一种三维细胞模型的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞培养模型的构建方法，尤其是一种三维细胞培养模型的构建方法。
【背景技术】
[0002]目前，肿瘤相关的基础研究大多建立在二维细胞培养基础上，其特点是简便易操作，易于研究单细胞的表型变化。但是此类研究却难以从肿瘤组织的立体结构特点上模拟体内细胞的组织微环境，故而无法准确反映肿瘤细胞在三维空间组织中的表型特点。
[0003]三维细胞培养作为有别于传统二维平板细胞培养的崭新的细胞培养模式，能在体外最大限度地反映体内细胞微环境的结构基础:I)可较真实地反映肿瘤在体内的发生过程:细胞通过其表面的特异性受体特别是整合素家族受体实现细胞与细胞之间以及细胞与基质之间的病理联系及信号传导；2)可再现肿瘤组织中细胞内及细胞间的信号通路蛋白及关键生命分子表达的动态演变过程。因而，三维细胞培养应用于肿瘤表型研究具有独特的优势。
[0004]三维细胞培养技术在国际上正处于发展完善阶段，并在研究肿瘤细胞转化、转移及放化疗敏感性的分子机制方面显示出光明的应用前景。常规的三维细胞培养过程为:I)将基质胶培养基(Matrigel)从-20°C中取出后置于冰上，半小时后基质胶将由固态转变为液态;2).在特定的三维细胞培养小室中将基质胶铺就呈穹窿型；3).室温放置半小时至一小时基质胶将由液态恢复固态，加入细胞培养基并接种肿瘤细胞后置于细胞培养箱中培养一至两周后检测。申请人基于此模型的放疗敏感性研究发现，鼻咽癌细胞CNE-2在基质胶培养基中形成巨大畸形球状实体，当予以小分子抑制剂VX-680及X线放射处理后，激光共聚焦荧光染色显示CNE-2细胞团内P53及P21表达上调并诱导CNE-2三维细胞团发生凋亡(Cleaved Caspase_3表达明显升高)，随后细胞团松散一犹如体内反射线处理后肿瘤组织的消退过程(结果已发表于国际肿瘤学期刊Cancer B1logy&Therapy，2009，8( 15): 1500-1506.)
[0005]目前，三维细胞模型构建过程中主要存在以下问题:(I)三维细胞模型难以构建:首先需要构建犹如穹窿状的基质胶团块，基质胶反复冻融后难以形成穹窿状，即便是首次使用的崭新的基质胶，其穹窿状塑形亦需非常娴熟的技巧，而一旦穹窿状塑形不佳，如出现偏心或塌陷，将直接导致后续检测过程难度的加大，甚至无法检测;如出现三维基质胶培养模型与培养小室四壁接触，则会直接导致模型构建失败而无法进行后续试验。(2)构建后培养成型时间长:常规情况下肿瘤细胞在基质胶上需要约7-14天方能形成球型空间结构。(3)检测难度大:常规基质胶在培养基中浸泡一周后易出现膨胀软化，因而在后续三维免疫荧光染色时非常易于出现三维基质胶碎裂，进而无法完成后续染色及三维重建。
[0006]导致现有三维细胞模型构成过程中的问题的原因主要有以下几个方面:(a)常规手工方法塑形的不均一性:传统三维模型构建与操作者的熟练程度密切相关，但是由于人为因素常造成三维培养模型的不均一性，具体表现为:外形不均一(偏心、塌陷)及三维模型内部不均一(主要由于塑形凝固过程中基质胶的流动造成)。卬)塑形失败:常规手工方法塑形时易发生基质胶与培养小室四壁接触的情况，而一旦发生接触，由于液体张力原因，基质胶迅速流向培养小室四壁，形成四周高中间低的“碗状”构型，导致塑形失败。此种情况在手工塑形过程中极易发生，成为塑形失败的重要原因之一。(C)检测困难:基于基质胶的三维细胞培养模型需要浸泡在培养基中生长7-14天，基质胶经过一周的浸泡后极易出现膨胀软化及碎裂，在后续三维免疫染色时非常容易出现模型破裂变形等问题，影响检测。
【发明内容】
[0007]本发明的内容在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种容易实现、所需时间较短，且构建成的三维细胞模型结构紧密、不易散开、稳定性优良的三维细胞模型构建方法。
[0008]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:一种三维细胞模型的构建方法，包括以下步骤:
[0009](I)将细胞种植于含有培养基的培养皿中，然后将铁磁性纳米颗粒加入到培养基中并混匀，培养至细胞密度达到80?90%，得到含有铁磁性纳米颗粒的细胞；
[0010](2)将步骤(I)所得含有铁磁性纳米颗粒的细胞重新种植于含有培养基的培养皿中，在培养皿的上方放置与所述培养皿嵌合的磁力控制装置，然后培养18?36小时，即得三维细胞模型；
[0011 ]所述步骤(2)中的磁力控制装置与所述培养皿嵌合设置，且所述磁力控制装置设有磁性体。
[0012]本发明所述三维细胞模型的构建方法，所述步骤(I)中将细胞种植于培养皿中以后，在培养基中加入铁磁性纳米颗粒，然后再进行培养至细胞密度达到80?90 % (一般培养18?36小时，具体时间依不同细胞类型而异)，此时培养后所得细胞中，大部分的细胞内均内吞有一定数量的铁磁性纳米颗粒。然后将含有铁磁性纳米颗粒的细胞重新种植于含有培养基的培养皿中，并在培养皿的上方放置与所述培养皿嵌合的磁力控制装置，由于所述磁性控制装置设有磁性体，而细胞内吞噬了铁磁性纳米颗粒，因此细胞可以被磁力控制装置的磁性体吸附而悬浮与培养基中，并由于细胞具有自我组装能力，大约经过18?36小时的培养即可形成三维细胞团，即三维细胞培养模型。
[0013]本发明所述三维细胞模型的构建方法，依靠外来的磁力将吞噬了铁磁性纳米颗粒的细胞聚集起来，悬浮培养，此方法不依赖于传统基质胶三维培养细胞的方法，非常易于操作，无传统基质胶三维培养细胞的所有限速因素，重要的是所需的构建时间大为缩短(常规的基质胶三维细胞模型构建时间约为7?14天，而本发明方法三维细胞培养模型的构建时间为约2?4天)，同时所构建的模型稳定，排除了基质胶培养三维细胞模型时易发生软化碎裂的问题，本发明所述方法不受试验人员技术熟练程度等因素的影响。
[0014]本发明所述方法构建的三维细胞模型，可用于后续检测、测试等，当需要进行检测时，可将磁力控制装置置于培养板下方，此时由于磁力的因素，三维细胞团可被吸附于培养皿表面，方便后续检测等。
[0015]作为本发明所述三维细胞模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤(2)中的培养皿为6孔培养板、12孔培养板、24孔培养板、96孔培养板或384孔培养板;所述磁力控制装置包括本体和设于所述本体上的磁性体，所述磁性体在所述本体上的分布位置及所述磁性体的数量与所述培养皿上的孔相对应。本发明所述步骤(2)中的培养皿为培养板，所述培养板可为6孔培养板、12孔培养板24孔培养板、96孔培养板、384孔培养板等。所述磁力控制装置包括本体和设于所述本体上的磁性体，所述磁性体在所述本体上的分布位置及所述磁性体的数量与所述培养皿上的孔相对应，即当所述培养皿采用6孔培养板时，所述磁力控制装置的本体上在于所述6孔培养板的6个孔相对应的位置设有6个磁性体，当所述磁力控制与所述6孔培养板嵌合时，所述磁力控制装置本体上的6个磁性体刚好与所述6孔培养板的6个孔一一对应。所述培养皿采用12孔培养板24孔培养板、96孔培养板、384孔培养板时同理。
[0016]作为本发明所述三维细胞模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤(I)中加入的铁磁性纳米颗粒的量为:每10000细胞中加入0.5?5微升的铁磁性纳米颗粒。作为本发明所述三维细胞模型的构建方法的更优选实施方式，所述步骤(I)中加入的铁磁性纳米颗粒的量为:每10000细胞中加入I微升的铁磁性纳米颗粒。
[0017]作为本发明所述三维细胞模型的构建方法的优选实施方式，所述铁磁性纳米颗粒采用以下方法制备而成:
[0018](a)取一容器，加入FeCl2和FeCl3得溶液A，所述溶液A中Fe2+/Fe3+的摩尔比为0.75;
[0019](b)在搅拌状态下将氨水加入步骤(a)所得溶液A中；
[0020](c)将含有氨水的溶液A在80°C下加热，至出现沉淀物质，得到Fe3O4;
[0021](d)向步骤(C)所得沉淀物质中加入含有表面活性剂的乙醇，然后再在80°C下继续加热15?30min，至反应完全;所述表面活性剂为油酰肌氨酸和月桂酰肌氨酸;所述表面活性剂为油酰肌氨酸和月桂酰肌氨酸，所述油酰肌氨酸和月桂酰肌氨酸的加入能够更好保持月父体稳定性，提尚氧化电阻率；
[0022](e)用磁铁吸住分离，然后用蒸馏水对沉淀洗涤多次，除去可溶性杂质；
[0023](f)在60?80 °C的真空环境下对洗涤后的沉淀进行过度水分，即得铁磁性纳米颗粒。
[0024]铁磁性纳米可以是一种新型的功能材料，它是由直径为纳米量级(10纳米以下)的磁性铁颗粒表面修饰多聚赖氨酸制备而成的。在制备的众多方法中，化学共沉淀法更简便，成本更低，上述所述铁磁性纳米颗粒的制备方法即为化学共沉淀法。化学共沉淀法是指包含两种或两种以上金属离子的可溶性盐溶液中，加入适当沉淀剂，将金属离子均匀沉淀或结晶出来，再将沉淀物脱水或热分解而制得纳米微粉。其特点是产品纯度高，反应温度低，颗粒均匀，粒径小，分散性也好。但此法对于多组分来说，要求各组分具有相同或相近的水解或沉淀条件，因而工艺具有一定的局限性。
[0025]本发明所述三维细胞模型的构建方法中，所用的铁磁性纳米颗粒可以直接购买于市场，亦可采用上述方法制备所得。
[0026]作为本发明所述三维细胞模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤(b)中加入的氨水与所述溶液A的体积比为2:3?2:6，所述氨水的质量百分浓度为20?35%。作为本发明所述三维细胞模型的构建方法的更优选实施方式，所述步骤(b)中加入的氨水与所述溶液A的体积比为2:5，所述氨水的质量百分浓度为30%。
[0027]作为本发明所述三维细胞模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤(d)中表面活性剂与Fe3O4的摩尔比为1:3?7;所述表面活性剂中，所述月桂酸肌氨酸的摩尔含量为O?30%。作为本发明所述三维细胞模型的构建方法的更优选实施方式，所述步骤(d)中表面活性剂与Fe3O4的摩尔比为1:5。
[0028]作为本发明所述三维细胞模型的构建方法的优选实施方式，所述铁磁性纳米颗粒的制备方法中还包括以下步骤:
[0029 ] (g)检测步骤(f)得到的铁磁性纳米颗粒的Ze ta电位，如为负电荷，将所述铁磁性纳米颗粒中加入多聚赖氨酸，得到多聚赖氨酸修饰的Fe3O4铁磁性纳米颗粒。
[0030]作为本发明所述三维细胞模型的构建方法的优选实施方式，所述铁磁性纳米颗粒的平均粒径为9nm。上述所述铁磁性纳米颗粒的制备中，制备得到的铁磁性纳米颗粒的平均粒径为9nm，且能够在-12°C下保存