gio的对数转换后进行比较；
[0092] Wcel-miR-39为外源参照基因，RT-qPCR分析110例食管癌、20例平滑肌瘤、18例上 皮内瘤变、14例食管炎、2例食管息肉和80例健康体检者血浆中miR-19a的相对表达水平，其 表达倍数差异性分析的直观表现通过绘制散点图实现，如图2所示，当P值<0.05时，认为结 果在统计学上具有显著性差异，用**表示；当P值<0.01时，认为结果在统计学上具有极显著 性差异，用***表示。
[0093] 实施例3.组织或细胞miR-19a检测
[0094] 1.样品处理：
[00巧]a.组织：将组织在液氮中磨碎，每30~50mg动物组织或lOOmg植物组织加 ImL裂解 液MZ(天根生物科技有限公司生产），用匀浆仪进行匀浆处理，样本体积不应超过裂解液MZ 体积的10 %。
[0096] b.单层培养细胞:直接在培养板中加入裂解液MZ，每10cm2面积加 ImLMZ，用取样器 抽打几次。
[0097] C.细胞悬液:离屯、80化5min取细胞，弃上清。加入ImL裂解液MZ，振荡器震荡或移 液器吹打数次混匀。加裂解液MZ前不要洗涂细胞，W免降解RNA。
[009引 2.组织或细胞miRNA提取和富集
[0099] 采用天根生物科技有限公司生产的miRNA提取试剂盒(DP501)，按操作说明书进行 组织或细胞的miRNA提取，最后用50uL去核酶水溶解RNA，于核酸分光光度仪器化no 化OP2000上分别测定浓度和纯度。
[0100] 3.组织或细胞miRNA逆转录及实施巧光定量检测：
[0101] 后续步骤参照实施例2的步骤2~4,但做W下更改：
[0102] ①施例2的步骤3中表1中的特异性茎环逆转录引物分别指miR-19a的特异逆转录 引物和内源性参照U6的特异逆转录引物；
[0103] ②后续实时巧光定量PCR混合液中外源性参照cel-miR-39的特异引物和探针换成 U6的特异引物和探针。
[0104] 可用范围：
[0105] 基于AllGlo探针巧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒及其检测方法，可用于人类组 织、细胞及血清血浆中miR-19a表达水平的检测，W上显示和描述了本发明的基本原理、主 要特征和本发明的优点。
【主权项】
1. 生物标记物miR-19a，其特征在于其核苷酸序列为： 5'-UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA-3'（SEQ ID N0:1)。2. 基于A1 lGlo探针荧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒，其特征在于设有盒体、隔板、外 源性参照瓶、颈环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；隔板设在盒体内，外源性参照 瓶、颈环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上，外源性参照瓶内装有外源性 参照，颈环逆转录试剂瓶内装有颈环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光 定量PCR试剂。3. 如权利要求2所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒，其特征在于 所述外源性参照采用cel-miR-39,所述cel-miR-39为一类线虫类miRNA，其核苷酸序列为 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'（SEQ ID N0:2),其工作浓度可为5nmol/L。4. 如权利要求2所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒，其特征在于 所述茎环逆转录试剂包括以下组份 :200UAxL的MMLV逆转录酶、10m mol dNTPs混合液、5X RT缓冲液、40U/yL的RNA酶抑制剂、Ιμπιο?的特异miRNA逆转录引物;所述5 X RT缓冲液由250m mol Tris-HCl，375m mol KC1，15m mol MgCl2,50m mol DTT组成。5. 如权利要求2所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒，其特征在于 所述特异miRNA逆转录引物由miR-19a的特异逆转录引物、外源性参照cel-miR-39的特异逆 转录引物和内源性参照U6的特异逆转录引物组成： 所述miR-19a的特异逆转录引物的核苷酸序列为： 5 '-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCAGTTT-3 '（SEQ ID NO: 3) ； 所述外源性参照cel-miR-39的特异逆转录引物的核苷酸序列为：5. -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAAGCTGA-3,(SEQ ID NO: 4) ； 所述内源性参照U6的特异逆转录引物的核苷酸序列为： 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'（SEQ ID N0:5)。6. 如权利要求2所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒，其特征在于 所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10 X Taq缓冲液、10m mo 1的MgCl2、5U/yL的Taq聚 合酶、1 OmM dNTP混合液、100ml无核酶水、1 Ομπιο 1正向引物、1 Ομπιο 1反向引物和A1 lGlo探针； 所述lOXTaq缓冲液包括 100m mol Tris-HCl，500m mol KC1。7. 如权利要求6所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒，其特征在于 所述正向引物由miR-19a的正向引物、外源性参照cel-miR-39的正向引物和内源性参照U6 的正向引物组成： 所述miR-19a的正向引物的核苷酸序列为： 5'-TGGTGTGTGCAAATCTATGCA-3'（SEQ ID N0:6); 所述外源性参照cel-miR-39的正向引物的核苷酸序列为： 5'-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3'（SEQ ID N0:7); 所述内源性参照U6的正向引物的核苷酸序列为： 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'（SEQ ID N0:8); 所述反向引物由miR-19a的反向引物、外源性参照cel-miR-39的反向引物和内源性参 照U6的反向引物组成： 所述miR-19a的反向引物的核苷酸序列为： 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'（SEQ ID N0:9); 所述外源性参照cel-miR-39的反向引物的核苷酸序列为： 5'-CCAGTGCGTGTCGTGGAGTC-3'（SEQ ID N0:10); 所述内源性参照U6的反向引物的核苷酸序列为： 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'（SEQ ID N0:11)。8. 如权利要求6所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒，其特征在于 所述AllGlo探针由miR-19a的特异探针、外源性参照cel-miR-39的特异探针和内源性参照 U6的特异探针组成： 所述miR-19a的特异探针的核苷酸序列为： MAR-TGAGTCGTATCCAGTGCAA-MAR(SEQ ID NO:12)； 所述外源性参照cel-miR-39的特异探针的核苷酸序列为： JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP(SEQ ID NO:13)； 所述内源性参照U6的特异探针的核苷酸序列为： JUP-CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCC-JUP(SEQ ID N0:14)。9. 基于AllGlo探针荧光定量PCR的miR-19a的检测方法，其特征在于采用如权利要求2 所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒，所述检测方法包括以下步骤： 1) .采用常规方法提取样本中的miRNA，若为血清、血浆或其他体液样本，则在样本充分 裂解后加入所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒提供的浓度为5nmol/L 的外源性参照Cel-miR-395yl，立即漩涡振荡15s;若为组织或细胞，则无需加入外源性参照 cel-miR-39； 2) .应用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒提供的茎环逆转录试 剂将miRNA逆转录为cDNA; 3) .应用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒提供的实时荧光定量 PCR试剂将cDNA进行实时荧光定量PCR扩增； 4) .综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行结果分析。
【专利摘要】基于AllGlo探针荧光定量PCR的miR-19a检测试剂盒及其检测方法。检测试剂盒设有盒体、隔板、外源性参照瓶、颈环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；隔板设在盒体内，外源性参照瓶、颈环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上，外源性参照瓶内装有外源性参照，颈环逆转录试剂瓶内装有颈环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂。检测方法：提取样本中miRNA；应用检测试剂盒提供的茎环逆转录试剂将miRNA逆转录为cDNA；应用检测试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时荧光定量PCR扩增；综合分析仪器给出的各项数据，设定阈值和基线，进行结果分析。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105671038
【申请号】CN201610117802
【发明人】林华月, 白永颖, 方宜臻, 张忠英
【申请人】厦门大学附属中山医院, 张忠英
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月2日