专利名称：一种木本植物花药培养胚状体的方法
技术领域：
本发明涉及一种木本植物花药培养胚状体的方法，具体地说，是通过花药培养技术获得胚状体的方法。
背景技术：
申请号02158575.X发明名称为“一种花药或花粉培养获得单倍体植株的方法”，公开了一种将花药直接接种于液体培养基中，进行花药漂浮培养。首先，该方法是针对所有植物的话，没有实用价值，因为对于花药花粉培养而言，植物种类不同，培养条件和培养方法决不相同，各种植物上得到的结果只对本植物有效。其次，它没有清楚说明是通过何种途径实现植株再分化。花药花粉培养实现植株再生的途径有两条，一是愈伤组织直接再分化形成芽；二是再分化形成胚状体，胚状体萌发成苗。最后，就花药花粉培养而言，获得的植株不一定就是单倍体，还存在一个筛选的过程。
枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)为蔷薇科(Rosaceae)枇杷属(Eriobotrya)植物，别名卢橘，是我国亚热带地区的珍稀特产水果。果实的成熟期一般在4～6月，正值水果淡季，果实色泽美观、果肉鲜美可口，深受消费者的喜爱，市售价格较高；据刘国强等统计，我国枇杷约有14个种，600多个品种。目前，我国枇杷的品种选育途径有以下几种(1)实生选种。如由龙泉驿区林业局选育出的特晚熟枇杷新品种“红灯笼”；福建省果树研究所选育出的高产、早熟新品种“长红3号”；少核、可食率高的“太城4号”；江西科委选育出的抗寒优质品种“杨梅洲四号”；江苏吴县果树研究所选出的果大、质优的白沙枇杷“冠玉”等。(2)杂交育种。如由福建省农科院果树研究所以大果型“解放钟”为父本，“香甜”为母本杂交育成的“香钟11号”；以解放钟为母本，早熟日本枇杷“森尾早生”作父本杂交育成的“早钟6号”。(3)引种。我国从日本引进的枇杷品种有“瑞穗”、“茂木”、“森尾早生”、“田中”、“户越”等，最近又从西班牙引进一些新的品种，这些品种的引进丰富了我国枇杷的种质资源，为培育新的品种奠定了基础。(4)生物技术育种。由于枇杷童期长，常规育种难度大，通过生物技术育种可以加速育种进程。万志刚等对白沙枇杷“冠玉”的茎尖培养、孔素萍等对“大五星”枇杷的胚培养都加快了良种繁育速度；彭晓军、陈振光、林顺权等通过对枇杷胚乳的离体培养试验，获得了再生植株；林庆良、林顺权、陈发兴等进行的枇杷原生质体培养，为通过原生质体融合技术培育枇杷新品种奠定了基础；(5)其它育种途径。如黄金松等利用秋水仙素作为诱变剂获得了四倍体枇杷“闽三号”；李孙逵、郑少泉等用60Co-γ射线辐射源分别处理了枇杷种子和枝条，有利的变异主要是少核、高可溶性固形物、细肉质、丰产和短枝等类型，几率为0.48％，同时可提早结实。
但是由于枇杷的特殊习性，属多年生木本果树，有较长的营养生长时期，少则数年，多则数十年，然后才能生殖繁衍，这就使得按常规杂交育种方法进行枇杷育种周期长，且效率低，需要一种新的育种方法改变目前的现状。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种木本植物花药培养胚状体的方法，本发明的另一技术方案是提供了采用该方法获得的木本植物的胚状体。
本发明提供了一种木本植物花药培养胚状体的方法，它是取木本植物花药内的花粉小孢子的发育处于单核晚期，在无菌条件下，接种于愈伤细胞诱导培养基，以分化形成胚状体。
进一步地，所述的木本植物是枇杷属植物。
更进一步地，所述的木本植物是枇杷Eriobotrya japonica Lindl.。
其中，所述的枇杷花药胚状体的制备方法包括如下步骤a、取处于单核早期到单核晚期小孢子的枇杷花蕾，低温处理，刮去表面绒毛，清洗、消毒灭菌；b、从a步骤中消毒灭菌后的花蕾中取出花药，在无菌条件下接种于愈伤组织诱导培养基，在23±1℃黑暗条件下诱导枇杷花药脱分化形成愈伤组织；c、取b步骤的愈伤组织，接种于胚状体诱导培养基，愈伤组织再分化，形成胚性愈伤组织；d、再按c步骤方式培养，胚性愈伤组织再分化形成本发明胚状体。
其中，a步骤所述的低温处理为4℃黑暗条件下低温处理48小时。温度必须保持4℃恒定不变。
其中，b步骤所述的愈伤组织诱导培养基为MS+7％蔗糖+0.5mg/L 2，4-D+2.0mg/LBA。
其中，c步骤所述的胚状体诱导培养基为MS+3％蔗糖+0.05mg/L ZT+0.02mg/LIBA+0.02mg/L NAA。
培养基原料及浓度的选择决定了分化的效果。
其中，c步骤所述的培养基培养条件下为光照2000lux，16h/d，共4周。整个培养过程对培养条件要求严格一致，各参数不能出现波动，温度、光照和培养过程中光照和黑暗时间对花药愈伤组织的再分化产生极显著影响，最终导致愈伤组织失去再分化能力。
枇杷花蕾的采集时间与预处理温度、时间和方法的不同，培养条件(愈伤组织诱导时间黑暗条件、温度23±1℃)、(诱导胚状体再分化时暗培养和光培养的时间比)、培养时间、培养基类型、激素种类和配比等。这些方面均是各种植物花药培养是的区别点，也是本发明方法的技术特征。
本发明还提供了采用该方法获得的木本植物的胚状体。
本发明还提供了采用该方法获得的枇杷花药的胚状体。
本发明制备胚状体所采用的途径为采用细胞工程手段，诱导枇杷花药内小孢子脱分化形成愈伤组织，通过特定的基本培养基、植物激素的种类、浓度和配比及培养条件，实现愈伤组织的再分化，形成胚状体。
本发明明确了花药培养获得胚状体，花药培养育种，是将花粉培育成单倍体植株，再经染色体自然或人工加倍得到纯合二倍体的一种育种法。这种染色体加倍产生的纯合二倍体，在遗传上非常稳定，不发生性状分离，因此，花培育种能极早稳定分离后代、缩短育种年限。由于单倍体选择的显性方差减少，加性方差成倍增加，所以，在同一选择周期中，单倍体选择效率要比二倍体高得多。同时，花培加倍后的纯合二倍体植株，可排除杂合体中显性因子掩盖隐性因子造成的干扰，提高选择的准确性和可靠性。由于花粉植株是由单倍体直接加倍形成的，故隐性性状得以纯合表现，而且花粉植株不论来源于F1或F2，其当代株系均表现丰富的多样性，如株高、生育期、育性及抗性等。这些性状相互交叉，组成了具有多种形态特征的花培株系，因此，花培育种既可充分利用植物的种质资源，又可获得性状的多样性。花药胚状体是育种(获得单倍体、纯合二倍体和多倍体枇杷种质资源)、组织学和细胞学研究(研究胚胎的发生和发育)、转基因研究与应用(生产转基因植物)、快速繁殖(生产优良种苗)、人工种子生产(遗传性状优良个体推广)等方面的优良材料和载体。
采用生物技术辅助育种，可大大加快木本果树的育种速度和进程，对隐性基因而言，常规育种F2代中，隐性基因纯合的几率为(1/4)n，其中n为目的隐性基因的个数。通过花药培养获得单倍体，再对单倍体进行染色体加倍，即可完成一次选育。通过单倍体育种技术，可迅速获得基因纯合的个体，尤其是对隐性基因的利用，F2代隐性基因纯合个体的获得的几率为(1/2)n。节约数十年的时间。可大大加快枇杷育种工作的进程；提高枇杷优良品种的选育效率。
本发明实现枇杷花药愈伤组织的再分化，得到胚状体，为枇杷遗传工程建立起良好的育种材料，大大加快枇杷育种进程，提高选育效率，节约大量人力物力，具有重大的理论和现实意义为生物技术的上游技术(转基因)奠定了良好的基础，为组织学和细胞学研究、快速繁殖(生产优良种苗)、人工种子生产(遗传性状优良个体推广)等方面的优良材料和载体。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施例方式
实验例1 本发明木本植物花药培养胚状体的方法(1)取含有处于单核早期到单核晚期小孢子的枇杷花蕾，用无菌水洗净，然后用湿纱布包裹后放入密闭容器，置于4℃黑暗条件下低温处理48小时；必须确定适宜于花粉培养的小孢子发育时期，发育时期的不同，小孢子在离体培养时的表现也不同，直接影响到花药培养的成功与否。
(2)使用手术刀刮去枇杷花蕾表面绒毛，置于3％Tween溶液中清洗一遍，然后用蒸馏水冲洗3～4次。
(3)在洁净工作台上，用0.1％升汞消毒8分钟，然后用无菌水冲洗花蕾4～5次。
枇杷花蕾上密被厚厚的绒毛，对微生物提供了良好的庇护，很不利于消毒灭菌。通过试验，必须确定合理的消毒杀菌程序，这样才能彻底杀灭微生物而不至于伤及枇杷花药，直接决定能否成功建立起外植体材料。
(4)在培养皿中，使用手术刀及枪形镊子，剥开枇杷花蕾，小心取出花药并彻底除去花药上附带的花丝并剔除受伤的花药。消毒灭菌后，将花药从花蕾中完好的取出，并确保花丝被彻底清除。因为一旦花药壁受伤或花丝未被清除彻底，将导致花药壁或花丝这些二倍体优先形成愈伤组织，而影响试验目的的达到。
(5)将枇杷花药在无菌条件下接种于愈伤组织诱导培养基(MS+7％蔗糖+0.5mg/L2，4-D+2.0mg/L BA)上，每只三角瓶接种20枚花药，置于23±1℃黑暗条件下诱导枇杷花药脱分化形成愈伤组织。适宜的培养基配方和培养条件，是决定花粉小孢子能否脱分化的关键。适宜的培养基、植物激素的种类和配比及培养条件能改变花粉小孢子的发育方向，从而实现脱分化，形成愈伤组织。为下一步的再分化打下基础。
(6)通过4周的暗培养，愈伤组织生长并涨破花药壁。切取长出的愈伤组织，接种于胚状体诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.05mg/L ZT+0.02mg/L IBA+0.02mg/L NAA)上，光照2000lux，16h/d。4周后愈伤组织开始再分化，形成胚性愈伤组织；再经4周培养，胚性愈伤组织再分化形成胚状体。
进行花药花粉离体培养的目的在于实现植株再生。枇杷花药脱分化形成愈伤组织是基础，愈伤组织再分化才使目的，愈伤组织再分化有两条途径，一是直接分化途径；二是胚状体途径。其中以胚状体途径意义最为重大，胚状体可用于组织学和细胞学研究、转基因研究、快速繁殖、人工种子生产等方面。实现脱分化形成胚状体的关键在于合适的培养基种类；植物激素的种类、组合、浓度和配比；适宜的培养条件和培养方法。
实验例2 本发明木本植物花药培养胚状体的方法中培养基的筛选表12，4-D对花药愈伤组织诱导的影响
所有的枇杷花药均培养在MS基本培养基上，附加70g/L蔗糖和2.0mg/L BA。进行最适2，4-D浓度的筛选。
表2蔗糖浓度对花药愈伤组织诱导的影响
所有的枇杷花药均培养在MS基本培养基上，附加0.5mg/L 2，4-D和2.0mg/LBA。进行最适蔗糖浓度的筛选。
表3ZT，NAA和IBA对花药愈伤组织再分化形成胚状体的影响
所有的枇杷花药愈伤组织均培养在MS基本培养基上，附加0.01，0.05，0.10和0.50mg/L ZT、0.01，0.02，和0.04mg/L NAA与0.01，0.02，0.04mg/L的组合，蔗糖浓度均为30g/L，进行再分化培养基最佳植物激素组合的筛选。
结果栏中采用邓肯氏多重比较方法对结果进行分析，相同字母代表差异不显著，不同字母代表差异显著。小写字母P＝0.05，大写字母P＝0.01。(％愈伤组织、％胚状体诱导后的abc或ABC，P＝0.05或P＝0.01时差异显著性，不同字母代表实验结果间差异显著，相同字母表示结果差异不显著。)通过上述试验可知，虽然培养基中原料为常规原料，但是选择不同，浓度配比不同，直接影响了化胚状体的得率。
附MS培养基配方大量元素二水合氯化钙(CaCl2)440.0mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)170.0mg/L、硝酸钾(KNO3)1900.0mg/L、七水合硫酸镁(MgSO4.7H2O)370.0mg/L、硝酸铵(NH4NO3)1650.0mg/L。微量元素五水合硫酸铜(CuSO4.5H2O)0.025mg/L、铁盐(FeNaEDTA)36.7mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、一水合硫酸锰(MnSO4.H2O)16.9mg/L、七水合硫酸锌(ZnSO4.7H2O)8.6mg/L、四水合钼酸钠(Na2Mo4.4H2O)0.25mg/L、碘化钾(KI)0.83mg/L。有机物甘氨酸(Glycine)2.0mg/L、肌醇(Myo-inositol)100mg/L、烟酸(Nicotinic acid)0.5mg/L、VB60.5mg/L、VB10.1mg/L。
2，4-D2，4-dichlorophenoxyacetic acid(2，4-2氯苯氧乙酸)；BAbenzyladenine(苄基嘌呤)；IBAindolebutyric acid(吲哚丁酸)；NAAα-naphthaleneacetic acid(萘乙酸)；KTkenetin(激动素)；MS mediumMurashige and Skoog(1962)(MS)medium(MS培养基)；ZTzeatin(玉米素)。
权利要求
1.一种木本植物花药培养胚状体的方法，其特征在于取木本植物花药内的花粉小孢子的发育处于单核晚期，在无菌条件，23±1℃黑暗条件下接种于愈伤细胞诱导培养基，以分化形成胚状体。
2.根据权利要求1所述的木本植物花药培养胚状体的方法，其特征于所述的木本植物是枇杷属植物。
3.根据权利要求2所述的木本植物花药培养胚状体的方法，其特征在于所述的木本植物是枇杷Eriobotrya japonica Lindl.。
4.根据权利要求3所述的木本植物花药培养胚状体的方法，其特征在于它包括如下步骤a、取处于单核早期到单核晚期小孢子的枇杷花蕾，4℃黑暗条件下浸泡48小时，刮去表面绒毛，清洗、消毒灭菌；b、从a步骤中消毒灭菌后的花蕾中取出花药，在无菌条件下接种于愈伤组织诱导培养基，在23±1℃黑暗条件下诱导枇杷花药脱分化形成愈伤组织；c、取b步骤的愈伤组织，接种于胚状体诱导培养基，愈伤组织再分化，形成胚性愈伤组织；d、再按c步骤方式培养，胚性愈伤组织再分化形成本发明胚状体。
5.根据权利要求4所述的木本植物花药培养胚状体的方法，其特征在于b步骤所述的愈伤组织诱导培养基为MS+7％蔗糖+0.5mg/L 2，4-D+2.0mg/L BA。
6.根据权利要求4所述的木本植物花药培养胚状体的方法，其特征在于c步骤所述的胚状体诱导培养基为MS+3％蔗糖+0.05mg/L ZT+0.02mg/L IBA+0.02mg/LNAA。
7.根据权利要求4所述的木本植物花药培养胚状体的方法，其特征在于c步骤所述的培养基培养条件下为温度23±1℃，光照2000lux，16h/d，共4周。
8.采用权利要求1所述的方法获得的木本植物的胚状体。
9.采用权利要求4所述的方法获得的枇杷花药的胚状体。
全文摘要
本发明提供了一种木本植物花药培养胚状体的方法，它是取木本植物花药内的花粉小孢子的发育处于单核晚期，在无菌条件下，接种于愈伤细胞诱导培养基，以分化形成胚状体。所述的木本植物是枇杷属植物。本发明方法加快枇杷育种进程，提高枇杷优良品种的选育效率。
文档编号A01G1/00GK1663359SQ20051002047
公开日2005年9月7日 申请日期2005年3月7日 优先权日2005年3月7日
发明者王永清, 李俊强, 吴荭, 周兰英, 邓群仙, 陈红 申请人:四川农业大学