用于神经细胞的负链rna病毒载体的制作方法

专利名称：用于神经细胞的负链rna病毒载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用病毒载体，更具体地说，是用一种负链RNA病毒载体转移基因的方法，此方法可用于神经细胞的基因治疗。
目前基因治疗中普遍应用的病毒载体包括反转录病毒载体，单纯疱疹病毒载体(HSV)，腺病毒载体，腺病毒相关病毒(AAV)载体，等等。特别是，随着应用核磁共振成像(MRI)和正电子发射断层扫描术(PET)分析脑功能的新进展，对既能有效感染非分离神经细胞又能调节被感染细胞内转基因高水平表达的载体的需要不断增加。因此，腺病毒载体，单纯疱疹病毒载体，AAV,HIV等相当受重视。
尽管曾报导HSV能够将一段基因转移至外周神经系统的神经节，但仍存在其表达量的问题(基因治疗，1995,2:209-217)。HIV感染神经细胞也已得到证实(自然生物技术，1997,15:871-875)。因为HIV基因组插入染色体的位置难以预测，所以有可能破坏正常基因，激活癌基因，以及使目的基因过度表达或表达抑制。
AAV已经用于帕金森氏病的脑部治疗(实验神经病学，1997,144:147-156)和粘多糖病Ⅶ型的脑部治疗(ASGT meenting,1998，摘要号692)。然而，有报导帕金森氏病中导入塞酶林神经节的基因转移不完全，其粘多糖病Ⅶ型的脑内表达不足。
目前腺病毒的应用最为普遍，有报导它能向海马锥体细胞层转移基因(自然医药(Nature Medicine),1997,3:997-1004)。但腺病毒有其缺陷，如细胞毒性和强免疫原性。
另一方面，由于负链RNA病毒，如仙台病毒(此后简写作SeV)，不与染色体整合，因此不会激活癌基因。而且，因SeV是一种RNA病毒，所以它有许多优点，例如感染后短时间内表达蛋白质以及与腺病毒相比转基因产物能更高水平地表达。
本发明者首先用SeV制备了携带多种外源基因的重组体病毒，SeV是一种典型的负链RNA病毒，由于其安全、方便而适用于做基因治疗的载体。随后，将这些重组体用于向神经细胞、脑组织等转移外源基因。结果，发明者们发现这些重组体的应用使外源基因有效地向神经细胞和脑组织中转移，而且，他们发现本项发明中的病毒载体的应用致使导入的外源基因高效表达。
此外，转移入脑的本项发明的病毒载体呈现有限的增殖。换言之，在外源基因表达一定时期后载体的表达降低了。而且，应用本发明中病毒载体的基因治疗被用于β-葡萄糖醛酸酶缺陷型小鼠脑组织，并改善了该小鼠的症状。因此，本发明者们发现，所制备的病毒载体在那些治疗时需要对转基因表达进行调节的神经病的基因治疗中能有效发挥功能。
在沙土鼠或小鼠脑室内给予携带FGF基因的本发明病毒载体导致载体感染室管膜细胞，降低了动物的食物摄入和体重。室管膜细胞形成细胞层，把脑组织与脑室分隔开，但在第三脑室脑脊液与下丘脑核紧密相互作用。既然本发明中的载体能有效感染室管膜细胞，可利用这些载体在脑室内表达分泌蛋白，使这些蛋白作用于下丘脑核(摄食中枢、饱中枢等等)。此外，在沙土鼠的缺血模型上，已发现导入一种在海马实质细胞内表达生长因子的病毒载体使细胞损伤明显减少，这说明了本发明中的病毒载体在防止脑缺血中细胞脱落引起细胞死亡方面的用途。这些事实已经说明本发明中的载体在多种临床治疗中用作向脑内转移基因的载体是实用的。
本项发明涉及(1)一种向神经细胞转移核酸的方法，包括使神经细胞与负链RNA病毒载体或包含该载体的细胞相接触的步骤；(2)(1)中的方法，其中所述神经细胞为中枢神经系统细胞；(3)(2)中的方法，其中所述的中枢神经系统细胞为脑室的室管膜细胞；(4)(2)中的方法，其中所述的中枢神经系统细胞为海马细胞；(5)(1)至(4)中的任一种方法，其中负链RNA病毒载体所含的核酸包含外源基因；(6)(5)中的方法，还可使所述外源基因短暂表达；(7)(5)中的方法，其中所述的外源基因编码一种分泌蛋白；(8)(7)中的方法，其中所述蛋白质作用于下丘脑神经核；(9)(7)中的方法，其中所述蛋白质能够保护脑组织不被缺血损伤；(10)(5)中的方法，其中所述外源基因选自FGF-1,FGF-5,NGF,CNTF,BDNF,GDNF,p35,CrmA,ILP,bcl-2和ORF 150；(11)一种控制动物摄食行为的方法，此方法包括施予动物负链RNA病毒载体，此载体包含FGF-1或FGF-5作为外源基因；(12)一种控制动物血糖水平的方法，此方法包括施予动物负链RNA病毒载体，此载体包含FGF-1或FGF-5作为外源基因；(13)(1)至(12)中的任一种方法，其中所述负链RNA病毒属于副粘液病毒科；(14)(13)中的方法，其中所述属于副粘液病毒科的病毒是仙台病毒；和(15)一种负链RNA病毒载体，其通过应用(1)至(14)中的任一种方法用于向神经细胞内转移核酸。
在此项发明中，“负链RNA病毒载体”包括一个复合体，此复合体由负链RNA病毒衍生并具有传染力。这里，“传染力”意思是“复合体将其核酸或其所包含的其他物质通过它与细胞膜粘附和融合的能力而转移入细胞的能力”。
在此项发明中，负链RNA病毒载体可通过，例如，以负链RNA病毒作为起始物质而制备。用作起始物质的病毒如，属于副粘液病毒科的如SeV，新城疫病毒，流行性腮腺炎病毒，麻疹病毒，RS病毒(呼吸道合胞病毒)，牛瘟病毒和犬瘟病毒；属于正粘液病毒科的如流感病毒，属于弹状病毒的如水疱性口炎病毒和狂犬病病毒；等等。
当应用SeV时，由NP,P/C和L三种基因编码的一组蛋白质，被认为是病毒自主复制必要的，它们不必依靠本发明中的病毒载体对其编码。例如，本发明中的载体能够在携带这组蛋白质基因的宿主细胞中增殖，因此这些蛋白质可由宿主细胞提供。此外，这些蛋白质的氨基酸序列与病毒的天然氨基酸序列不必完全相同。任何突变均可被导入，或者用其他病毒的同源基因置换，只要它们的核酸转移活性相同于或强于那些天然蛋白质的。
而且，当应用SeV时，由M、F和HN基因编码的一组蛋白质，被认为对病毒的传播能力是必要的，它们不必依靠本发明中的病毒载体对其进行编码。例如，本发明中的载体能够在携带这组蛋白质基因的宿主细胞中生成，因此这些蛋白质可由宿主细胞提供。此外，这些蛋白质的氨基酸序列与病毒的天然氨基酸序列不必完全相同。任何突变均可被导入，或者用其他病毒的同源基因置换，只要它们的核酸转移活性等同于或强于那些天然蛋白质的。
为向神经细胞内转移外源基因，要制备和应用一种复合体，它包含插入了外源基因的重组病毒基因组。此包含重组病毒基因组的复合体可在体外或体内通过转录修饰过的cDNA而获得，此cDNA源于前面提到的任意一种病毒或其重组病毒，然后重构该病毒。重构病毒的方法已经被开发(见WO97/16539)。
此外，除了完整的SeV基因组，不完整的病毒如缺损干扰颗粒(DI颗粒)(病毒学杂志68,8413-8417,1994)，合成的寡核苷酸等等也可以用做组建复合体的成分。
当用SeV做原料时，复合体可能包含全部三种基因，M、F和HN，它们与病毒的传播能力关系密切。但是，一般来说，即使包含全部M、F和HN基因的复合体转移入脑，在病毒颗粒形成后复合体可能仍不会显示传播能力，因为缺乏蛋白酶水解对SeV传播能力必需的F蛋白。这里，“传播能力”意思是“核酸通过感染或用人工技术转移入细胞后可以复制并指导形成传染性颗粒或它们的能把核酸播散给其他细胞的等价复合体”。然而，为增加安全性，最好消除涉及病毒传播能力的基因或使之在复合体病毒基因组内功能失活。就SeV来说，涉及病毒传播能力的基因是M,F和/或HN基因。这类复合体的重构系统已被开发(WO 97/16538)。例如，对于SeV，包含删除了F和/或HN基因的基因组的病毒载体可由包含于重构复合体中的病毒基因组制备。这类载体也包括在本发明中向神经细胞转移核酸的载体之中。
复合体可能在其包膜外表面包含能粘附某特殊细胞的因子，如粘附因子，配体，受体等等。例如，负链RNA病毒重组体的部分基因可被修饰使有关免疫原性的基因失活或增强RNA转录和复制效率。
复合体中包含的RNA可在其适当位置掺入外源基因。为表达目的蛋白质，将编码此蛋白质的外源基因掺入RNA中。对于SeV的RNA，由六的倍数个核苷酸组成的核苷酸序列被如愿地插入R1和R2序列中间(病毒学杂志，1993,67卷，第8期，4822-4830页)。插入RNA中的外源基因的表达可由基因插入位置来调节或由插入基因附近的RNA序列调节。例如，就SeV的RNA来说，众所周知，基因插入RNA的位置越靠近NP基因，则插入基因的表达水平越高。
复合体中RNA编码的外源基因可通过随复合体感染细胞而表达。如后面实施例中所示，本发明一个实施方案中用SeV重构系统制备的复合体已被证明能够将外源基因有效地转移入各种神经细胞株。如实施例5中所示，现已揭示，与反转录病毒载体相比，用β-葡萄糖醛酸酶基因作为外源基因的本发明中复合体在另一实施方案中显示出更高的表达水平。由于这些特点，本发明中的复合体可用于向神经细胞转移基因。如实施例6中本发明中复合体的一个实施方案所示，在脑室内给药后一周左右复合体表达下降，所以这在仅需要有限时间内基因表达的基因治疗中很有用。
复合体包含的核酸或其他混合物可通过复合体与神经细胞直接接触而导入神经细胞，或通过使产生病毒载体的细胞与神经细胞接触而导入。复合体脑中给药时，可通过，例如，麻醉状态下颅骨切开术后在颅骨上钻一个洞，随后用玻璃针或其他类似物注入复合体而给药。复合体可以包含外源基因。外源基因可以包括任何类型的基因，诸如神经细胞特有的基因，凋亡抑制基因，治疗各种疾病的其他基因，等等，这些基因可采用反义DNA和核酶形式以抑制某特殊基因的功能。
例如，现已发现缺血组织的脑细胞死亡不是在缺血后马上发生，而是在缺血后的几天里发生(神经科学通讯，1998,240:69-72)。为防止这种情况下的脑细胞死亡，可应用本发明中包含抑制细胞死亡的基因，如bcl-2等的复合体。实际上，在研究给予本发明中的载体是否能延缓缺血引起营养耗竭导致脆弱的神经细胞脱落过程中，发现给予FGF-1表达载体能够明显阻止细胞脱落(实施例10)。此外，如实施例6和8所示，本发明的复合体能经脑室内给药将外源基因转移入室管膜细胞和脑室旁的细胞。用表达分泌蛋白的基因作外源基因可以通过脑脊液把蛋白质扩散至脑组织包括海马区域。如实施例7所示，通过把本发明中的载体施给海马锥体细胞，也有可能在这些细胞内表达外源基因。如实施例6和7所示，本发明一个实施方案中复合体在给入脑内甚至13天后还在海马神经细胞内表达，复合体的转移没引起严重的细胞脱落。这些结果显示了本发明中的复合体在中枢神经系统基因治疗中的有用之处。例如，在实施例9中，证明脑室内给予FGF表达载体能成功控制摄入食物的量和降低体重。体重的下降归因于FGF-2(Denton.D.A.等(1995)行为生理学，57(4):747-752)，伴随体重下降的血糖水平降低也有报导(Stephens,T.W.等(1995)自然377(6549):430-532)，这和本发明中获得的血糖水平降低伴有体重下降的结果相一致。
因此，本发明中的载体提供了以室管膜细胞为靶目标施给载体的一种新颖方式。除室管膜细胞外，靶细胞包括，但不局限于，脑室侧的细胞，海马区域的细胞，尤其是海马锥体细胞，神经干细胞，从哺乳动物胚胎中衍生的神经嵴细胞。能被导入的基因包括，但不局限于，成纤维细胞生长因子、神经生长因子、凋亡抑制因子、热休克蛋白、过氧化物酶的基因，等等。这些基因详细的实例包括编码以下因子的基因，FGF-1(生物学和化学杂志(J.Biol.Chem) 271(47):30263-30271,1996),FGF-5(美国国家科学院学报，87(20):8022-8026,1990),NGF(自然，302(2):538-540,1983),CNTF(自然，357(6):502-504,1992),BDNF(欧洲分子生物学组织杂志，9(8):2459-2464,1990；Genomics,10(3):558-568,1991),GDNF(神经科学研究杂志，41(2):279-290,1995),p35(病毒学杂志，61(7):2264-2272,1987),CrmA(美国国家科学院学报，83:7698-7702,1986),ILP(欧洲分子生物学组织杂志，15(11):2685-2694,1996),bcl-2(癌基因，4(11):1331-6,1989),ORP 150(生物化学和生物物理学研究通讯，230(1):94-99,1997)，等等。本发明中的载体不仅适用于用DNA芯片和DNA阵列寻找基因，而且适用于方便地制备小鼠模型和开发药物。
可导入本发明中载体的动物包括所有哺乳动物，例如人类，沙土鼠、小鼠、大鼠，家兔、牛、猴等等。


图1以图解方式表示建立包含外源基因如GFP或β-葡萄糖醛酸酶基因并有复制能力的SeV的方法。用含有NotⅠ位点的引物1和包括转录终止信号(R2)，间插序列(IG)，转录起始因子序列(R1)和NotⅠ位点的引物2，经PCR扩增外源基因的开放读码框架，并插入pUC18/T7HVJRz.DNA(+18)的NotⅠ位点。
图2是小鼠脑额面剖视图，显示感染了包含GFP基因的SeV载体(GFP/SeV)的小鼠中GFP的表达。
图3是侧脑室剖视图，显示携带β-葡萄糖醛酸酶基因的SeV载体感染3天后β-葡萄糖醛酸酶缺陷型小鼠体内β-葡萄糖醛酸酶的表达。
图4A是侧脑室剖视图，显示携带β-葡萄糖醛酸酶基因的SeV载体感染12天后，β-葡萄糖醛酸酶缺陷型小鼠体内β-葡萄糖醛酸酶的表达(框内区域)。图4B显示了Lorbacher法染色的图4A邻近区域。
图5是一幅曲线图，显示脑室内给予表达FGF-1,FGF-5和GFP的SeV后沙土鼠体重变化。
图6是一幅曲线图，显示脑室内给予表达FGF-1,FGF-5和GFP的SeV后小鼠体重变化。
图7是一幅曲线图，显示脑室内给予表达FGF-1,FGF-5和GFP的SeV后小鼠食物摄入量的变化。
图8是显微照片，显示缺血5天后沙土鼠海马CA1区锥体细胞的迟发型脱落。
图9是显微照片，显示给予表达FGF-1的SeV载体后海马CA1区锥体细胞的迟发型脱落被阻止。
在确立细胞系时应用了大鼠嗜铬细胞瘤(phenochromocytoma)(PC12)，人成神经细胞瘤(IMR-32)和人成胶质细胞瘤细胞(A172)。PC12细胞用加了终浓度均为5％的马血清和小牛血清的DMEM培养基培养。为促进轴突长出，向培养基中加入终浓度50ng/ml的神经生长因子(NGF 7S)。向含10％小牛血清的MEM培养基中加入MEM丙酮酸钠溶液和MEM非必需氨基酸溶液至终浓度分别为1mM和0.1mM，将其用于培养人成神经细胞瘤细胞(IMR-32)。人成胶质细胞瘤细胞(A172)用含10％小牛血清的MEM培养基(高葡萄糖培养基)培养。
将105细胞平铺于6厘米的平皿中含有NGF的培养基中，孵育3天以诱导轴突长出，然后用于PC12细胞感染实验。弃去培养基，细胞用PBS冲洗一次。将导入了GFP基因的SeV(此后称作GFP/SeV载体)用添加了1％牛血清白蛋白的500μlPBS稀释至噬斑形成单位(p.f.u)为106，将其加入细胞中使感染GFP/SeV载体，在防止细胞干燥的条件下感染20分钟。感染后，向平皿中加入培养基(5ml)，将细胞培养2天。之后，在荧光立体显微镜下检测细胞的GFP荧光，结果是，PC12细胞内有GFP荧光的被确认是感染了GFP/SeV载体。被不含GFP基因的SeV感染的对照组细胞或未感染的细胞观察不到荧光发散。
将IMR-32细胞(3×105细胞)平铺于含有预定培养基的10cm平皿中培养过夜。当培养至细胞数约6×105后，GFP/SeV载体用1000μl含1％牛血清白蛋白的PBS稀释至m.o.i(感染复数)为10。细胞被病毒感染20分钟后，培养于预先决定的培养基上12或36小时，然后于荧光立体显微镜下检测GFP荧光。培养12小时后，可于GFP/SeV感染的细胞体中观察到荧光。培养36小时后，除细胞体外于轴突部分也可观察到荧光。在感染未携带GFP基因的SeV的对照组细胞及未感染的细胞中均未见荧光。
将A172细胞用同于IMR-32细胞的方式感染了病毒，可于GFP/SeV感染的细胞胞体观察到荧光，但感染未携带GFP基因的SeV的对照组细胞及未感染细胞未见荧光。
GFP/SeV感染了在本研究中用到的所有已确立的神经细胞株，并在这些细胞内由GFP基因成功地表达了GFP。这些结果意味着SeV可感染原代培养的脑细胞和体内病毒感染的脑细胞。实施例3原代大鼠脑细胞的培养怀孕18天的SD大鼠用二乙醚深麻醉并从腋窝动脉放血致死。腹部用95％乙醇消毒后，行剖腹术取出胎鼠连同子宫。如无另外说明，以下步骤均在冰上或冰冻溶液中无菌条件下进行。用剪刀和圆头镊从子宫中取出胎鼠，转移到装有20ml手术溶液(50％DMEM和50％PBS)的平盘中。将胎鼠放于无菌纱布垫上，用两把INOX4号镊沿中线切开头皮及头盖骨。随之，沿脑组织内侧插入一把INOX7号镊，以便切断延髓将脑组织整个用杓取出，把脑组织切下放于手术液中。在立体显微镜下，用两把手术刀分离脑干，将脑组织切成三部分，包括海马和纹状体的两片大脑半球用圆头镊转移入另一手术液中。在立体显微镜下，用两把INOX5号镊将脑膜从脑组织表面完全剥去，并用圆头镊转移到另一手术液中中洗。六片大脑半球切片用圆头镊放入防腐液中(90％DMEM(包含5％马血清和5％小牛血清)和10％DMSO)，然后用手术刀将其在载玻片上切成小于1mm的小块。切好的组织碎片放入装有约1.5ml于冷冻容器内预冷的防腐液试管中，缓慢冷冻3小时以上，然后贮存于液氮中。六片大脑半球的组织碎片从液氮中取出，于32℃解冻，用8ml手术液中洗2次，静置30秒，弃去上清。向组织碎片中加入5ml冰冻的木瓜蛋白酶溶液(木瓜蛋白酶1.5单位，半胱氨酸0.2mg，牛血清白蛋白0.2mg，葡萄糖5mg，和DNA酶0.1mg/ml)，此溶液已经过滤和除菌。将此混合物于32℃温育15分钟且每5分钟倒转试管一次使之混合。分离出上清液，加入5ml含20％小牛血清的溶液。将预热至32℃的木瓜蛋白酶溶液(5ml)加入沉淀级分中，并将此混合物继续温育15分钟。每5分钟倒转试管将此混合物混合一次。当确认上清液浊度较好且组织碎片半透明后，用移液管移液将组织碎片分离。第一上清级分预热至32℃，加入同样溶液，所得混合物在预热至32℃的离心机上离心(1200rpm/分，5分钟)。弃去上清，加入5mlDMEM(包含5％马血清和5％小牛血清)与沉淀混合以破碎细胞，随后用上述条件离心。弃去上清，向沉淀中加入2ml DEME(包含5％马血清和5％小牛血清)，并将所得混合物搅拌。细胞计数结果，发现细胞数为5×106个/ml。将如此获得的原代培养的脑细胞种植于聚乙烯亚胺包被的平皿中培养。实施例4用GFP/SeV载体确认SeV对原代培养脑细胞的感染力实施例3中获得的原代培养脑细胞在10厘米平皿中培养3天。弃去上清液，用1000μl含1％牛血清白蛋白的PBS稀释GFP/SeV载体以制备样品溶液，并将之加入培养物中使培养物被病毒感染20分钟。随后，加入10mlDMEM培养基(包含5％马血清和5％小牛血清)，再把细胞培养2天。然后在荧光立体显微镜下检测细胞的GFP荧光。几乎所有细胞都显示荧光，这就是说，可以确定SeV感染了原代培养的脑细胞。实施例5携带β-葡萄糖醛酸酶基因的SeV载体(此后简写作β-glu/SeV)感染β-葡萄糖醛酸酶基因缺陷型人类成纤维细胞，并在此细胞内表达该酶为完成本项发明，应用了缺乏β-葡萄糖醛酸酶基因的人类成纤维细胞(此后简写作β-glu缺陷型细胞)和正常人类成纤维细胞。
粘多糖病Ⅶ型，是粘多糖病的一种类型，由β-葡萄糖醛酸酶缺乏引起，表现出从轻症病例到有致命的积水(hydrops)的严重病例的各种临床症状。许多严重病例在婴儿期表现出各种发展症状，包括特殊面容，肝脾肿大，精神运动性阻滞，骨畸形，等等。
现已发现，酶分子添加糖链和酶的甘露糖部分的6-位磷酸化对于胞内β-葡萄糖醛酸酶向溶酶体转运是必需的，到达溶酶体后，酶的c-末端发生蛋白水解反应。
实施本发明之前，检测β-glu/SeV载体以下几个方面，1)对人成纤维细胞的感染力，2)它的表达量，和3)转运至溶酶体的分子类型。
1)制备β-glu缺陷型成纤维细胞，使六孔板每孔105细胞。β-glu/SeV载体用含1％牛血清白蛋白的PBS 100μl稀释，以使感染复数(m.o.i)成为5，并对已过夜培养的β-glu缺陷型细胞感染1小时。细胞在无血清MEM培养基上培养24小时。将此培养细胞用福尔马林和丙酮的混合液(1∶7,v/v)固定。以萘酚AS-BI葡糖苷酸作为底物，反应在丙酮缓冲液pH5.0,37℃中进行，底物分解用着红色来监视。结果，与“β-glu/SeV”一起孵育的β-glu缺陷型细胞的胞质被染成红色，说明这些β-glu缺陷型细胞被表达转移基因的“β-glu/SeV”所感染。2)制备β-glu缺陷型成纤维细胞，使六孔板每孔105细胞。β-glu/SeV载体用含1％牛血清白蛋白的PBS 100μl稀释，以使感染复数(m.o.i)成为0.1和1.0，并与已过夜培养的β-glu缺陷型细胞孵育1小时，细胞在无血清MEM培养基上培养24小时。细胞孵育预定的一段时间，重新收集并经超声处理以制备胞内成分。以4-甲基伞形基(methylumbelliferyl)-β-D-葡糖苷酸为底物，酶促反应产物4-甲基伞形酮(MU)的量通过荧光分光光度计检测荧光强度来判断。结果见表1。在此表中，表达量用胞内组分中1mg蛋白质1小时产生的4-甲基伞形酮(MU)的量代表。
表1

如表1所示，表达量在15,900-32,300(nmol MU/mg总蛋白/h)之间变化，正常成纤维细胞为276，用反转录病毒表达β-葡萄糖醛酸酶(β-glu/retro)的细胞为911，说明SeV在其感染的细胞内强烈地表达转基因。
3)2)中所得成分用作“β-glu/SeV”感染的β-葡糖醛酸酶缺陷型成纤维细胞的胞内成分。分离培养上清，其中的蛋白质用冷丙酮离心收集。把如此获得的实验样品用抗人β-葡萄糖醛酸酶抗体进行Western杂交分析。结果，在“β-glu/SeV”-感染的β葡萄糖醛酸酶缺乏的成纤维细胞胞内成分中，鉴定出两类蛋白质，一类为高分子量，另一类为低分子量，两者均与抗人β-葡萄糖醛酸酶抗体反应。低分子量蛋白质的杂交带与正常成纤维细胞内与抗人β-葡萄糖醛酸酶抗体反应的蛋白质的杂交带相一致，说明这类β-葡萄糖醛酸酶分子的C-末端在转运至溶酶体后经历了蛋白水解。高分子量蛋白质未见于正常成纤维细胞，但存在于β-glu/SeV-感染的β-葡萄糖醛酸酶缺陷型成纤维细胞的胞内成分及上清成分内。上清液部分只包含高分子量蛋白质，这可能是由于β-glu/SeV载体感染所致β-葡萄糖醛酸酶的过高表达，使高分子量蛋白质向溶酶体的转运跟不上酶的如此高表达，导致这种蛋白质向微粒体或细胞外空间的分泌。另一种可能，从其分子量判断，该高分子量蛋白质可能是一种有糖链附着，但无甘露糖部分的6-位磷酸化的分子类型，所以无法向溶酶体转运。
因此，推测被转运至溶酶体的人类β-葡萄糖醛酸酶能够在β-glu/SeV-感染的β-葡萄糖醛酸酶缺陷型成纤维细胞的胞内部分表达。实施例6通过GFP/SeV的脑室内给药使GFP在室管膜细胞内表达将8-10周龄的小鼠用稀释10倍的戊巴比妥200μl麻醉。行颅骨切开术后，在头颅骨上距前囟1.0mm且距中线向右1.5mm的位置用牙科钻钻一直径1mm的洞。剥去硬脑膜，用27G注射器针头在该位置1.3mm深处注入GFP/SeV载体。GFP/SeV载体的剂量为20-30μl，样品溶液中病毒数目大约1×107p.f.u-1.5×107p.f.u。对照小鼠给予PBS或不携带GFP基因的SeV。给药后3、5、7和10天进行尸体解剖。取出整个脑，做额状切面。在荧光立体显微镜下观察GFP荧光。给予GFP/SeV载体3天后尸检时解剖的脑中，观察到明显的GFP荧光。在额状切面上脑室侧的部位观察到明显不同的GFP荧光(图2)。如后面实施例8所述，发散GFP荧光的SeV感染细胞被认为是室管膜细胞。感染5和7天的沿侧脑室的细胞也成为荧光性的。然而，细胞内荧光强度在感染7天后明显降低，感染10天后未观察到有荧光的脑细胞。作为对照给予PBS或未携带GFP基因的SeV的对照组小鼠脑内未观察到荧光。实施例7在立体定位手术下向脑实质给入GFP/SeV载体为检测SeV对神经细胞，尤其是海马锥体细胞的感染(这也是本发明的主要目的)需要向海马附近精确地定位给予SeV。因此，立体定位手术被用于向脑实质导入SeV，并检测脑实质细胞感染。应用的实验动物有1)小鼠和2)大鼠。
1)用牙科钻在距前囟向后3mm，距中线2mm的左右侧分别钻直径1mm的两个洞。用玻璃毛细管将GFP/SeV载体(各1.5μl)给入脑实质部分，右侧3.5mm深，左侧2.5mm深，封闭头颅骨，于3天后行外科术打开以检测脑实质部分观察到的GFP表达。用乙醇固定后，制备冰冻组织切片。尽管乙醇固定后由于生色团流出而使冰冻切片上GFP荧光明显减弱，但发荧光的部位仍可观察到。在靠近内囊的白质中，髓鞘蛋白被乙醇洗脱后轴索上观察到GFP荧光，而且，在推测为纹状体区域的轴索中也观察到GFP荧光。
这些结果证明GFP/SeV载体能够感染小鼠脑神经细胞。
2)既然已经有为大鼠制作的精确立体照片，故GFP/SeV载体能准确地给入海马CA1区域锥体细胞附近。将重约170g的大鼠麻醉，颅骨切开术后，用牙科钻在头颅骨上internal(σ)后4.5mm，距中线2mm的左右各钻一直径1mm的洞。用玻璃毛细管向脑实质给入GFP/SeV载体(各1.5μl)，右侧给药深度3.5mm，左侧2.5mm深。封闭头颅骨，3天后行外科术打开以检测GFP表达。结果，在海马CA1锥体细胞区域观察到GFP表达，此处GFP/SeV载体给药深度2.5mm，用荧光显微镜放大海马邻近区域，发现在海马CA1区域锥体细胞胞体和轴突内有标记的荧光。甚至，给药后13天锥体细胞内仍可观察到GFP表达。甚至给予GFP/SeV后13天，在锥体细胞的胞体和树突内仍可观察到GFP表达。这些结果证明，SeV感染甚至在感染后13天也不会引起神经细胞死亡，有力说明SeV作为载体用在基因治疗时直接阻止脑缺血后脱落细胞死亡。实施例8用β-glu/SeV载体在β-葡萄糖醛酸酶缺陷型小鼠上的基因治疗试验实施例6的结果表明经脑室内给药使室管膜细胞感染了SeV。因此，发明者们做了一个实验，将β-glu/SeV载体施给β-葡萄糖醛酸酶缺陷型小鼠(J.Clin.Invest.1989,83:1258-1266)以诱导β-葡萄糖醛酸酶自感染的细胞向脑脊液中分泌，然后被靶细胞摄取因而症状将得到改善。
根据小鼠尾静脉中β-葡萄糖醛酸酶的活性和小鼠染色体上β-葡萄糖醛酸酶基因缺陷型位点的PCR扩增片段中NlaⅣ酶切位点的存在，从繁殖杂合子小鼠所得的鼠中挑选纯合子小鼠用于本实验。给予β-glu/SeV载体按照实例6中方法完成。给药后3或12天切下鼠脑，制备冰冻组织切片。组织中β-葡萄糖醛酸酶活性用实施例5中的方法略作修改来评价。如图3所示，脑室侧β-葡萄糖醛酸酶表达的部分被染上强烈的红色。经显微镜放大，证实侧脑室室管膜细胞强烈表达β-葡萄糖醛酸酶，此酶随之被细胞分泌。在给药后12天制备的组织切片上(图4)，显示已在侧脑室室管膜细胞内表达并随后被分泌的β-葡萄糖醛酸酶扩散入脑室，随脑脊液流动到达海马附近。纯合子小鼠的体质通过此种给药方式得到明显改善，尽管改善的较轻微。实施例9给予携带FGF-1或-5的SeV载体引起进食减少的实验(沙土鼠或小鼠进食减少的实验)将沙土鼠(体重60-80g)用戊巴比妥麻醉，固定于立体定位仪上，去毛，然后在头皮上沿中线切开。在颅骨上距前囟1.0mm，中线右侧1.5mm处用牙科钻钻一洞，并小心避免损伤颅骨下血管。于钻洞后，将硬脑膜等用镊子剥去。将小鼠FGF-1/SeV载体(5×106pfu)、人类FGF-5/SeV载体(1×107pfu)和GFP/SeV载体(5×106pfu)用一30G注射器针头于1.0mm深处注入右侧脑室(n=2)。重组体病毒按照实施例1制备。通过测量体重来监测体重变化，于给药后第2天开始观察到体重的下降(图5)。在FGF-1给予组，体重从给药后第2天开始下降，继之每天降低约5％直到5天后，6天后降低29.5％，于7天后观察到降低最大幅度29.8％。然后体重转而上升，给药20天后恢复至3.5％的降幅。在FGF-5给予组，体重从第2天开始下降，在给药5天后，达最大幅值21.7％，然后转为上升，第20天后恢复至8.0％的降幅。在FGF-9给予组，同样自第2天开始观察到体重下降，给药5天后出现最大降幅22.9％，然后转为上升，第20天恢复为6.40％的降幅。在给GFP/SeV的对照组，观察到体重最大降幅5.8％，推测由给药本身所引起，然而，体重下降速度与FGF给予组比较是相当小，明确说明FGF可影响体重降低。
由于在沙土鼠上观察到的体重降低归因于给予FGF-1/SeV载体和FGF-5/SeV载体，因而用B-6小鼠(体重约20-22g)作更详细研究。右侧侧脑室被选为给药部位，用牙科钻于头颅骨上距前囟1.0mm距中线向右1.5mm处钻一直径1.0mm洞。剥去硬脑膜后，用27G注射器针头将样品注入该洞内深1.3mm。样品溶液通过将9μl,8μl和9μl PBS分别加入到1μl FGF-1/SeV载体(1×106pfu)、2μl FGF-5/SeV(2×106pfu)和1μl GFP/SeV对照载体(1×106pfu)溶液中而制备。体重和食物摄入于给予病毒后监测2周。
给予GFP/SeV的对照小鼠未表现出体重下降，但与给药前相比体重升高7.5％(图6)。食物摄入量也未见明显改变(图7)，在FGF/SeV给药组，于给药后6天观察到体重平均下降30.5％(图6)。然后体重转而回升，结果于第2周后为降低13.5％，因FGF-1给药引起的食物摄入量的变化极富戏剧性，给药后第2天至第6天，尤其第3到6天几乎没有食物摄入(图7)。在FGF-5/SeV载体给药组，尽管也观察到体重下降，但与给予FGF-1/SeV组相比，体重降低百分率较小，最大降幅为17.9％(图6)。对体重降低的影响与用沙土鼠实验系统所获结果有相似趋势。尽管给予FGF-5/SeV载体对体重下降的影响小于给予FGF-1/SeV载体的影响，但明确观察到食物摄入减少(图7)。
如本实施例的结果所示，SeV载体诱导的FGF脑室内表达对体重降低的影响最大降幅达30％。考虑到脑室内注射提纯的FGF蛋白质对体重降低的影响至多7～8％，本发明中得到的30％的百分率显得非常高。这些作用的不同可能归因于不同给药方式所致FGF脑室内积累的不同，但还有另一种可能，即该不同是由于SeV载体感染室管膜细胞而使FGF对神经细胞的直接作用所致。至于脑内摄食中枢，仅报导了下丘脑神经核的控制。鉴于此点，推断SeV载体有效感染室管膜细胞使之向脑室内脑脊液中分泌功能蛋白，该分泌蛋白有效作用于下丘脑神经核使之发挥摄食控制功能。这种推理得到以下事实支持部分的下丘脑神经组织有一种失去了与血脑屏障之紧密联系的神经结构并包含接受外周循环和脑脊液中液体因子的神经元。
在下丘脑的核中，化学敏感性神经元存在于下丘脑腹内侧区(VMH)和下丘脑外侧区(LHA)(这些区域被认为是摄食中枢和饱中枢)，神经元针对血中和脑脊液中代谢产物和激素作出应答而改变活性。这些对血糖作出应答的VMH和LHA神经元，以及某些细胞因子和生长因子也被认为有食欲调节者功能。此外，损毁实验已证明，室旁核(PVN)也抑制食物的摄入。此核具有产生促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)，并显示进食减少作用和交感神经活性之激活作用的神经元。而且，弓状核(ARC)是产生NPY的部位，NPY为摄食刺激物，认为其靶向PVN。本文所述控制摄食行为的实验结果表明FGF作用于该神经核。还应注意与leptin的关系，leptin在有脂滴的成熟脂肪细胞内表达，象NPY等一样，其与进食行为的关系已被广泛研究。实施例10用沙土鼠进行的抑制缺血细胞脱落实验遭受脑缺血的区域经历细胞受损，并随缺血逐步严重而导致细胞死亡。细胞死亡的程度依赖于缺血的程度和持续时间。在严重缺血情况下，不仅神经细胞而且缺血区的所有组成细胞在短时间内遭受不可逆损伤，导致坏死引起的脑梗塞形成。然而，在持续时间很短的严重缺血应激反应情况下或长时间轻微缺血时，缺血区细胞依缺血严重程度而变得脆弱，最脆弱的细胞是神经细胞，其次是少突神经胶质细胞。已知星形神经胶质、小神经胶质和血管内皮细胞更能抵抗缺血应激。从对弥散的脑缺血模型实进行的检查中已知神经细胞中对缺血应激的抵抗力是有区别的。所知最脆弱细胞包括海马CA1区神经细胞，齿状回门的神经细胞和头部枕叶的前庭核，它们表现出延迟的细胞死亡。延迟的神经细胞死亡是选择性神经细胞死亡的良好模型，其高度再现性与能量不足无关，极有助于阐明缺血性细胞死亡的分子机制。已有许多报导用这些模型系统进行实验以检测，例如，神经细胞走向死亡有哪些级联反应，该级联反应中哪一步对保护细胞至关重要，延迟的神经细胞死亡可归类于哪种细胞死亡等等。
实验模型动物经常用大鼠、沙土鼠和小鼠。用这些动物对因该脑缺血模型动物整个脑部几分钟至几十分钟缺血导致的缺血敏感区，如海马，及纹状体等等的病理改变进行研究和治疗。大鼠四血管闭塞模型，大鼠低血压的双侧颈总动脉闭塞模型，沙土鼠双侧颈总动脉闭塞模型等是常用的缺血模型。本发明者们应用沙土鼠的双侧颈总动脉闭塞模型进行缺血实验。现已知道当沙土鼠遭受短时间(5分钟)缺血时，其细胞死亡主要发生于海马CA1区的多数锥体细胞，因此，本发明者进行了一项旨在防止缺血后细胞脱落的实验，其方法是在SeV中导入能阻止细胞死亡的基因并将该所得复合体施予沙土鼠的海马。<沙土鼠缺血性细胞死亡模型的制备>
实验用沙土鼠双侧颈总动脉闭塞(5分钟)模型来完成。经闭塞(5分钟)沙土鼠双侧颈总动脉，海马锥体细胞于闭塞后3-5天选择性脱落。然而，由于这种现象在沙土鼠中未能普遍观察到，因此有必要从商业来源获得的沙土鼠中筛选优秀的作为模型动物。经筛分挑选出的沙土鼠(得自Instructor Dr.Maeda，解剖学1系，Osaka City University)用于实验。
将动物用氯胺酮麻醉后，行胸部切开术找出气管左侧和右侧的颈总动脉，剥去附着于颈动脉上的脂肪。剥去脂肪后，用夹子夹闭颈动脉5分钟。在此过程中，由于当脑部温度和体温较低时，神经细胞死亡率明显下降，所以给动物保温以维持体温37.5℃，体温用插入肛门的温度计监测。5分钟后放开夹子，使血液再灌注。5天后，处死沙土鼠，颅骨切开术后，切下脑制备石蜡组织切片。神经细胞的情况经甲苯胺染色确定。如所期望，在海马CA-1区观察到锥体细胞的脱落(图8)。因此，沙土鼠的缺血细胞死亡模型已制备好。<通过导入重组SeV而阻止神经细胞死亡的实验>
按以下步骤将上述制备的SeV载体用于检测SeV载体对防止神经细胞死亡是否有效缺血前一天，将病毒仅导入沙土鼠右脑，第二天实施缺血，5-6天后处死动物来观察海马锥体细胞。<FGF-1/SeV向海马的转移>
挑选重60-80g的沙土鼠用于本实验。用氯胺酮麻醉后，将动物固定于立体定位仪上。然后脑部脱毛，沿脑的中线切开头皮。在距前囟5mm，中线右侧2mm处用牙科钻在头颅骨上钻一洞，并小心不要破坏颅骨下血管。钻洞后，用镊子剥开硬脑膜和其他组织。将给药用的玻璃针插入此部位1.4mm深，使动物站立2分钟。通过此玻璃针，在12分钟内向此处注射0.5-1.0μl的FGF-1/SeV载体溶液(1.0×106pfu载体到2.0×106pfu载体)，使动物再站立10分钟。移去针头，缝合切口。在此步骤中，病毒只给入右脑，缺血后神经细胞的脱落通过对比左、右脑来判定。<缺血的手术操作>
将动物用氯胺酮麻醉后，行胸廓切开术找出气管左侧和右侧的颈总动脉，剥去附着于颈动脉上的脂肪。剥去脂肪后，用夹子夹闭颈动脉5分钟。在此过程中，由于当脑部温度和体温较低时，神经细胞死亡率明显下降，所以给动物保温以维持体温37℃，体温用插入肛门的温度计监测。5分钟后放开夹子，使血液再灌注。5-6天后，处死动物。<石蜡切片的制备>
动物被处死后，制备厚30-500μm的后脑额状切面切片，浸泡于4％多聚甲醛中过夜，在用于固定和包埋的自动仪器上包埋于石蜡中。切片(5μm)经制备，脱蜡，用于免疫组化染色和其他染色。<免疫组化染色>
制备给予FGF-1的脑组织切片以检测对以下抗体的反应性抗病毒抗体，抗微管蛋白抗体(判断缺血手术的效果)，抗GFAP抗体(检测星形胶质细胞迁移)，凋亡标记抗体(检测细胞凋亡的存在)。结果简略归纳如下(表2)。
表2

在海马CA-1区锥体细胞内，对照样品未经受缺血，其神经细胞HE染色未发现任何变化。在大脑经受缺血但未给予病毒的一侧多数细胞是萎缩的神经细胞，呈现细胞核内的核浓缩和胞质内的嗜酸性改变，即所谓的缺血性变化。与此对照，在脑的经受缺血且给予病毒的另一侧观察到少数变形的神经细胞弥散分布，但大多数神经细胞保持原始形态。在给予病毒的一侧，观察到抗病毒抗体阳性区域，在经受缺血但未给予病毒的神经细胞中，绝大多数变形细胞是凋亡标记染色阳性。与之对照，在经受缺血且给予病毒的细胞中，只有HE染色并表现出形态变化的极少数细胞的凋亡标记染色阳性，说明这一侧大部分细胞的凋亡被抑制(图9)。
工业实用性本发明提供了一种向组织中神经细胞内转移基因的方法，所述组织包括中枢神经组织，向此处转移基因曾经是困难的。用本发明中的方法能够有效地转移目的基因进入基因治疗的细胞中，等等。
权利要求
1．一种向神经细胞转移核酸的方法，包括使神经细胞与负链RNA病毒载体或包含该载体的细胞相接触的步骤。
2．权利要求1的方法，其中所述神经细胞为中枢神经系统细胞。
3．权利要求2的方法，其中所述的中枢神经系统细胞为脑室的室管膜细胞。
4．权利要求2的方法，其中所述的中枢神经系统细胞为海马细胞。
5．权利要求1至4中任一项的方法，其中负链RNA病毒载体所含的核酸包含外源基因。
6．权利要求5的方法，还可使所述外源基因短暂表达。
7．权利要求5的方法，其中所述外源基因编码一种分泌蛋白。
8．权利要求7的方法，其中所述蛋白质作用于下丘脑神经核。
9．权利要求7的方法，其中所述蛋白质能够保护脑组织不被缺血损伤。
10．权利要求5的方法，其中所述外源基因选自FGF-1,FGF-5,NGF,CNTF,BDNF,GDNF,p35,CrmA,ILP,bcl-2和0RF 150。
11．一种控制动物摄食行为的方法，此方法包括施予动物负链RNA病毒载体，此载体包含FGF-1或FGF-5作为外源基因。
12．一种控制动物血糖水平的方法，此方法包括施予动物负链RNA病毒载体，此载体包含FGF-1或FGF-5作为外源基因。
13．权利要求1至12中任一项的方法，其中所述负链RNA病毒属于副粘液病毒科。
14．权利要求13的方法，其中所述属于副粘液病毒科的病毒是仙台病毒。
15．一种负链RNA病毒载体，其通过应用权利要求1至14中任一项的方法用于向神经细胞内转移核酸。
全文摘要
一种可向神经细胞内转移基因的负链RNA病毒载体,它使向神经细胞,包括向基因治疗中的中枢神经系统组织,等等内高效率转移基因成为可能。
文档编号A61K48/00GK1314949SQ99810224
公开日2001年9月26日 申请日期1999年7月1日 优先权日1998年7月3日
发明者福村正之, 长谷川护, 浅川诚 申请人:株式会社载体研究所