专利名称：一种安全、高效生产1，3丙二醇的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，S卩通过特定的基因敲除系统，敲除克雷伯氏杆菌(K. pneumoniae)中荚膜产生基因wzi,从而去除荚膜,提高I, 3-PD发酵的安全性和产物分泌性能，安全、高效的转化甘油生产1，3-丙ニ醇的方法。
背景技术：
1，3_丙ニ醇(l，3-porpanediol，简称1，3_PD)是ー种重要的化工原料，可用作溶齐U、抗冻剂或保护剂、精细化工原料以及新型聚醋一聚对苯ニ甲酸丙ニ醇醋(PTT)和聚·氨醋的单体。PTT已被证明是ー种性能优异的新型聚酯材料。现有的i，3-ro生产法有化学合成法和生物合成法。相对于化学合成法而言，生物法合成1，3-PD的条件更温和、操作简单、副产物少、更绿色环保。随着1，3-PD需求量的日趋扩大，对于1，3-PD的生物合成法的研究已越来越受到国内外研究人员的重视。生物合成法的主要路线是在生物催化剂的作用下将甘油转化为1，3_PD。目前，自然界中能将甘油转化为1，3-PD的微生物大致包括克雷伯氏杆菌(Klebsiella)、弗氏柠檬菌(Citrobacter)、丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium)等等。其中克雷伯氏杆菌因生物转化效率高、生物转化过程操作方便，研究应用最多。如I、刘德华等，ー种发酵生产I，3-ro的高产エ艺(申请号CN200710063347. O)，该方法以中间代谢产物3-羟基丙醛为控制指标来促进微生物合成1，3-PD ;2、杜铭等，氧化还原电势调控厌氧发酵生产1，3-PD方法(申请号CN200410086573. 7)，该方法通过调控发酵体系的氧化还原电势来促进微生物合成1，3-PD。3、宫衡等，一种转化甘油生产1，3-丙ニ醇的方法(申请号CN200710048122. 8)，该方法通过控制渗透压来促进微生物合成1，3-PD。上述方法无ー例外的都利用克雷伯氏杆菌。但是克雷伯氏杆菌ェ业应用过程中的ー个必须考虑的问题就是该菌有荚膜，导致1)荚膜带来的潜在治病性，2)荚膜的存在会影响到克雷伯氏杆菌分泌产物的特性。克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)荚膜血清型有Kl和K2两种主要分型。Arakawa Y等对Κ2型Klebsiella pneumoniae荚膜多糖合成基因进行了研究,得到了一条24329bp的荚膜多糖合成基因相关序列cps基因簇，该序列上共有19个开放阅读框，部分和E. coli K12 菌株 cpsB 基因的同源(Journal of bacteriology. 1995,177 (7) :1788)。有报道称克雷伯氏杆菌中荚膜magA基因和治病性显著相关，序列比对分析克雷伯氏杆菌cps基因簇发现，上面有ー些保守基因如与荚膜多糖的转移和表面装配有关wzi, wza, wzb, wzc基因等(The Journal of infectious diseases. 2006,193 (5) :645-654)。但是到目前为止少有产I，3-PD克雷伯氏杆菌中荚膜基因的报道，以及敲除其基因对荚膜合成的影响。有关克雷伯氏杆菌的基因敲除的研究多采用oriR6K型自杀质粒的传统方法，实验周期较长，且整合到受体菌株基因组上的抗性标记无法去除，不适用于多基因突变的研究。Datsenko K等构建了ー套适用于E. coli K12菌株靶基因快速敲除的质粒系统(Red重组系统)。该系统需要三种质粒，分别是表达Exo、Beta、Gam蛋白的协助同源重组质粒PKD46 ;两侧含FRT位点的抗性基因的质粒pKD3/4 ;受诱导表达Flp重组酶用于消除基因组上同源重组抗性基因的质粒 pCP20 (Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 2000,97 (12) :6640)。相对于自杀质粒的传统敲除方法，Red重组系统一方面重组效率高，另ー方面可以去除基因敲除的抗性标记，因而优势明显。但目前还没有Red重组系统在克雷伯氏杆菌中应用的例子，主要是由于克雷伯氏杆菌具有氨苄抗性，而PKD46和pCP20的筛选依赖于该抗性基因。
发明内容
本申请的发明人在研究中发现，用于转化甘油生产1，3_PD的克雷伯氏杆菌中，基因分析发现首先不含有magA基因，进ー步对其荚膜基因簇中其它保守基因研究发现:wzi高度保守，敲除其能够阻断克雷伯氏杆菌荚膜多糖的形成，改变细胞的通透性。此外通过对 Red重组系统改造，引入四环素抗性，构建新的Red重组系统(pKD46_Tc，pCP20_Tc)用于克雷伯氏杆菌的基因敲除。本发明目的在于提供ー种安全、高效生产1，3_丙ニ醇的方法，即通过特定改进的Red重组系统，敲除克雷伯氏杆菌中引起荚膜产生的wzi基因，从而提高1，3-PD发酵的安全性和产物分泌性能。本发明安全、高效生产1，3-丙ニ醇的方法，包括种子培养以及发酵罐发酵转化甘油生成1，3-丙ニ醇，该方法通过改进的Red重组系统，敲除克雷伯氏杆菌中引起荚膜产生的wzi基因，从而提高1，3-PD发酵的安全性和产物分泌性能。根据本发明，所述的改进的Red重组系统为pKD46_Tc，pCP20_Tc，具体如下pKD46_Tc是在pKD46的amp抗性基因上利用限制性酶酶切连接插入四环素抗性基因得到的。pCP20_Tc是在pCP20的amp抗性基因上利用限制性酶酶切连接插入四环素抗性基因得到的。上述限制性酶切位点为Xmn I，四环素抗性基因来源于pBR322质粒，以PCR扩增得至IJ。根据本发明，所述wzi基因的敲除具有下列关键特征设计三对特定引物I)F-FRT (SEQ ID No. I)和 R-FRT (SEQ ID No. 2)，扩增两端含FRT位点的kan抗性基因片段FK (约1500bp) ；2) Fup-wzi (SEQ ID No. 3)和Rup-wzi : :FRT (SEQ ID No. 4)，扩增 wzi 片段的上游 250bp 的序列，Rup-wzi : :FRT 反向引物的 5’端加入了 F-FRT 的部分序列；3) Fdown-FRT: :wzi (SEQ ID No. 5)和 Rdown-wzi (SEQ IDNo. 6),扩增wzi片段下游250bp的序列，Fdown-FRT: :wzi正向引物的5’端加入了 R-FRT的部分序列。采用两步PCR技术，得到打靶片段AWzi::FK(1981bp)。获得敲除荚膜基因wzi的克雷伯氏杆菌，其基因表型含有序列SEQ ID No. 7。根据本发明，用于转化甘油生成1，3_丙ニ醇的菌株为克雷伯氏杆菌K. pneumoniae。研究出发菌株为克雷伯氏杆菌K. pneumoniae ATCC49790购自中国普通エ业微生物菌种保藏中心。用于研究的初始质粒pKD46, pKD3/4, pCP20购自Clontech公司，PBR322 购自 TaKaRa 公司。相比现有的转化甘油生产1，3_PD的方法，本发明的方法的主要优点包括采用了高效的基因敲除系统、去除了克雷伯氏杆菌中的wzi荚膜基因，提高了 1，3-PD发酵的安全性，并且有利于产物的分泌。
图lpKD46_Tc的构建图谱图2pCP20_Tc的构建图谱图 3K. pneumoniae/pKD46_Tc 电泳图(7665bp)图4两步PCR制备打靶片段Awzi: :FK(1981bp)图5基因敲出除后的电泳条带(92Ibp)
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进ー步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。以下实施例中，LB培养基配方0. 5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1% NaCl,pH 7. O ;固体培养基在此基础上加入I. 2% -I. 5%的琼脂。实施例I、构建适用于克雷伯氏杆菌的Red重组质粒系统pKD46_Tc和pCP20_Tc通过序列查找发现这两个质粒的Amp抗性基因上有ー个Xmn I限制性酶切位点，且整个质粒中该位点只有ー个，在该位置插入其他抗性基因可以使这两个质粒具有新的抗性标记，同时去除了 Amp抗性标记。以pBR322质粒为模板，设计其四环素抗性基因的引物F_tet (5’-GGAAAACGTTCCTCATGTTTGACAGCTFATCATCG-3，)和 R_tet(5， -GGAACATTTTCGGAGTGGTGAATCCGTTAGCG-3，)，两端力上Xmn I酶切位点，PCR扩增tet基因，胶回收tet片段，连到T载体后转化至DH5a感受态细胞中，涂LB平板(盐酸四环素20 μ g/ml)，37°C过夜培养12_16h ;次日挑取单克隆扩增后抽质粒，用Xmn I酶切鉴定重组质粒tet-pMD18T。用T4连接酶将片段tet分别与同样用Xmn I酶切的pKD46和pCP20连接，将连接产物转化至DH5a感受态细胞中，涂LB平板(盐酸四环素20 μ g/ml)，30°C过夜培养16-20h，挑取单克隆扩增后抽质粒，用Xmn I酶切鉴定重组质粒pKD46_Tc和pCP20_Tc，构建的pKD46-Tc和pCP20-Tc如图I、图2所示。之后将pKD46_Tc转化到K. pneumoniae ATCC49790菌株中，涂LB平板(盐酸四环素20 μ g/ml)，30°C培养过夜，得到的K. pneumoniae/pKD46-Tc菌株阳性克隆，根据pKD46质粒上 exo-bet-gam 基因设计引物 F-46 (5，-TGGGAATTCGAGCTCTAAGGAGG-3’ )和 R-46 (5，-ATGCGTCATCGCCATTGCTC-3’)，做菌落PCR进ー步鉴定，结果见图3所示，说明pKD46_Tc转化到K. pneumoniae ATCC49790 中。实施例2、敲除克雷伯氏杆菌的荚膜基因wziI. ニ步 PCR 法扩增片段 Awzi: :FK以pKD4质粒为模板，设计引物F-FRT和R-FRT扩增两端含FRT位点的kan抗性基因片段FK (约1500bp)。确定同源臂为250bp，设计wzi片段的上游250bp序列的两端引物Fup-wzi和Rup-wzi: :FRT,反向引物的5’端加入了 F-FRT的部分序列,wzi片段下游250bp序列的两端引物Fdown-FRT: :wzi和Rdown-wzi正向引物的5’端加入了 R-FRT的部分序列，以K. pneumoniae ATCC49790的基因组为模板扩增。将PCR扩增得到的三个片段up-wzi、down_wzi、FK按物质的量比I : I : I混合作为模板，以Fup-wzi和Rdown-wzi为引物,PCR扩增片段Δ wzi : :FK (198lbp),两步PCR流程如图4所示。2. wzi基因缺失阳性重组子的获得制备K. pneumoniae/pKD46_Tc电转化感受态细胞,加20mM L-阿拉伯糖,30°C诱导Red 重组酶表达 2. 5h。电转体系为 5 μ I Awzi : :FK 片段+100 μ I K. pneumoniae/pKD46_Tc感受态细胞，电转条件2000V，5 6ms，转化后涂LB板(卡那霉素20 μ g/ml)，37°C过夜培养。以wzi上下游外侧的序列设计重组子鉴定引物Fupout-wzi (5' -ACCACGTTCTTACGTAGACTG-3')和 Rdownout-wzi (5' GCTTAGGGTAAATGTACTTGC-3')，菌落 PCR 鉴定基因敲除的效果。
·
3.移除重组子中的抗性筛选标记制备wzi缺失重组子的电转化感受态细胞，将pCP20_Tc转化到其中，转化后涂板(盐酸四环素20 μ g/ml)，30°C培养过夜；次日挑取阳性单克隆接于画好格标号的无抗的LB平板，每格接ー个单克隆，42°C培养过夜，诱导FLP重组酶表达；次日将单格中的菌落接于相应编号的卡那霉素抗性(2020μ8/πι1)的LB平板，37°C培养过夜。卡那板上对应编号中无菌落生长即初步说明该编号的单克隆已被移除了卡那抗性筛选标记；以引物Fupout-wzi (5' ACCACGTFCTTACGTAGACTG-3')和 Rdownout-wzi (5' - GCTTAGGGTAAATGTACTTGC-3')做菌落PCR对这些单克隆进行进一步鉴定，结果如图5所示。最終得到去除抗性筛选标记的wzi缺失菌株K. pneumoniae ATCC49790 Awzi,基因表型为含有特定序列SEQ ID No. 7。实施例3、敲除荚膜基因wzi克雷伯氏杆菌的特性I、荚膜染色实验分别蘸取过夜培养的原始和英膜敲除的克雷伯氏杆菌菌菌液点在两块载玻片上，自然干燥后，用I %结晶紫水溶液染色2min，20% CuS04冲洗后，吸水纸擦干残液，在油镜下观察现象。原始菌液的镜检结果为菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色。而荚膜敲除的菌液的镜检结果为只有深紫色的菌体，没有周围淡紫色的荚膜。2、转化效率实验用10%的甘油分别制备原始和敲掉荚膜的克雷伯氏杆菌的感受态细胞，分别通过电转的方式转入PKD46-TC质粒，电转条件为2000、2500、3000伏，电转体系为IOOul菌液，O. 5ul的PKD46-TC质粒，将电转后的菌液涂布在LB平板(盐酸四环素20 μ g/ml)，30°C过夜培养后，结果如表I。从表I中可以看出敲除荚膜的菌更容易电转。表I
权利要求
1.ー种安全、高效转化甘油生产1，3-丙ニ醇的方法,其特征在于,通过特定改进的Red重组系统，敲除克雷伯氏杆菌中引起荚膜产生的wzi基因，从而提高i，3-ro发酵的安全性和产物分泌性能。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的特定改进的Red重组系统为pKD46-Tc, pCP20-Tc，具体如下 pKD46-Tc是在pKD46的amp抗性基因上利用限制性酶酶切连接插入四环素抗性基因得到的； pCP20-Tc是在pCP20的amp抗性基因上利用限制性酶酶切连接插入四环素抗性基因得到的； 上述限制性酶切位点为Xmn I，四环素抗性基因来源于PBR322质粒，以PCR扩增得到。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述敲除克雷伯氏杆菌中引起荚膜产生的wzi基因，具有下列关键特征 设计三对特定引物，I) F-FRT (SEQ ID No. I) R-FRT (SEQ ID No. 2)，扩增 FRT 位点的kan 抗性基因片段 FK ;2) Fup-wzi (SEQ ID No. 3)和 Rup-wzi ::FRT (SEQ ID No. 4)，扩增 wzi片段的上游 250bp 的序列；3) Fdown-FRT: : wzi (SEQ ID No. 5)和 Rdown-wzi (SEQ ID No. 6)，扩增wzi片段下游250bp的序列； 采用两步PCR技术，得到打靶片段Awzi::FK(1981bp)； 获得的敲除荚膜基因wzi的克雷伯氏杆菌的基因表型含有序列SEQ ID No. 7。
4.根据权利要求I 3中任一项所述的方法，其特征在于，所述用于转化甘油生成1，3-丙ニ醇的菌株为克雷伯氏杆菌Klebsiella pneumoniae。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述发酵过程采用甘油为碳源。
全文摘要
本发明公开了一种安全、高效生产1，3-丙二醇的方法，即通过特定改进的Red重组系统，敲除克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae)中引起荚膜产生的wzi基因，从而提高1，3-PD发酵的安全性和产物分泌性能。相比现有技术，本发明的方法，显著提高了克雷伯氏杆菌的基因敲除效率、获得的wzi荚膜基因缺失的克雷伯氏杆菌不仅产物浓度高，生产强度大，而且安全性高。
文档编号C12R1/22GK102660571SQ20111020411
公开日2012年9月12日 申请日期2011年7月21日 优先权日2011年7月21日
发明者付水林, 周佳佳, 宫衡, 莫隽颖 申请人:华东理工大学