一种miRNA及其在调控小麦种子萌发速度和穗发芽能力中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明设及一种miRNA及其在调控小麦种子萌发速度和穗发芽能力中的应用。
【背景技术】
[0002] MicroRNA简称miRNA(微RNA)，是由非蛋白编码基因转录物形成的茎环结构前体， 剪切成熟后形成的长度为20-25nt的小RNA分子，广泛存在于动、植物体中。它们能通过与祀 mRNA的几乎完全互补导致祀mRNA降解，或不完全互补结合阻断mRNA翻译，或抑制祀基因的 转录。据估计，在真核生物中大约有1%-2%的已知基因由miRNA组成，它们调控了大约30% 甚至更多的基因表达。自从被发现W来，miRNA即成为生命科学的研究热点，其原因在于运 类小RNA分子在生命活动中具有广泛的调节功能，对基因表达、生长发育和行为等都有十分 深远和复杂的效应。
[0003] 小麦是世界上最重要的粮食作物之一，约有40%的人口 W小麦为主粮，小麦的营 养丰富，小麦磨成面粉后可制作慢头、面包、饼干等食物。然而在小麦的生产过程中，小麦的 穗发芽是一种很严重的气候性灾害，穗发芽是指小麦在收获前期遭遇阴雨天气或者潮湿环 境引起的穗上发芽现象。据报道在日本、美国、澳大利亚、加拿大等国都存在穗发芽问题，其 中W加拿大和澳大利亚尤为严重。在欧洲几乎每年都有穗发芽发生，造成的损失也十分严 重。我国也是小麦穗发芽的重灾区，我国的小麦Ξ大主产区：东北春麦区、长江中下游冬麦 区、和西南冬麦区，都是穗发芽危害较严重的地区，在黄淮冬麦区和北方冬麦区也偶有发 生，受穗发芽危害的麦区约占我国小麦总面积的83%。小麦的穗发芽是在小麦生产过程中 提高小麦质量和产量亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种miRNA及其在调控小麦种子萌发速度和穗发芽能力中的 应用。
[0005] 本发明提供一种miRNA，命名为miRNA-WZ，来源于小麦品种中国春，如序列表的序 列3所示。本发明还保护一种RNA (miRNA-WZ的前体，简称mi RNA-WZ前体），如序列表的序列4 所示。
[0006] 编码所述miRNA-wz的DNA分子也属于本发明的保护范围。所述DNA分子具体可为如 下(al)或(a2)或(曰3):
[0007] (al)序列表中序列1所示的DNA分子；
[000引（曰2)在严格条件下与(al)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
[0009](曰3)与(al)限定的DNA序列具有90%w上同源性且具有相同功能的DNA分子。
[0010] 编码所述miRNA-wz前体的DNA分子也属于本发明的保护范围。所述DNA分子具体可 为如下(bl)或化2)或化3):
[0011] (bl)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0012] (b2化严格条件下与(bl)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
[OOU]化3)与(bl)限定的DNA序列具有90%W上同源性且具有相同功能的DNA分子。
[0014] 上述严格条件可为用0.1 X SS阳(或0.1 X SSC)，0.1 %SDS的溶液，在DNA或者RNA杂 交实验中65°C下杂交并洗膜。
[0015] 含有W上任一所述DNA分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属 于本发明的保护范围。
[0016] 所述重组载体可为在植物表达载体的多克隆位点或重组位点插入W上任一所述 DNA分子得到重组质粒。所述重组载体具体可为将PWMB003载体的Smal酶切位点和SacI酶切 位点之间的小片段取代为W上任一所述DNA分子得到的重组质粒。所述重组载体具体可为 将PAHC25载体的Smal酶切位点和SacI酶切位点之间的小片段取代为W上任一所述DNA分子 得到的重组质粒。
[0017] 扩增所述DNA分子的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述 引物对具体可由序列表的序列6所示的单链DNA分子和序列表的序列7所示的单链DNA分子 组成。
[0018] 本发明还保护所述miRNA-wz、所述miRNA-wz前体或W上任一所述DNA分子的应用， 为如下(cl)、（c2)、（c3)或(c4):
[0019] (cl)调控植物穗发芽能力；
[0020] (c2)调控植物种子萌发速度；
[0021] (c3)降低植物穗发芽能力；
[0022] (c4)降低植物种子萌发速度。
[0023] 所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为被子植物。所述被 子植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为小麦属植 物。所述小麦属植物具体可为小麦，例如小麦CB037或冀麦5265。
[0024] 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将W上任一所述DNA分子导入出发 植物中，得到转基因植物;所述转基因植物满足如下(dl)或(d2)中的至少一种表型：
[0025] (dl)种子萌发速度低于所述出发植物；
[0026] (d2)穗发芽能力低于所述出发植物。
[0027] 所述出发植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为被子植物。所 述被子植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为小麦 属植物。所述小麦属植物具体可为小麦，例如小麦CB037或冀麦5265。
[0028] W上任一所述DNA分子可通过重组表达载体导入所述出发植物。所述重组表达载 体可为在植物表达载体的多克隆位点或重组位点插入W上任一所述DNA分子得到重组质 粒。所述重组载体具体可为将PWMB003载体的Smal酶切位点和SacI酶切位点之间的小片段 取代为W上任一所述DNA分子得到的重组质粒。所述重组载体具体可为将PAHC25载体的 Smal酶切位点和SacI酶切位点之间的小片段取代为W上任一所述DNA分子得到的重组质 粒。
[0029 ] 本发明还保护W上任一所述方法、所述miRNA、所述miRNA-wz前体或W上任一所述 DNA分子在植物育种中的应用。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可 为被子植物。所述被子植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科 植物可为小麦属植物。所述小麦属植物具体可为小麦，例如小麦CB037或冀麦5265。所述育 种的目的为获得种子萌发速度和/或穗发芽能力降低的植物。
[0030] 本发明中，通过表达模式分析、瞬时超表达验证等对miRNA-wz进行了功能鉴定，初 步鉴定了其对种子萌发的影响，发现超表达miRNA-wz抑制了种子萌发速度且抑制了穗发 芽。本发明为提高小麦抗穗发芽能力，降低穗发芽对小麦生产的影响提供技术支持，同时也 为W后通过转基因等生物技术或者筛选高水平表达miRNA小麦品种获得小麦抗穗发芽新的 种质奠定基础。
【附图说明】
[0031] 图1为miRNA-wz在不同植物中的表达情况。
[0032] 图2为miRNA-wz在小麦种子的不同发育时期的表达情况。
[0033] 图3为实施例4中的发芽率结果。
[0034] 图4为实施例4的步骤4中培养8天的照片。
[0035] 图5为实施例4中实时定量PCR检测幼胚中miRNA-wz的表达的结果。
[0036] 图6为实施例5中部分T1代植株的PCR鉴定结果。
[0037] 图7为实施例5中实时定量PCR检测miRNA-wz的表达的结果。
[003引图8为冀麦5265种子和0E5株系种子静置培养24小时和48小时后的照片。
[0039] 图9为第1天、第2天和第3天，各个株系的发芽率结果。
[0040] 图10为冀麦5265和0E5株系植株静置培养7天后的照片。
[0041 ]图11为静置培养7天后，各个株系的穗发芽率结果。
【具体实施方式】
[0042] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。W下实施例中的定量试验，均设置Ξ次重复实验，结果取平 均值。
[0043] PAHC25载体（又称PAHC25质粒）：参考文献：Taylor Μ G，Vasil V，Vasil I Κ.Enhanced GUS gene expression in cereal/grass cell suspensions and immature embryos using the maize uhiquitin-based plasmid pAHC25[J].Plant cell reports， 1993,12(9):491-495.0
[0044] p丽B003载体:参考文献:殷桂香，赵佩，郝浩楠，李捷琳，杜丽壤，张平治，余茂云， 叶兴国.（2014) .Ξ个方便实用的植物表达载体构建与验证.植物遗传资源学报，15(6)， 1327-1333.。
[0045] 小麦乂B037"(简称小麦CB037):参考文献:YIN，G.X.，WANG，Y丄.，S皿