专利名称：巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系及其建立方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及悬浮细胞培养技术，具体涉及巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系及其建立和应用方法。
背景技术：
巫山淫羊藿(E. wushanense)，来源于小檗科(Berberdiaceae)淫羊藿属 (Epimedium)的多年生宿根性草本植物。李时珍《本草纲目》中称其有“益精气，坚筋骨， 补腰膝，强心力，，之功效。现代药理实验研究表明，淫羊藿能增加心脑血管血流量，促进造血功能、免疫功能及骨代谢，具有抗衰老、抗肿瘤，补肾阳，强筋骨，祛风湿等功效，临床应用十分广阔《国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部KS].北京化学工业出版社， 2000. 267.；李晶晶，于世凤，李铁军，等.淫羊藿对口腔各矿化组织破骨细胞性骨吸收的体外实验研究[J].中国口腔医学杂志，2002，37(5) :391，》。其有效成分为淫羊藿甙等黄酮类化合物和多糖等次生代谢产物《郭宝林，肖培根.淫羊藿属植物中的黄酮类成分及其分类学意义.植物分类学报，1999，37 (3) :2 .》。随着现代中药产业化的进程，现代科学对淫羊藿的深入研究，新的疗效的不断发现，以淫羊藿为主要原料的中成药、民族药产品不断问世，市场对淫羊藿需求量愈来愈大，使其野生资源渐有不能满足需求之虞。国内外淫羊藿细胞悬浮培养及其黄酮含量的研究鲜见报道。而植物细胞悬浮培养生产次生代谢产物具有提高产率、缩短周期、调控其生产过程、提高产品质量等显著特点。因此，了解巫山淫羊藿悬浮细胞的生长特征，对其悬浮细胞产次生代谢产物打下基础。
发明内容
本发明目的旨在提供一种巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系及其建立方法和应用。通过研究巫山淫羊藿悬浮培养条件及其对愈伤组织中黄酮含量的影响，建立巫山淫羊藿细胞悬浮培养的技术体系，以期为巫山淫羊藿野生资源保护及建立高效的巫山淫羊藿黄酮离体生产体系提供技术基础。为实现上述目的，本发明采用正交试验和单因素试验，研究接种量、激素配比、糖浓度、培养基种类对细胞生长及黄酮含量的影响，而建立了一种巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系，该体系是以B5培养基为基本培养基，附加1. Omg · Γ1 2,4- ,Ο. 2mg · I^1BA,蔗糖 30-50mg ·Ι^，调节pH值在5. 8，于121°C高压灭菌15-20分钟配制成的生长培养基；其中以蔗糖40mg · L-1最佳。利用巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系对巫山淫羊藿愈伤组织细胞悬浮培养的方法步骤为1)、从巫山淫羊藿幼嫩叶片诱导得到的愈伤组织，经过继代培养反复筛选后选取生长均一，质地疏松，分散性好的愈伤组织作接种材料；2)、在愈伤组织接种继代16天后，接种在培养液中进行振荡培养，在120rpm，M±2°C，光照12h · Cf1培养，培养液采用同继代愈伤组织的培养基相同的激素和蔗糖浓度配比，LS 培养基 +2，4-D2. Omg · L-1+。· 5mg · L^6-BA+ 蔗糖(Sugar) 30g · L-1，只是不加琼脂， 培养瓶采用IOOmL的三角瓶；3)、每瓶中加培养液30mL，初始接种量在l_2g范围内，悬浮培养初期IOd天后用 120目的不锈钢筛对培养物进行过滤，以除去大细胞团，保留分散程度好的小细胞团及单细胞；4)、初期每半个月换培养液1次，每次换培养液时先将培养物静置，倒去上层2/3 培养液，保留1/3原液，加入2/3新液，从悬浮培养初期半个月继代1次，逐步缩短为一周继代1次，这样通过3-4次继代培养，即可得到只含单细胞或小细胞团的培养物，将这些细胞混勻，得到悬浮培养细胞；5)、将得到的悬浮培养细胞的培养物在培养6d天后，用400目不锈钢筛网过滤收集细胞，然后称量一定数量的细胞接种到分装有30mL液体培养基的IOOmL三角瓶中到进行培养，的所述液体培养基是以B5培养基为基本培养基，附加1. Omg. ^2,4-0,0. 2mg -T1BA, 蔗糖30-50mg · ΙΛ调节ρΗ值在5. 8，于121°C高压灭菌15-20分钟配制成的生长培养基， 每瓶接种继代培养6d后的经400目无菌不锈钢筛网过滤的2g淫羊藿鲜细胞，在120rpm， M±2°C，每天光照1 培养；其中以蔗糖40mg · L—1最佳；6)、培养后，每3d取5瓶细胞培养物测定其PCV，再用400目不锈钢筛网过滤，洗涤，称量其鲜重，再60°C烘干至恒重称量得干重。利用本发明的巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系，接种量为鲜重2g每30mL，该悬浮细胞培养体系能获得高产黄酮。
图1巫山淫羊藿悬浮培养细胞生长曲线图2巫山淫羊藿悬浮培养细胞黄酮含量变化曲线图3悬浮培养细胞PCV变化曲线图4悬浮培养细胞培养液中残糖含量变化曲线图5悬浮培养细胞培养液中N03_和NH4+含量变化曲线图6悬浮培养细胞培养液中PO33+含量变化曲线
具体实施例方式从巫山淫羊藿幼嫩叶片诱导得到愈伤组织将南充金城山野生巫山淫羊藿移栽至西华师范大学校园苗圃，3月初采集其幼叶作为外植体。外植体在流水下冲洗池，然后在超净工作台内用75%乙醇消毒15s，再用2% 次氯酸钠溶液消毒10s，期间不断摇动，使材料各部分与消毒液充分接触，最后用无菌水冲洗4 5次。经消毒的幼叶切成0. 5cmX0. 5cm,培养在附加激素的培养基上。将幼叶外植体接种于MS培养基+BAO. 5mg · ^+2,4-02. Omg · L—1的培养基上置于光照条件下诱导愈伤组织。将幼叶作为外植体接种到MS或LS基本培养基上基本培养基+BA(0. 5，1. 0， 2. Omg · ^)+2,4-0(1. 0,2. 0,4. Omg · L—1)。置于光照中培养(光照周期12h · d—1，光照强度1500 20001x)得到愈伤组织。增殖培养基为=MS培养基/LS培养基+2,4-02. Omg · LKO，。· 5)mg · L-1，黑暗环境下培养。本实验中全部培养基添加3%蔗糖和0. 8%琼脂，灭菌前PH5. 8，置于人工气候箱里，温度(M±》°C，相对湿度75%。愈伤组织每1个月继代1次。实施例1建立巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系本发明采用正交试验和单因素试验，研究接种量、激素配比、糖浓度、培养基种类对细胞生长及黄酮含量的影响而建立巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系。1、材料与方法1. 1材料培养从巫山淫羊藿幼嫩叶片诱导得到的愈伤组织，经过继代培养反复筛选后选取生长均一，质地疏松，分散性好的淡黄色的愈伤组织作接种材料。在愈伤组织接种继代16天后，接种在培养液中进行振荡培养(120rpm)，光照 12h ΜΛ培养液采用同继代愈伤组织的培养基相同的激素和蔗糖浓度配比，LS培养基+2， 4-D2. Omg -L^+O. 5mg -L^B-BA+SugarSOg · Λ只是不加琼脂。培养瓶采用IOOmL的三角瓶。 每瓶中加培养液30mL。悬浮培养初期IOd天后用120目的不锈钢筛对培养物进行过滤，以除去大细胞团，保留分散程度好的小细胞团及单细胞。在悬浮培养初期，培养物生长很慢， 对环境适应能力很差。初期每半个月换液1次，每次换液时先将培养物静置，倒去上层2/3 培养液，保留1/3原液，加入2/3新液。从悬浮培养初期半个月继代1次，逐步缩短为一周继代1次。这样通过3-4次继代培养，即可得到只含单细胞或小细胞团的培养物。将这些细胞混勻，得到悬浮培养细胞。1.2培养方法将得到的悬浮培养细胞的悬浮培养物在培养6d天后，用400目不锈钢筛网过滤收集细胞。然后在超净工作台上用电子天平称量一定数量的细胞接种到分装有30mL液体培养基的IOOmL三角瓶中到进行培养。1. 3悬浮培养细胞生长实验参数的测定以悬浮培养细胞的鲜重和总黄酮含量为生长指标，所得试样为4-5个平行试样的平均值。细胞鲜重测定20d天悬浮培养结束，用400目不锈钢筛网过滤收集细胞，用蒸馏水洗去细胞表面的培养液，再用滤纸吸取多余水分，最后称量得到细胞鲜重。细胞干重测定把收获的细胞测其鲜重以后，置于60°C的烘箱中过夜烘干至恒
重，称量得细胞干重。细胞增长率=(收获细胞湿重-接种细胞湿重)/接种细胞湿重X 100%。培养物中总黄酮含量的测定总黄酮含量采用分光光度法。将悬浮培养细胞收集， 洗涤，60°C烘干至恒重，研细，取0. 05g粉末至三角瓶中，加入体积浓度85%乙醇IOmL浸泡， 室温振荡48h。过滤得到总黄酮提取液。取滤液0. 5mL于试管中，再加入IOmL体积浓度85% 乙醇摇勻得到样品液，在269. 56nm处测吸光度。根据标准曲线计算相应的样品中总黄酮的含量。用淫羊藿甙标准品以同样方法测得标准曲线为C = 25. 349A-0. 2225,R2 = 0. 9990， 其中C为总黄酮含量(ug .mL-1)。2、结果
2. 1初始接种密度对淫羊藿悬浮培养细胞生长和总黄酮的影响在超净工作台上用电子天平称量lg、2g、3g悬浮培养细胞接种到添加了 2. Omg · L、，4-D、0. 5mg · I^BA、蔗糖30mg · L-1的30mL的LS培养液中。20d培养结束后收集细胞，测量细胞增长率和总黄酮含量。培养结果如表1所示，接种量对细胞收获后的总黄酮含量影响不大，最后均能达到5.0%左右。但对黄酮产量有一定的影响。悬浮培养中， 初始接种量的多少对细胞的生长有很大的影响。由表1可以看出，初始接种量在l_2g(每 30mL培养液)范围内，细胞增长率随接种量的增加而增加，在2g时达到最大值，而此时的悬浮细胞培养体系中颗粒均勻，颜色鲜艳，分散性好；如继续增加接种量，细胞鲜重和干重的增殖倍数呈下降趋势，悬浮培养液也变的混浊，镜检时发现许多细胞内含物较少，空细胞很多，且瓶壁上聚集了很多的衰败细胞，所以悬浮细胞系在继代培养过程中，初始接种量以每 30mL的液体培养基加入2g左右的培养物为宜。表1接种量对淫羊藿悬浮培养细胞生长和黄酮合成的影响
接种量)细胞增长率(％)总黄酮含量(％)
1163.85.0372200.45.0793151.05.1344102.04.9822. 2激素配比对淫羊藿细胞生长和总黄酮含量的影响以LS为基本培养基，蔗糖30g · ΙΛ以0. 01wt% HCL和0. 01wt% NaOH调节pH值至5. 8，接种量为每瓶2g。2，4-D分别取0，1. 0，2. 0，3. 0 (mg -L"1)，4个水平，6-BA分别取0， 0. 2,0. 4,0. 5 (mg · L—1) 4个水平。进行2因素4水平16处理的试验。结果如表2所示表2激素配比对细胞生长的影响
权利要求
1.一种巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系，其特征是，该体系是以&培养基为基本培养基， 附加 1. Omg · L-1 2，4-D，0. 2mg · L4BA，蔗糖 30_50mg · Λ 调节 ρΗ 值在 5. 8，于 121 °C高压灭菌15-20分钟配制成的生长培养基。
2.如权利要求1所述的巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系，其特征在于该体系是以&培养基为基本培养基，附加1. Omg .L—1 2，4-D，0. 2mg ·Ι^ΒΑ，蔗糖40mg · Λ调节ρΗ值在5. 8， 于121°C高压灭菌15-20分钟配制成的生长培养基。
3.如权利要求1或2所述的一种巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系的建立方法、其特征在于，该悬浮细胞培养体系采用正交试验和单因素试验，研究接种量、激素配比、糖浓度、培养基种类对细胞生长及黄酮含量的影响基础上而建立。
4.一种巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系悬浮培养巫山淫羊藿愈伤组织细胞的方法，其特征在于，方法步骤为1)、从巫山淫羊藿幼嫩叶片诱导得到的愈伤组织，经过继代培养反复筛选后选取生长均一，质地疏松，分散性好的愈伤组织作接种材料；2)、在愈伤组织接种继代16天后，接种在培养液中进行振荡培养，在120rpm，M±2°C， 光照12h · Cf1培养，培养液采用同继代愈伤组织的培养基相同的激素和蔗糖浓度配比，LS 培养基+2，4-D2. Omg · L^+O. 5mg · Ll-BA+蔗糖30g · L—1，只是不加琼脂，培养瓶采用IOOmL 的三角瓶；3)、每瓶中加培养液30mL，初始接种量在l_2g范围内，悬浮培养初期IOd天后用120目的不锈钢筛对培养物进行过滤，以除去大细胞团，保留分散程度好的小细胞团及单细胞；4)、初期每半个月换培养液1次，每次换培养液时先将培养物静置，倒去上层2/3培养液，保留1/3原液，加入2/3新液，从悬浮培养初期半个月继代1次，逐步缩短为一周继代1 次，这样通过3-4次继代培养，即得到只含单细胞或小细胞团的培养物，将这些细胞混勻， 得到悬浮培养细胞；5)、将得到的悬浮培养细胞的培养物在培养6d天后，用400目不锈钢筛网过滤收集细胞，然后称量一定数量的细胞接种到分装有30mL液体培养基的IOOmL三角瓶中进行培养， 所述的液体培养基是以&培养基为基本培养基，附加1. Omg · Γ1 2，4-D，0. 2mg · I^1BA,蔗糖30-50mg · ΙΛ调节ρΗ值在5. 8，于121°C高压灭菌15-20分钟配制成的生长培养基，每瓶接种继代培养6d后的经400目无菌不锈钢筛网过滤的2g巫山淫羊藿鲜细胞，在120rpm， M±2°C，每天光照12h培养；6)、培养后，每3d取5瓶细胞培养物测定其PCV，再用400目不锈钢筛网过滤，洗涤，称量其鲜重，再60°C烘干至恒重称量得干重。
5.如权利要求4所述的用巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系悬浮培养巫山淫羊藿愈伤组织细胞的方法，其特征在于，步骤幻中所述的液体培养基是以&培养基为基本培养基，附加 l.Omg .Γ1 2，4-D，0. ang.I^BA，蔗糖 40π^· Λ 调节 ρΗ 值在 5. 8，于 121 °C 高压灭菌 15-20分钟配制成的生长培养基。
全文摘要
本发明公开了一种巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系及其建立方法和应用。本发明采用正交试验和单因素试验，研究接种量、激素配比、糖浓度、培养基种类对细胞生长及黄酮含量的影响。利用松脆的胚性愈伤组织，可以很容易的建立起理想的巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系。巫山淫羊藿愈伤组织细胞悬浮培养在B5基本培养基中并附加1.0mg·L-12，4-D和0.2mg·L-1BA，蔗糖浓度30-50g·L-1，接种量为鲜重2g每30mL，这样建立起的悬浮细胞培养体系能获得高产黄酮。
文档编号C12N5/04GK102250827SQ20111020591
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月22日 优先权日2010年10月13日
发明者权秋梅, 韩素菊, 黎云祥 申请人:黎云祥