专利名称：Fbxl15蛋白抑制剂以及它们的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及FBXL15蛋白抑制剂以及它们的应用。
背景技术：
蛋白质是构成生命体内细胞和组织的基本物质，几乎所有的蛋白质都处在不断合成与降解的动态平衡之中。与蛋白质的合成相比，蛋白质的降解同样重要，机体内短寿命的、错误折叠的以及机体自身不需要的蛋白都需要通过降解途径来清除。其中泛素-蛋白酶体系统⑴biquitin-Proteasome System,UPS)就是真核生物体内普遍存在的具有高度选择性的蛋白质降解系统，主要由蛋白质泛素化和蛋白酶体降解两个过程组成。该系统的生物学功能非常广泛，参与调控细胞内几乎各个方面的生命活动，其异常与炎症、癌症及神经退行性疾病等密切相关。泛素化修饰通过由泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme，El)、泛素结合 Sl (ubiquitin conjugating enzyme, E2)禾口泛素连接 Sl (ubi qui tin-protein ligase, E3) 参与介导的酶促级联反应完成，最后经蛋白酶体降解。其中E3决定底物识别的特异性，是蛋白质泛素化领域的研究热点。E3可以分为两大类含有RING(really interesting new gene)锌指结构和 HECT (homologous to E6AP C-terminus)结构域的 E3(图 1)。RING类E3中的大多数是基于Cullins蛋白的多亚基复合体，其中基于Cullinl所形成的SCF(Skpl-Cullinl-F-box)复合体是研究最多、最深入的RING类E3复合体。它以支架蛋白Cullinl为中心，C端结合RING锌指蛋白Rocl，N端结合接头蛋白Skp 1，Skpl又进一步募集不同的F-box蛋白，F-box蛋白担当底物识别亚基的角色，这样SCF复合体就利用不同的F-box蛋白形成不同复合体，从而结合不同的底物，在细胞周期调控、细胞生长及肿瘤发生等多种生物学过程中发挥着重要作用。F-box蛋白是一个大的蛋白家族，其家族成员数量在不同的物种中差别很大，酵母中约有20种，果蝇中有27种，而在人中则有69个成员。人中的F-box蛋白家族根据其C端所含结构域的不同，可以分为三类含有WD40结构域的FBXW亚家族，含有LRR区的FBXL亚家族，以及含有其它结构域的统称为FBM)亚家族，它们分别通过WD40、LRR及其它结构域与底物蛋白发生相互作用，介导SCF复合体对底物的识别及泛素化修饰。
发明内容
本发明的目的是提供FBXL15蛋白抑制剂以及它们的应用。本发明提供了一种核酸(FBXL15蛋白抑制剂)，为如下(1)至(6)中的任意一种(1)序列表的序列3所示的单链核酸；(2)序列表的序列4所示的单链核酸；(3)序列表的序列5所示的单链核酸；(4)序列表的序列3自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸；(5)序列表的序列4自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸；
4
(6)序列表的序列5自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸。本发明还保护FBXL15蛋白的抑制剂在制备骨质疏松动物模型中的应用；所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。本发明还保护一种用于制备骨质疏松动物模型的产品，它的活性成分为所述 FBXL15蛋白的抑制剂。本发明还保护所述FBXL15蛋白的抑制剂在降低所述FBXL15蛋白的编码基因的表达量中的应用。以上任一所述FBXL15蛋白的抑制剂均可为所述核酸中的任意一种。以上任一所述骨质疏松动物模型的骨小梁密度(BMD)、骨小梁相对骨量(BV/TV)， 骨小梁数量(Tb. N)和骨小梁厚度(Tb. Th)中的至少一种低于所述骨质疏松动物模型的出发动物。以上任一所述动物具体可为大鼠，如SD大鼠。所述FBXL15蛋白的编码基因可为如下(1)或⑵或(3)所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA 分子；(3)与⑴限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。本发明还保护所述FBXL15蛋白或所述FBXL15蛋白的编码基因在参与大鼠体内骨稳态平衡中的应用。大鼠实验证实，在骨组织中导入所述FBXL15蛋白抑制剂后，可以敲低FBXL15蛋白的编码基因的表达量，大鼠绝大多数骨指标明显下降，呈现明显的骨质疏松表型。
图1为E3泛素连接酶的组成类型；根据结构组成及泛素转移方式的不同，E3可分为单体RING类E3，HECT类E3和多亚基RING类E3。图2为FBXL15蛋白的结构域组成示意图。图3为小鼠FBXL15基因的组织表达谱。图4为各个实验组经过相应处理后，细胞内FBXL15基因mRNA的相对水平。图5为大鼠胫骨骨小梁MicroCT参数分析；*表示P < 0. 05 ；BMD的单位为“mg/
ccm，，，BV/TV的单位为“ % ”，Tb. Th的单位为“mm”，Tb. N的单位为“ 1/mm”，Tb. sp的单位为 “_”。图6为大鼠胫骨骨小梁MicroCT三维重建图像。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。SD大鼠(健康6月龄雌性Sprague-Dawley大鼠)购自军事医学科学院实验动物中心。UMR106细胞(大鼠成骨样细胞系)购自美国标准菌种保藏中心(ATCC)，目录号为 CRL-1661。实施例1、FBXL15蛋白的基本特征描述FBXL15蛋白由F-box结构域和6个亮氨酸富含区(LRR)所组成(结构示意图见图 2)。LRR是一大类介导蛋白相互作用的结构域，根据长度及序列特征可以分为6类，FBXL15 蛋白及Skp2蛋白等F-box蛋白属于其中的CC(cysteine-containing)亚类。FBXL15蛋白在进化上较为保守，在果蝇、疟蚊等无脊椎动物及鱼类、鸟类等脊椎动物以及哺乳动物中都存在FBXL15蛋白的同源基因，其中哺乳动物中FBXL15蛋白高度保守，人与其它哺乳动物的同源性高达95%以上，与鱼类、鸟类的同源性在60%左右，与无脊椎动物的进化距离较远， 只有30%左右。从FBXL15蛋白与其它FBXL亚类的蛋白的进化树关系分析，FBXL15蛋白分支独立于大多数FBXL亚类蛋白，提示FBXL15蛋白的功能可能比较保守。在获得FBXL15抗体后，对FBXL15蛋白的组织和细胞表达谱进行了分析。组织器官来自小鼠，分别为心、肝、脾、肺、肾、脑、骨、肌肉。结果显示，抗体可以识别鼠源FBXL15蛋白，FBXL15蛋白的组织表达谱比较广泛，在心、脑组织中呈高表达，在肝、脾、肾、骨、肌肉中表达中等，在肺中表达很弱(在各器官中的表达谱见图3)。实施例2、SiRNA的设计和合成大鼠FBXL15蛋白如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2所示。设计如下三条靶向大鼠中FBXL15蛋白的siRNA 1#(序列表的序列；3) :5，-CACCCUUU⑶CAACCUACATT-3，；2#(序列表的序列 4) :5，-CACCCUGGAAUUUCAAAUATT-3，；3#(序列表的序列幻5，-GGCCAAAGCUAGUAAAGCUTT-3，。设计如下阴性对照siRNA :5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUTT-3，。以上各条siRNA由上海吉玛公司负责合成。实施例3、siRNA的应用一、siRNA的敲低效率借助Lipofectamine 2000转染试剂分别将实施例2合成的l#siRNA(si_l组)、 2#siRNA (si-2 组)、3#siRNA (si_3 组)、阴性对照 siRNA (NC 组)转染 M 孔板中的 UMR106 细胞(按Lipofectamine 2000转染试剂的说明书操作；对孔板细胞生长汇合度为70%时转染细胞，2 μ 1 20 μ M siRNA与1 μ 1转染试剂混合，siRNA和细胞个数比例约为80nM siRNA 8X104个细胞)；同时设置仅转染不含有siRNA的转染试剂的平行处理，作为空白对照(VC 组)。转染48小时后，收取细胞，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，通过实时定量PCR检测siRNA对FBXL15基因的敲低效率(借助GAPDH基因调整各组细胞至浓度)。
检测GAPDH基因的引物对如下 5’ -CAAGTTCAACGGCACAGTCA-3’ ；5，-CCATTTGATGTTAGCGGGAT-3，。
检测FBXL15基因的引物对如下(靶序列约109bp)5，-GCTCAGGTGGGTCCACAGA-3，；5，-CGTCCAACAGCCATTCG-3，。对于各组处理，将FBXL15基因与GAPDH基因的表达量的比值作为FBXL15基因的标准化表达量。以NC组细胞内FBXL15基因的标准化表达量(FBXL15mRNA的标准化表达量)为 100%，计算其它几组细胞内FBXL15mRNA的相对水平(相对表达量)，见图4。敲低效率= 1-相对表达量。结果显示，3条siRNA的敲低效率均超过了 90%，l#siRNA的敲低效率为 96.4%, 2#siRNA的敲低效率为92. 3%，3#siRNA的敲低效率为93. 5%，l#siRNA敲低效率最尚。二、FBXL15参与体内骨稳态的调控目前已知Smurfl最重要的生理功能是参与调控骨平衡，Smurfl-/"小鼠呈现年龄依赖的骨量增加，成骨细胞活性增强。那么FBXL15对Smurfl的调控是否会影响骨形成呢？特异靶向骨组织的递送系统(BTDQ中的脂质体的制备方法具体方法如下将脂质体 DOTAP (Avanti America,目录号 890890)，脂质体 DOPE (Avanti America, 850725)，胆固醇(Chol)， DSPE_mPEG2000(Avanti America,880128) ^P DSPE-mPEG2000-MAL(Avanti America,880126)按照摩尔比42 15 38 3 2的比例共同溶解在氯仿中，然后使之挥发干缩至薄膜上，用IOmM PBS(pH 7.4)使之水合，50°C水浴预孵育形成多室脂质体小泡 (MLV)；用Lipoi^ast挤压器(Lipofast，Avestin，多伦多，加拿大)使MLV依次透过两层直径0. 2 μ m和0. 1 μ m的聚碳酸酯膜(分别重复5次)，形成大的单室脂质体小泡(LUV) ；LUV 与N末端为乙酰半胱氨酸残基的(DSS)6 (ChinaPeptides CO.，LTD, China)室温孵育2h(N 末端为乙酰半胱氨酸残基的(DSS)与DSPE-PEG2000-MAL的摩尔比为3 1)，然后用琼脂糖 CL-4B柱子通过筛析色谱法去掉未结合的(DSQ6，得到脂质体悬液；将脂质体悬液每0. 5ml 分装成一管，与等体积的含有甘露醇的去离子水混合(甘露醇与脂质体的摩尔比为5 1)， 冻干机(Labconco, Freezezone，美国)处理48小时。尾静脉注射前，将15 μ mol上述方法得到的脂质体与0. 5ml含有375 μ g siRNA的 DEPC水再水合，室温孵育20min，然后通过0. 22 μ m的滤器过滤，然后尾静脉注射SD大鼠。 siRNA利用特异靶向骨组织的递送系统(BTDQ传送到大鼠的骨组织。将30只6月龄大雌性SD大鼠随机分为5组，每组6只；利用特异靶向骨组织的递送系统(BTDQ将siRNA传送到大鼠的骨组织，各组大鼠每次的注射体积相同，分组处理情况如下(各组同时处理)第一组(si-L15组)借助BTDS将实施例2合成的l#siRNA尾静脉注射大鼠，每次剂量为細g siRNA/kg大鼠；注射6次，每次间隔1周；第六次注射完成后取右侧胫骨进行 MicroCT扫描分析；第二组(NC组)借助BTDS将实施例2合成的阴性对照siRNA尾静脉注射大鼠， 每次剂量为細g siRNA/kg大鼠；注射6次，每次间隔1周；第六次注射完成后取右侧胫骨进行MicroCT扫描分析；第三组(VC组)用BTDS尾静脉注射大鼠；注射6次，每次间隔1周；第六次注射完成后取右侧胫骨进行MicroCT扫描分析；第四组(AM组)大鼠不进行任何处理；与其它组同时取右侧胫骨进行MicroCT扫描分析；第五组(BL组)大鼠不进行任何处理，实验起始时(即比其它组少饲养5周)；取右侧胫骨进行MicroCT扫描分析。MicroCT扫描分析采用21 μ m分辨率，选择8个横断面来进行，并对核心直径约 2. 2mm 的骨小梁进行三维重建(viva CT40, SCANCO MEDICAL, Sigma =1.2，Supports = 2and Threshold = 190)，并定量分析以下参数骨小梁密度(BMD)、骨小梁相对骨量(BV/TV)，骨小梁数量(Tb. N)，骨小梁厚度(Tb. Th)和骨小梁间距(Tb.sp)。各个参数的检测结果见表 1和图5。大鼠胫骨骨小梁三维重建图像见图6。表1各个参数的分析结果
权利要求
1.核酸，为如下(1)至(6)中的任意一种(1)序列表的序列3所示的单链核酸；(2)序列表的序列4所示的单链核酸；(3)序列表的序列5所示的单链核酸；(4)序列表的序列3自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸；(5)序列表的序列4自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸；(6)序列表的序列5自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸。
2.FBXL15蛋白的抑制剂在制备骨质疏松动物模型中的应用； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
3.用于制备骨质疏松动物模型的产品，它的活性成分为FBXL15蛋白的抑制剂； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
4.FBXL15蛋白的抑制剂在降低FBXL15蛋白的编码基因的表达量中的应用； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
5.如权利要求2所述的应用，或，如权利要求3所述的产品，或，如权利要求4所述的应用，其特征在于所述FBXL15蛋白的抑制剂为权利要求1所述的核酸。
6.如权利要求2所述的应用，或，如权利要求3所述的产品，其特征在于所述骨质疏松动物模型的骨小梁密度、骨小梁相对骨量，骨小梁数量和骨小梁厚度中的至少一种低于所述骨质疏松动物模型的出发动物。
7.如权利要求2所述的应用，或，如权利要求3所述的产品，其特征在于所述动物为大鼠。
8.如权利要求2至7中任一所述的应用或产品，其特征在于所述FBXL15蛋白的编码基因是如下⑴或⑵或⑶所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的 DNA分子。
9.FBXL15蛋白或其编码基因在参与大鼠体内骨稳态平衡中的应用； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述FBXL15蛋白的编码基因是如下(1)或 ⑵或⑶所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的 DNA分子。
全文摘要
本发明公开了FBXL15蛋白抑制剂以及它们的应用。本发明提供的FBXL15蛋白的抑制剂为如下(1)至(6)中的任意一种(1)序列表的序列3所示的单链核酸；(2)序列表的序列4所示的单链核酸；(3)序列表的序列5所示的单链核酸；(4)序列表的序列3自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸；(5)序列表的序列4自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸；(6)序列表的序列5自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸。所述FBXL15蛋白的抑制剂可用于制备骨质疏松动物模型。大鼠实验证实，在骨组织中导入FBXL15蛋白抑制剂后，可以敲低FBXL15蛋白的编码基因的表达量，大鼠绝大多数骨指标明显下降，呈现明显的骨质疏松表型。
文档编号A01K67/027GK102382829SQ20111035148
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年5月3日
发明者何珊, 崔宇, 张令强, 梁超, 贺福初, 邢桂春 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所