例4、小麦幼胚瞬时表达
[0091] 1、取授粉后10-12天的小麦CB037种子，先用70%乙醇处理2min，再用次氯酸钢溶 液(有效氯0.5%，体积比）处理15min，然后灭菌水洗Ξ次。
[0092] 2、取步骤1得到的种子，分离幼胚，并将幼胚盾片朝上放在含有200mg/L MES和 150g/L麦芽糖的1/2MS固体培养基上，25°C黑暗处理3-地。
[0093] 3、用重组质粒P丽B003-miRwz或PWMB003载体做成基因枪子弹，轰击步骤2得到的 幼胚。
[0094] 4、完成步骤3后，取幼胚，黑暗处理1天，然后将幼胚盾片朝下转移至含有200mg/L 和30g/L麦芽糖的1/2MS固体培养基上，25°C培养，培养过程中每24小时统计发芽率。
[00M]发芽率结果见图3(横坐标为天数，每24小时为1天）。步骤4中培养8天的照片见图 4。结果表明，轰击重组质粒pWMB003-miRwz的幼胚的发芽率显著低于轰击PWMB003载体的幼 胚，说明超表达本发明提供的m i RNA-WZ能抑制幼胚的萌发。
[0096] 5、步骤4中培养4天后，利用化qman探针的实时定量PCR检测幼胚中miRNA-wz的表 达(方法同实施例2的步骤二），结果见图5。结果表明，轰击重组质粒pWMB003-miRwz的幼胚 中miRNA-wz的表达水平明显高于轰击PWMB003载体的幼胚。
[0097] 实施例5、功能分析
[0098] -、获得转基因植株
[0099] 1、取重组质粒pAHC25-miRwz，采用基因枪轰击冀麦5265的幼胚愈伤组织，得到TO 代植株。
[0100] 2、TO代植株自交，得到T1代植株。T1代植株自交，得到T2代植株。T2代植株自交，得 到T3代植株。
[0101] 3、Τ0代植株、T1代植株、T2代植株进行如下PCR鉴定:提取待测植株基因组DNA，采 用BAR1和BAR2组成的引物对(祀序列为载体骨架中的Barsta基因）进行PCR鉴定，如果得到 约450bp的扩增产物、待测植株为转基因植株，如果没有得到所述扩增产物、待测植物为非 转基因植株。对于某一转基因 T1代植株来说，如果该植株及其抽样检测的T2代植株均为转 基因植株，该植株为纯合的转基因植株，该植株及其自交后代为纯合的转基因株系。部分T1 代植株的PCR鉴定结果见图6(每个泳道代表1个植株）。
[0102] BAR1:5 '-GTCTGCACCATCGTCAACC-3 '；
[0103] BAR2:5'-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3'。
[0104] 4、随机取3个纯合转基因株系（0E5、0E6和0E8)的T3代植株，利用化qman探针的实 时定量PCR检测miRNA-wz的表达(方法同实施例2的步骤二），结果见图7。结果表明，转基因 株系中miRNA-wz的表达水平至少提高了 2倍。
[0105] 二、获得转空载体植株
[0106] 用pAHC25载体代替重组质粒pAHC25-miRwz进行步骤一，得到转空载体植株。
[0107] Ξ、小麦发芽性状考察
[010引1、miRNA-wz对小麦种子萌发速度的影响
[0109] 随机取3个纯合转基因株系（0E5、0E6和0E8)的T3代种子，取转空载体植株的T3代 种子，取冀麦5265种子，分别进行如下平行试验：
[0110] 将种子胚向上、腹沟向下摆放在垫有两层滤纸的小培养皿(直径为5cm)中，加5ml 灭菌蒸馈水，23-25°C静置培养，W巧粒萌动为发芽，每24小时统计发芽数，计算发芽率。
[0111] 进行Ξ次重复试验，每次重复试验中每个株系35粒种子，结果取平均值。
[0112] 冀麦5265种子和0E5株系种子静置培养24小时和静置培养48小时后的照片见图8。 第1天、第2天和第3天，各个株系的发芽率结果见图9(横坐标为天数，每24小时为1天）。
[0113] 结果表明，转基因株系的种子在静置培养24小时和48小时后的发芽率显著低于冀 麦5265，miRNA-wz抑制了种子萌发，但静置培养72小时后转基因株系的种子的发芽率与冀 麦5265的种子没有明显差异，运说明miRNA-wz只是降低了种子的发芽速度，并没有降低种 子的发芽率。静置培养24小时、48小时和72小时后，转空载体植株的种子的发芽率与冀麦 5265的种子均没有显著差异。
[0114] 2、miRNA-wz对小麦穗发芽的影响
[0115] 随机取3个纯合转基因株系（0E5、0E6和0E8)的T3代植株，取转空载体植株的T3代 植株，取冀麦5265植株，分别进行如下平行试验：
[0116] 取成熟植株，5穗扎成一捆，在水中室溫浸泡化后取出，甩出多余水珠后放在塑料 袋内并扎紧袋口，23-25Γ静置培养7天，然后统计穗发芽率巧粒有萌动或者萌发为发 芽)。
[0117] 进行Ξ次重复试验，每次重复试验中每个株系5穗，结果取平均值。
[0118] 冀麦5265和0E5株系植株静置培养7天后的照片见图10。静置培养7天后，各个株系 的穗发芽率结果见图11。结果表明，转基因株系的穗发芽的能力显著低于冀麦5265,超表达 miRNA-wz对穗发芽有抑制作用。静置培养7天后，转空载体植株的穗发芽率与冀麦5265没有 显著差异。
【主权项】
1. 一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:将特异DNA分子导入出发植物，得到穗 发芽能力降低的转基因植物;所述特异DNA分子为如下（1)或(2)或(3)或(4): (1) 序列表中序列1所示的DNA分子； (2) 序列表中序列2所示的DNA分子； ⑶在严格条件下与⑴或⑵限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子； (4)与⑴或(2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。2. -种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:将特异DNA分子导入出发植物，得到种 子萌发速度降低的转基因植物;所述特异DNA分子为如下（1)或(2)或(3)或(4): (1) 序列表中序列1所示的DNA分子； (2) 序列表中序列2所示的DNA分子； ⑶在严格条件下与⑴或⑵限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子； (4)与⑴或(2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。 3 · -种miRNA，如序列表的序列3所示。4. 编码权利要求3所述miRNA的DNA分子，为如下(a 1)或(a2)或(a3): (al)序列表中序列1所示的DNA分子； (a2)在严格条件下与(al)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子； (a3)与(al)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。5. -种RNA，如序列表的序列4所示。6. 编码权利要求5所述RNA的DNA分子，为如下(bl)或(b2)或(b3): (bl)序列表中序列2所示的DNA分子； (b2)在严格条件下与(bl)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子； (b3)与(bl)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。7. 含有权利要求4或6所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。8. 权利要求3所述miRNA或权利要求4所述DNA分子的应用，为如下（cl)、（c2)、（c3)S (c4)： (c 1)调控植物穗发芽能力； (c2)调控植物种子萌发速度； (c3)降低植物穗发芽能力； (c4)降低植物种子萌发速度。9. 权利要求5所述RNA或权利要求6所述DNA分子的应用，为如下（cl)、（c2)、（c3)S (c4)： (c 1)调控植物穗发芽能力； (c2)调控植物种子萌发速度； (c3)降低植物穗发芽能力； (c4)降低植物种子萌发速度。10. 权利要求1或2所述方法，或，权利要求3所述miRNA，或，权利要求4所述DNA分子，或， 权利要求5所述RNA，或，权利要求6所述DNA分子在植物育种中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种miRNA及其在调控小麦种子萌发速度和穗发芽能力中的应用。本发明提供了miRNA-wz，如序列表的序列3所示。本发明还保护miRNA-wz的前体，如序列表的序列4所示。编码miRNA-wz的DNA分子和编码所述miRNA-wz前体的DNA分子也属于本发明的保护范围。本发明还保护所述miRNA-wz、所述miRNA-wz前体或以上任一所述DNA分子的应用，为如下(c1)、(c2)、(c3)或(c4)：(c1)调控植物穗发芽能力；(c2)调控植物种子萌发速度；(c3)降低植物穗发芽能力；(c4)降低植物种子萌发速度。本发明为提高小麦抗穗发芽能力，降低穗发芽对小麦生产的影响提供技术支持。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/113, C12N15/82
【公开号】CN105671047
【申请号】CN201610121816
【发明人】孙其信, 郭光辉, 姚颖垠, 孙丰龙, 倪中福, 彭惠茹, 辛明明, 胡兆荣, 李慧敏
【申请人】中国农业大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月3日