基于AllGlo探针荧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于检验医学、临床医学、生物技术和分子生物学领域，尤其是设及一种基 于AllGlo探针巧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核细胞中的长约22个核巧酸的非编码RNA 分子，参与了在生物体中许多生理病理过程，通过调苄基因表达，在细胞增殖、调亡、生长发 育、细胞分化、代谢等过程中发挥重要作用。具体表现为miRNA在细胞核内经过形成最初的 初级转录本pri-miRNA到pre-miRNA，后转运出细胞核，通过剪切形成成熟miRNA，通过与Ago 蛋白等形成RISC(RNA诱导的沉默复合体），部分抑制或降解祀mRNA序列，参与基因表达调控 (Bartel DP.MicroRNAs:genomics.biogenesis.mechanism,and function!!J].Cell,2004, 116(2):281-297.)。
[0003] 由于miRNA在肿瘤的发生、发展、预后判断W及许多其他疾病状态下扮演着重要角 色，精确检测其表达情况对于研究miRNA的作用具有重大意义，目前检测miRNA的方法主要 有nodhern blot技术、实时巧光定量PCR技术、原位杂交技术、微阵列忍片技术等。其中 northern blot技术是RNA检测的早期手段之一，但其特异性和敏感性低，如果样本RNA含量 低或存在降解，可能检测不到；原位杂交技术用于检测组织和细胞水平miRNA的分布情况， 同时对miRNA进行半定量检测，其不足之处在于不能准确检测到低表达的miRNA;微阵列忍 片技术是一种高通量的检测技术，能同时检测一种或多种样本的大量的miRNA,但存在忍片 制作费时、费力、标记成本高、检测灵敏度与特异性低等问题。
[0004] 实时巧光定量技术(RT-qPCR)是目前最普遍用于基因表达检测的技术之一，具有 简便快速、敏感性高和特异性好等特点。目前用于检测miRNA的实时巧光定量PCR方法包括 RNA逆转录和下游的巧光定量PCR两部分，其中逆转录根据反转录引物的不同分为两种：同 聚物加尾法和茎环逆转录法；巧光定量PCR的检测分为染料法和探针法，其中目前检测 miRNA的探针多为化qman-MGB探针(一种适合于扩增短片段的巧光探针）。由于成熟的miRNA 具有片段短小的特点，要特异的检测，探针法更有优势，在敏感性和特异性上优于染料法。 基于茎环结构的逆转录引物能特异识别，扩增成熟的miRNA序列，而miRNA的前体并未被扩 增，Taqman-MGB探针检测miRNA的缺点在于合成价格贵，不利于推广。
[0005] 目前AllGlo探针已经成功应用于检测瘤疹病毒、乙型肝炎病毒基因突变(Feng, Z.L.Yu,X.Y.Lu,Z.Μ.Geng,D.Y.Zhang,L.Chen,S.J.Rapid detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo?probes[J].Clin Chim Acta,2011,412(11-12)： 1018-1021 )、侵袭性曲霉菌病（Wu，D.S.化 en，J.Z. Zhou, X.Q.化 en，S.F.Wu，X.M. The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2): 142-145)、K-ras基因突变、强直性脊柱炎等检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一目的是提供一种生物标记物miR-19a。
[0007] 本发明的第二目的是提供一种基于AllGlo探针巧光定量PCR的miR-19a检测试剂 盒。
[000引本发明的第Ξ目的是提供所述基于AllGlo探针巧光定量PCR的miR-19a检测方法。
[0009] 所述生物标记物miR-19a其核巧酸序列为：
[0010] 5'-UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA-3'（沈Q ID N0:1)。
[00川所述基于AllGlo探针巧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒，设有盒体、隔板、外源性 参照瓶、颈环逆转录试剂瓶、实时巧光定量PC时式剂瓶；隔板设在盒体内，外源性参照瓶、颈 环逆转录试剂瓶、实时巧光定量PC时式剂瓶插在隔板上，外源性参照瓶内装有外源性参照， 颈环逆转录试剂瓶内装有颈环逆转录试剂，实时巧光定量PCR试剂瓶内装有实时巧光定量 PCR试剂。
[0012] 所述外源性参照可采用cel-miR-39等，所述cel-miR-39为一类线虫类miRNA，其核 巧酸序列为5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'（沈Q ID N0:2)，其工作浓度可为5nmol/L。
[0013] 所述茎环逆转录试剂包括W下组份:20011/化的MMLV逆转录酶、10m mol dNTPs混 合液、5 X RT缓冲液、4〇υ/μΙ的RNA酶抑制剂、ΙμL?ο 1的特异miRNA逆转录引物;所述5 X RT缓冲 液由250m mol Tris-肥l，375m mol KCl，15m mol MgCl2,50m mol DTT组成。
[0014] 所述特异miRNA逆转录引物由miR-19a的特异逆转录引物、外源性参照cel-miR-39 的特异逆转录引物和内源性参照U6的特异逆转录引物组成：
[0015] 所述miR-19a的特异逆转录引物的核巧酸序列为：
[0016] 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCAGTTT-3'(SEQ ID N0:3)〇
[0017] 所述外源性参照cel-miR-39的特异逆转录引物的核巧酸序列为：
[001 引 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAAGCTGA-3'(沈Q ID N0:4)0
[0019] 所述内源性参照U6的特异逆转录引物的核巧酸序列为：
[0020] 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'(SEQ ID N0:5)〇
[0021] 所述实时巧光定量PCR试剂包括W下组份：10 X化q缓冲液、10m mol的MgCl2、抓/μ L的Taq聚合酶、lOmM dNTP混合液、100ml无核酶水、1化mol正向引物、1化mol反向引物和 AllGlo探针;所述lOXTaq缓冲液包括 100m mol Tris-HCl，500m mol KC1。
[0022] 所述正向引物由miR-19a的正向引物、外源性参照ce 1 -miR-39的正向引物和内源 性参照U6的正向引物组成：
[0023] 所述miR-19a的正向引物的核巧酸序列为：
[0024] 5'-TGGTGTGTGCAAATCTATGCA-3'（沈Q ID N0:6)。
[0025] 所述外源性参照cel-miR-39的正向引物的核巧酸序列为：
[0026] 5，-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3，（SEQ ID N0:7)。
[0027] 所述内源性参照U6的正向引物的核巧酸序列为：
[0028] 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'（沈Q ID N0:8)
[0029] 所述反向引物由miR-19a的反向引物、外源性参照cel-miR-39的反向引物和内源 性参照U6的反向引物组成：
[0030] 所述miR-19a的反向引物的核巧酸序列为：
[0031] 5，-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3,（沈Q ID N0:9);
[0032] 所述外源性参照cel-miR-39的反向引物的核巧酸序列为：
[0033] 5'-CCAGTGCGTGTCGTGGAGTC-3'（沈Q ID N0:10);
[0034] 所述内源性参照U6的反向引物的核巧酸序列为：
[0035] 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'(SEQ ID NO:11)；
[0036] 所述AllGlo探针由miR-19a的特异探针、外源性参照cel-miR-39的特异探针和内 源性参照U6的特异探针组成：
[0037] 所述miR-19a的特异探针的核巧酸序列为：
[003引 MAR-TGAGTCGTATCCAGTGCAA-MAR(SEQ ID N0:12);
[0039] 所述外源性参照cel-miR-39的特异探针的核巧酸序列为：
[0040] JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP(SEQ ID N0:13)。
[0041] 所述内源性参照U6的特异探针的核巧酸序列为：
[0042] JUP-CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCC-JUP(SEQ ID NO:14)
[0043] 所述基于AllGlo探针巧光定量PCR的miR-19a的检测方法包括W下步骤：
[0044] 1.采用常规方法提取样本中的miRNA，若