一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及催化剂制造技术领域，具体涉及一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺。
【背景技术】
[0002]固定化青霉素酰化酶是工业上非常重要的生物催化剂，它能水解工业盐生产6-APA，也能水解扩环酸生产7-ADCAA-APA和7-ADCA是生产β—内酰胺类半合体的两个重要中间体。固定化青霉素酰化酶也可以催化逆转反应，用于催化合成其他半合体。
[0003]颗粒型固定化青霉素酰化酶，应用固化PCA生产6-ΑΡΑ，7—ADCA具有操作简便，产品收率高、成本低，三废污染少等优点。
[0004]而制备颗粒型固定化青霉素酰化酶，首先要培养高活性的青霉素酰化酶的产生菌，然后利用产生菌发酵产生青霉素酰化酶，再将其提取出来固定在载体上方便应用，现有技术还没有合适的青霉素酰化酶的提取及固定工艺。
【发明内容】
[0005]本发明的目的，是为了解决上述问题，提供一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺。
[0006]本发明解决上述问题的技术方案如下:
一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺，包括如下步骤:
①酶的吸附:将发酵液转入到吸附罐中，用醋酸将所述发酵液的PH值调节至6.48-6.52之间，向吸附罐中投入氧化铝，搅拌1.5-2.5小时，搅拌时间隔的测量发酵液的PH值，并用醋酸将其PH控制在6.48-6.52之间，搅拌完成后，测量发酵液中酶的活性，酶的活性大于
0.5umol/ml时，继续投入氧化铝进行搅拌，直至测量酶的活性小于0.5Umol/ml时，吸附完毕，排出废液；
②酶的洗脱:将步骤①中吸附完成的氧化铝离心甩干，转入洗脱柱中，用PH值为6.8-7.2、浓度为0.08-0.12mol/L的磷酸缓冲液进行脱色洗涤，排出脱色洗涤液，再用PH值为
8.0、浓度为0.9-1.lmol/L的磷酸缓冲液进行洗脱；
③浓缩:将不周②中的洗脱液栗入浓缩设备，所述浓缩设备为超滤过滤设备，浓缩至洗脱液内酶的活性大于250umo Ι/ml时形成浓缩液，送冷库冷冻备用；
④除菌:将浓缩液通过细菌过滤器除菌，所述细菌过滤器为平均孔径小于0.22微米的过滤膜；
⑤固定:将浓缩液加入到固定化反应罐中，加入带有环氧基团的多孔固定载体，加入所述多孔固定载体的质量为加入浓缩液质量的1/4-1/3，在20-25°C的温度范围内连续搅拌20-28小时，之后改为间歇搅拌，每隔3-5小时搅拌8-12分钟，直至从开始搅拌起满72小时为止；
⑥干燥:将固定完成的浓缩液进行干燥，并用无菌水洗涤至少三遍，甩干后即成。
[0007]作为上述技术方案的优选，所述步骤①的废液经杀菌后再排出。
[0008]作为上述技术方案的优选，所述步骤①中吸附完成的氧化铝经无菌水洗涤后，再进入步骤②进行洗脱，无菌水洗涤液经杀菌后再排出。
[0009]作为上述技术方案的优选，所述步骤①中投入氧化铝的千克数等于所述发酵液酶活力的1倍，所述发酵液酶活力的单位为umo Ι/ml。
[0010]作为上述技术方案的优选，所述步骤①中醋酸的质量分数为36%-38%。
[0011]作为上述技术方案的优选，所述步骤⑤中的多孔固定载体的孔隙率大于30%。
[0012]作为上述技术方案的优选，所述步骤⑥中的干燥方法为真空抽滤或离心甩干。
[0013]—种青霉素酰化酶的产生菌的培养方法，包括如下步骤:
①培养基制备:制备固体种子培养基、液体种子培养基或发酵种子培养基中的一种，在119-123°C下灭菌28-32分钟，备用；
②菌种活化:将细菌种子保存液或细菌种子保存块加入到培养基中，36.8-37.2°C下进行培养，待用；
③制备菌种培养平板:将自来水和培养皿在119-123°C下灭菌28-32分钟，备用；制备如步骤①中所述的固体种子培养基，在未凝固前，将I体积分数的固体培养基倒入灭菌后的培养皿中，摇匀，冷却凝固后备用；制备如步骤①中所述的固体种子培养基，并分成若干份在灭菌的试管中形成斜面；
④稀释种子液:制备如步骤②中活化后的所述的液体种子培养基，分别稀释1000倍、10000倍、100000倍及 1000000倍备用；
⑤种子液涂制并挑取:将步骤④中配置好的四种浓度的液体种子取0.0066-0.0067体积分数分别滴加到不同的菌种培养平板中，使其涂布均匀，倒扣放置在培养箱中，并在36.8-37.2°C下培养46-50小时，挑取生长的菌落，将其置于步骤③中形成固体种子培养基形成斜面的试管中；
⑥菌种培养:将步骤⑤中的试管进行编号或直接放入培养箱中，在36.8-37.2°C下培养卜2天；
⑦摇瓶初筛选:将步骤⑥中的试管进行编号，初步培养后，将5%体积分数的固体种子培养基连带菌落接入摇瓶中进行发酵培养，所述摇瓶内设置有步骤①中所述的发酵种子培养基，培养过程中将摇床的转速调节至230-270转/分钟，在36.8-37.2°C下培养70-74小时，检测各瓶细菌所产生的青霉素酰化酶的活力；
⑧摇瓶复筛选:挑选经步骤⑦检测后青霉素酰化酶的活力排名在总数25%之前的固体种子培养基，并将与之对应的步骤⑥中所述试管筛选出来;重复步骤⑦的初步培养和发酵培养，再挑选经重复步骤⑦的初步培养和发酵培养检测后青霉素酰化酶的活力排名在总数50%之前的固体种子培养基，并将与之对应的步骤⑥中所述试管筛选出来，作为生产种子，将所述生产种子转接培养，形成母种。
[0014]作为上述技术方案的优选，步骤①中所述固体种子培养基由I质量份蛋白胨、0.6-
0.65质量份酵母膏、0.9-1.1质量份氯化钠、1.9-2.1质量份琼脂以及95.2-95.5质量份的水混合制成。
[0015]作为上述技术方案的优选，步骤①中所述液体种子培养基由I质量份蛋白胨、0.6-
0.65质量份酵母膏、0.9-1.1质量份氯化钠、93.2-93.5质量份的水混合制成。
[0016]作为上述技术方案的优选，步骤①中所述发酵种子培养基由1.5质量份蛋白胨、2.9-3.1质量份淀粉、2.4-2.6质量份酵母膏、0.08-0.12质量份柠檬酸钠、0.28-0.32质量份磷酸氢二钾以及92.3-92.9质量份的水混合制成，混合时，先把淀粉用一半的水加热溶解，其他成分与另一半水溶解，再将两份溶液混合。
[0017]作为上述技术方案的优选，步骤②中所述的菌种活化方法为将步骤①中所述的固体种子培养基装入试管或茄子瓶，摆成斜面，所述斜面的长度为所述试管的1/3-1/2，或，所述茄子瓶中的固体种子培养基顶端距离所述茄子瓶瓶颈的底端的距离大于2cm;将储存的菌种放置于所述试管或所述茄子瓶内，并涂布均匀，36.8-37.2 °C下培养3-4天即可。
[0018]作为上述技术方案的优选，步骤②中所述的菌种活化方法为将所述液体种子培养基取5体积份置于试管中，将0.000003-0.000005体积份菌种保存液置于其中，36.8-37.2°C下震动培养23.5-24.5小时即可。
[0019]作为上述技术方案的优选，步骤②中所述的菌种活化方法为将所述发酵种子培养基置于茄子瓶内，将储存的菌种放置于所述茄子瓶内，并涂布均匀，36.8-37.2 °C下培养24-48小时;将步骤①中所述液体种子培养基倒入到所述茄子瓶内，用刮刀刮下繁殖的菌种，将液相物质倒入到接种瓶中即可。
[0020]作为上述技术方案的优选，步骤⑦中所述的初步培养为用接种针取存储的菌种置于内含有步骤①中所述的液体种子培养基的三角瓶中，36.8-37.2°C下培养14.5-15.5小时。
[0021]作为上述技术方案的优选，步骤⑦中所述的初步培养为将存储的菌种置于含有卡那霉素的斜面试管中，所述斜面试管中包含有步骤①中所述的固体种子培养基，36.8-37.2°C下培养1-2天。
[0022]作为上述技术方案的优选，步骤⑧中所述生产种子转接培养方法为小规模培养方法:在三角瓶中装入步骤①所述的发酵种子培养基50体积份，将2.4-2.6体积份的生产种子置于其中，在36.8-37.2 °C、摇床转速为250转/分钟条件下，震动培养70-74小时;或，步骤⑧中所述生产种子转接培养方法为中规模培养方法:涉及培养罐容积200-400L，内置150-350L物料，培养罐加热至119-123°C保持28-32分钟，再冷却至88-92°C，加入200质量份步骤
①中所述的液体种子培养基、175-185质量份水，0.037-0.04质量份消泡剂，开启搅拌，再加入1-1.5质量份酵母膏、1.8-2.2质量份蛋白胨、1.8-2.2质量份氯化钠、0.01-0.03质量份泡敌，加热至119-123°C保持28-32分钟，再冷却至36-38°C，放入生产种子，同时加入含有2克卡那霉素的卡那霉素溶液，搅拌均匀，保持温度，并控制培养罐内表压为0.05pa，培养14.5-15.5小时;或，步骤⑧中所述生产种子转接培养方法为大规模培养方法:涉及2-2.5吨重的物料及与其相配适的培养罐，培养罐加热至119_123°C保持28-32分钟，再冷却至88-92°C，加入2000质量份步骤①中所述的发酵种子培养基、1750-1850质量份水，0.37-0.42质量份消泡剂，开启搅拌，再加入45-55质量份酵母膏、27-33质量份蛋白胨、5.5-6.5质量份磷酸氢二钾、1.8-2.2质量份柠檬酸钠、55-65质量份淀粉、0.18-0.22质量份泡敌，加热至119-123°C保持28-32分钟，再冷却至36-38 V，放入生产种子，搅拌均匀，保持温度，并控制培养罐内表压为0.05pa，培养70-74小时。
[0023]菌种保藏方法:
甘油保藏法:1ml塑料离心管中，装浓度为50%的甘油溶液5ml，121°C，30分钟灭菌，冷却至室温。用无菌吸管吸取培养15小时的成熟液体种子5ml(或从斜面用接种环挑取斜面培养2-3天的斜面新鲜细胞)，放入上述灭菌并冷却后的甘油管中。混和均匀，置-80°C冰箱冷冻保存。有效保存期I年左右。
[0024]液体石蜡保藏法:
⑴无菌液蜡的制备:将液蜡装入三角瓶。塞上棉塞。121°C，30分钟灭菌后，放入培养箱，370C静置培养I天后，再灭菌一次，培养