过表达fct4病毒颗粒的管腔细胞与干细胞共培养，但基本培养液中加入Wnt蛋白分泌抑 制剂IWP2 (2uM)进行培养。
[0154] 5.培养细胞的传代：将上述培养的细胞每隔5至7天按之前所述方法进行传代， 传至第三代时将所得到的DsRed乳腺干细胞移植入3周龄的雌性裸鼠脂肪垫中。每次传代 时记录DsRed乳腺干细胞的克隆形成数，移植时每组DsRed乳腺干细胞分三个梯度移入裸 鼠，分别为500, 200,100个细胞克隆。
[0155] 6.移植后的小鼠继续饲养4至8周，检查乳腺再生情况。可在荧光显微镜下拍摄 再生的全乳腺图片，也可以将乳腺取出后进行K8, K14染色以确定再生的乳腺是否生长正 堂 巾。
[0156] 结果如图4所示。图4 (a)为实验流程；图4 (b，c，d):共培养时3组代表性照片； 图4 (e):对比pWPI载体组，与过表达Wnt4的管腔细胞共培养的乳腺干细胞在传代过程中 细胞克隆数目明显增多，与过表达fct4的管腔细胞共培养但培养液中加入抑制剂IWP2的 乳腺干细胞在传代过程中细胞克隆数目与对照组差别不大。图4 (f):再生的全乳腺照片 和K8，K14染色后的照片，照片显示再生的为正常乳腺；图4 (g):三组干细胞移植三个不同 梯度数目的干细胞克隆时乳腺再生的统计表，结果显示，对照组干细胞没有乳腺再生，fct4 组每个梯度均有乳腺再生，fct4加 IWP2组只在最高数量干细胞移入时才有乳腺再生。
[0157] 由图4可见，和对照组相比，Wnt4组干细胞的克隆数目增加明显且连续传代后这 些干细胞克隆具备再生乳腺的能力，这说明fct4蛋白的表达能够促进乳腺干细胞的自我 更新和扩增并保持其干细胞特性；和fct4组相比，加入抑制剂IWP2后可以抑制干细胞克隆 数目的增加且连续传代后干细胞的再生乳腺能力明显受到抑制，由于IWP2的作用是抑制 fct蛋白的分泌，因此说明Wnt4对乳腺干细胞的扩增和再生能力的维持作用是通过旁分泌 实现的。这些结果说明，管腔细胞中表达的fct4蛋白能够通过旁分泌的形式促进乳腺干细 胞的自我更新和扩增并保持其干细胞特性，而高表达fct4的管腔细胞能够使乳腺干细胞 有更强的重建能力。
[0158] 实施例5
[0159] Wnt4和Rspol蛋白在乳腺干细胞体内重建中的作用试验：
[0160] 具体步骤：
[0161] I. shRNA构建：将Wnt4和Rspol的shRNA序列分别构建入pLKO. I-EGFP和 pLKO. IiCherry载体(载体可从addgene购买）；
[0162] Wnt4 基因的 shRNA-sense 序列为：
[0163] CAGATGTGCAAACGGAACCTT (Seq ID. No. 7)
[0164] Rspol 基因的 shRNA-sense 序列为：
[0165] CACTCACATCAGTAGGACCTA(SeqID.No.8^PAGAAGTCAACGGTTGCCTCAACTCGAG(Seq ID. No. 9)
[0166] 构建方法见pLKO. 1载体说明书，相关信息亦可从
[0167] http://www. addgene. org/tools/protocols/plko/#C 上获取。
[0168] 2.病毒制备：方法如实施例4所述，分别制备Wnt4-shRNA-EGFP和 Rspol-shRNA-mCherry的浓缩病毒以及pLKO. 1-EGFP和pLKO. InCherry载体的浓缩病毒；
[0169] 3.单细胞培养：方法如前所述，制备出6至8周成年小鼠的乳腺单细胞并将之铺 入6孔细胞培养板，加入培养液进行培养。注：本实验所用培养液为DMEM+1%PS+10%FBS。
[0170] 4.感染：培养20小时后吸出培养液并用PBS洗涤一次，然后加入新鲜培养液并 加入步骤2中浓缩病毒进行感染。共分4个实验组：第一个实验组同时感染pLKO. I-EGFP 和pLKO. 1-mCherry两种载体病毒；第二个实验组感染Wnt4-shRNA-EGFP病毒；第三 个实验组感染Rspol-shRNA-mCherry病毒；第四个实验组感染Wnt4-shRNA-EGFP和 Rspol-shRNA-mCherry 两种病毒。
[0171] 5.细胞分选：感染后的细胞培养5至7天，进行常规的胰酶消化成单细胞，将四组 单细胞进行流式细胞分选，分别得到表达EGFP和mCherry的感染两种载体的第一组细胞； 表达EGFP的感染Wnt4-shRNA的第二组细胞；表达mCherry的感染Rspol-shRNA的第三组 细胞；表达EGFP和mCherry的感染Wnt4-shRNA和Rspol-shRNA的第四组细胞。
[0172] 6.移植实验：按照之前所述移植方法，将分选得到的四组细胞分别移植入3周龄 的裸鼠乳腺脂肪垫。每组细胞按照3个梯度的细胞量分别移植1000, 3000,和10000个细 胞。将移植后的小鼠继续培养约8周，检查乳腺再生情况。
[0173] 结果如图5所示。图5 (a)所示为第一组感染载体病毒，结果显示感染载体病 毒后在正常发育期和怀孕期细胞均能够重建成正常的乳腺；图5 (b)所示为第二组感染 Wnt4-shRNA病毒，结果显示和感染载体病毒的细胞相似，在正常发育期和怀孕期均能够重 建成正常的乳腺；图5 (c)所示为第三组感染Rspol-shRNA病毒，结果显示和感染载体病毒 的细胞相比，该组细胞在正常发育期再生的乳腺侧分支明显减少，在怀孕期乳腺的小泡减 少；图5 (d)所示为第四组感染Wnt4-shRNA和Rspol-shRNA病毒，结果显示在正常发育期 和怀孕期均没有乳腺重建；图5 (e)为统计结果，结果显示Wnt4-shRNA病毒感染组与载体 感染对照组相比重建效率相差不大；Rspol-shRNA病毒感染组比载体感染对照组的细胞重 建效率明显较低；同时感染fct4-shRNA和Rspol-shRNA病毒组没有乳腺重建。
[0174] 可见，由于管腔细胞中高表达的Wnt4蛋白能够促进乳腺干细胞的自我更新和扩 增，且Rspol蛋白能够放大wnt信号通路的活性，因此我们鉴定了 Wnt4和Rspol蛋白在乳 腺干细胞体内重建时的必要性。我们的结果表明单独敲除fct4基因并不影响乳腺重建；单 独敲除Rspol基因会使重建的乳腺在正常发育期侧分支减少，在孕期乳腺小泡减少；同时 敲除Wnt4和Rspol基因，乳腺干细胞将不能够进行乳腺重建。这说明乳腺干细胞在体内重 建时需要Rspol蛋白，Rspol蛋白的缺失将影响乳腺的正常发育；乳腺干细胞在体内重建时 可能并不单独依赖Wnt4蛋白，在Wnt4蛋白缺失的情况下，Rspol蛋白可能与其它Wnt蛋白 共同作用维持乳腺的发育；同时缺失Wnt4和Rspol蛋白乳腺不能重建，则说明Wnt4在所有 的Wnt蛋白中可能对乳腺的发育起到最重要的作用。
[0175] 实施例6
[0176] 激素促进乳腺干细胞的体外扩增并维持其干细胞特性试验
[0177] 具体步骤：
[0178] 1.流式细胞分选：如前所述方法，通过流式细胞分选得到野生型小鼠的乳腺管腔 细胞和乳腺干细胞以及Actin-DsRed小鼠的乳腺干细胞。
[0179] 2.细胞共培养：将步骤1中分选得到的管腔细胞和干细胞按照3:1的比例混合 后放入基质胶并铺入24孔板进行3D培养。培养时共分三组：第一组为野生型小鼠的乳腺 干细胞和Actin-DsRed小鼠的乳腺干细胞按照3:1的比例混合培养，基本培养液（DMEM/ F12=l:l，1%PS，l%ITS，50ng/mL EGF)中加入雌激素（ΙμΜ)和孕激素（2. 5μΜ);第二组为野 生型小鼠的乳腺管腔细胞和Actin-DsRed小鼠的乳腺干细胞按照3:1的比例混合培养，基 本培养液中加入雌激素（1 μ Μ)和孕激素（2. 5 μ M);第三组为野生型小鼠的乳腺管腔细胞和 Actin-DsRed小鼠的干细胞按照3:1的比例混合培养，基本培养