一株刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株及其应用，采用基因工程技 术，阻断刺糖多孢菌中亮氨酰氨肽酶同源基因表达，获得杀菌素高产菌株s. SP- Λ pepA。
【背景技术】
[0002] 多杀菌素及其衍生物同时具有高效杀的虫活性及绿色安全的优良特性，成为近几 年生物杀虫制剂研宄领域的一大热点，而野生菌株极低的发酵产量是阻碍多杀菌素进一步 研宄的难题。多杀菌素通过与烟碱乙酰胆碱受体结合使昆虫神经细胞去极化，引起中央 神经系统超活化，从而导致非功能性肌收缩、衰竭和麻痹，因此它对昆虫有快速触杀和摄 食毒性。多杀菌素杀虫谱十分广泛，包括鳞翅目（Lepidoptera)、缨翅目（Thysanoptera)、 鞘翅目（Coleoptera)、膜翅目（Hymenoptera)、双翅目（Diptera)等害虫，尤其对鳞翅目、 缨翅目害虫有极强的选择性杀虫活性。多杀菌素具有诸多衍生物，到目前为止，由刺糖多 孢菌所产生的多杀菌素共分离得到30多种，其中包括9种缺少福乐糖基的拟糖苷配基 (Pseudoaglycone，PSA)，多杀菌素拟糖苷配基也可用作进一步化学修饰的底物，并产生新 的带有独特性质和活性谱的半合成多杀菌素。
[0003] 目前国际上关于多杀菌素合成机制的研宄仍处在起步阶段，野生型刺糖多孢菌菌 株中多杀菌素产量极低，因此如何提高其发酵产量是亟待解决的一大难题。多杀菌素的合 成量极低，采用各种途径如培养基优化、理化诱变和分子遗传改造等方法对其进行菌种改 良是非常有必要的。利用基因工程技术对刺糖多孢菌基因组进行定向遗传修饰，有望成为 提尚多杀菌素广量有效方法。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，利用基因工程技术，提供一株 刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株及其应用，通过定向遗传修饰刺糖多孢菌，获得多杀菌 素高产菌株。
[0005] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是， 本发明之刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株，即刺糖多孢菌S. SP- Λ pepA， 577//705? S. sp-ApepA,于2015年6月8日在中国典型培养物保藏 中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学）保藏，菌种保藏号为CCTCC NO :M 2015362。
[0006] 本发明之多杀菌素高产工程菌株的获得步骤如下： (1) 通过 NCBI 的在线 Blast 工具（http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)进 行搜索和比对亮氨酰氨肽酶基因（/^以)，利用Cluster X软件对同源蛋白序列进行比对分 析； (2) PCR扩增含班《1111/ feoR V酶切位点的1420 bp的/76細同源基因中间片段； (3) 利用"ialIII/ feoR V双酶切原始质粒p0J260和同源基因片段后，通过连接酶作 用获得敲除载体P〇J26〇-pepA ; (4) 通过电转化方法将敲除载体p0J260-pepA导入供体菌E. coli S17后与野生型刺 糖多孢菌进行接合转移，构建工程菌株刺糖多孢菌S. SP- Λ pepA ; (5) 设计引物鉴定p0J260-pepA整合位点； (6) HPLC分析工程菌多杀菌素的生物合成能力； (7) 比较蛋白质组学分析亮氨酰氨肽酶同源基因阻断对刺糖多孢菌蛋白表达水平的影 响。
[0007] 研宄表明，亮氨酰氨肽酶（pepA; EC 3. 4. 11. 1)是氨肽酶M17超家族中的一员，该 家族成员均具有从蛋白质、多肽的N端将亮氨酸残基切割下来的作用。该家族胺肽酶在生 物界普遍存在，其功能结构的研宄仅在牛、大肠杆菌、土豆中开展过。
[0008] 研宄证明，大肠杆菌的p epA具有DNA结合活性，能与多种启动子序列结合，对p epA 蛋白六聚体X射线三维结构分析发现其具有一个凹槽结构，该结构被认为是DNA结合位点。 Song等在天蓝色链霉菌中将亮氨酰氨肽酶基因（/^以）敲除发现缺失突变株产孢子能力和 抗生素合成能力明显提高，双向电泳和1^〇?检测发现/^7、>55^、和<^(//-0/?/￥的蛋白 表达和转录水平也有较大幅度提高，这表明天蓝色链霉菌中的在抗生素合成过程中 作为负调控因子发挥作用。
[0009] 本发明利用NCBI数据库和Cluster X软件从刺糖多孢菌基因簇中找到亮氨 酰氨肽酶同源基因，PCR扩增该同源基因的中间片段，利用限制性酶切、连接的方法， 将PCR产物克隆到大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒p0J260上，采用属间接合转移方法将功 能载体P〇J26〇-pepA导入刺糖多孢菌中，获得亮氨酰氨肽酶基因被阻断的工程菌株S. sp- Λ pepA。PCR鉴定结果表明，该质粒已成功地整合至刺糖多孢菌基因组上，并设计引物 对该功能载体在刺糖多孢菌基因组上的整合位点进行了鉴定。HPLC检测结果表明，工程菌 S. sp- Λ pepA中多杀菌素产量提高到原始菌株的137%。光学显微镜观察表明，/76·/^基因 阻断后刺糖多孢菌菌丝形态发生明显变化，其菌丝变短，分支增多且片段化程度提高；利用 SDS-PAGE方法对工程菌株S. sp-Λ pepA和原始菌株5： 的全蛋白进行比较分析， 发现亮氨酰氨肽酶基因阻断后，工程菌株全蛋白条带减少尤其是66. 4- 97. 2 kDa区域，且 分子量超过100 kDa的蛋白表达均被抑制，但某些条带蛋白表达水平显著提高。ID-LC-MS/ MS鉴定差异蛋白条带，结果表明p印A基因阻断后菌株的能量代谢和蛋白组装过程发生改 变。
[0010] 微生物保藏情况说明 本发明之刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株，即刺糖多孢菌S. SP- Λ pepA， 577//705? S. sp-ApepA,于2015年6月8日在中国典型培养物保藏 中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学）保藏，菌种保藏号为CCTCC NO :M 2015362。
【附图说明】
[0011] 图1为基因编码蛋白同源性比对图； 图2 -A和图2 - B为功能载体p0J260-pepA的构建图；A，同源基因片段的PCR扩增； B，功能载体p0J260-p印A的酶切鉴定； 图3为接合子的PCR鉴定图；M，DNA Marker;泳道1，阴性对照；泳道2,阳性对照；泳 道3、4，接合子基因组S. sp-ApepA为模板； 图4 一 A和图4 一 B为载体p0J260-pepA整合位点的鉴定图；4 一 A，载体整合方式示 意图；4 一 B，整合位点鉴定图； 图5为本发明工程菌刺糖多孢菌S. sp- Λ p印A与原始菌刺糖多孢菌S. spinosa (48 h)菌丝形态观察图； 图6 -A和图6 -B为原始菌株刺糖多孢菌5： (6 - A)与工程菌株刺糖多 孢菌 S. sp- Λ pepA (6 - B)的 HPLC 分析图； 图7为SDS-PAGE分析原始菌与工程菌（72 h)全蛋白图。
[0012]
【具体实施方式】
[0013] 以下对本发明的【具体实施方式】结合附图进行详细说明。
[0014] 本实施例之刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株，即刺糖多孢菌S. sp- Λ pepA， 577//705? S. sp-ApepA,于2015年6月8日在中国典型培养物保藏 中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学）保藏，菌种保藏号为CCTCC NO :M 2015362。
[0015] ①具体培养基配方和培养条件 (1) 5： 种子活化采用SP-2培养基：葡萄糖9 g/L，胰蛋白胨大豆肉汤30 g/ L，酵母提取物3 g/L，硫酸镁2 g/L。接种单克隆或1%菌种保藏液加入装有20 mL SP-2的 250 mL 摇瓶中，30°C，300 r/min 培养 48-72 h; (2) 转接采用胰蛋白胨大豆肉汤（TSB)培养基：胰蛋白胨大豆肉汤30 g/L ;接种1%菌 液加入装有 20 mL SP-2 的 250 mL 摇瓶中，30°C，300 r/min 培养 48-72 h; (3) 发酵培养采用SP-3培养基：葡萄糖60 g/L，可溶性淀粉10 g/L，玉米浆7 g/L，棉 籽粉22.5 8/1，豆饼粉5 8/1，酵母提取物2 8/1，碳酸钙5 8/1，油酸甲酯42111171，微量元 素2. 5 mL/L (氯化钴0. 3 g/L，硫酸锌I. 4 g/L，硫酸亚铁3. 8 g/L，硫酸镍0. 5 g/L，溶于 0. 5 mol/L的盐酸中），pH 7. 0 ;接种10%菌种保藏液加入装有20 mL SP-3的300 mL摇瓶 中，30°C，300 r/min 培养 10-12 d; (4) 接合转移采用R6固体培养基：培养基（g/L):蔗糖200,糊精10,酪蛋白氨基酸1，， K2SO4 0·