I天。重复3次，第3次灭菌后，放入干燥箱，60°C保温，尽量使灭菌时进入液蜡中的水分挥发后使用。
[0025]⑵液蜡保存菌种:菌种接种至斜面固体培养基上;放置在培养箱中，37°C静置培养3-4天后，用无菌吸管吸取无菌液蜡，放入斜面菌种试管中，使液蜡高于斜面顶端Icm左右。然后，用固体蜡密封试管口，垂直放置于室温保存。有效保存期5-6年。
[0026]青霉素酰化酶液体酶活力的测定方法:
在一定条件下，青霉素酰化酶能水解青霉素G，生成等摩尔量的苯乙酸，用氢氧化钠标准溶液，准确滴定生成的苯乙酸量，依据苯乙酸的生成量计算酶的活力。
[0027]0.05Mol氢氧化钠标准溶液，按常规方法配制，标定。
[0028]2%青霉素G钾盐溶液的配制，称取青霉素G钾盐2.00克，溶解于80ml 0.0lmoI/L，pH8.0的磷酸缓冲液中，再用磷酸缓冲液定容到10ml，然后用0.lmol/L的氢氧化钠溶液调节至PH8.0，注意:此溶液必须随配随用。
[0029]I操作:吸取2%的青霉素G钾盐溶液20ml，置28°C水浴锅中预热15分钟。准确吸取适量体积的液体酶，加入上述预热好的青霉素溶液中，在充分搅拌条件下，计时反应10分钟，并用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，控制反应pH8.0，每隔2分钟记录消耗的氢氧化钠标准溶液的体积(毫升数)。
[0030]酶活力的定义:在上述条件下，以水解Iumol青霉素G所需要的酶量，定义为I个酶的活力单位。以u表示。
[0031]液体酶活力(umol/ml)=1000V*N/( 10.*VC)
其中，V:滴定消耗的氢氧化钠标准溶液体积(ml) ;N:标准氢氧化钠的浓度，(mol/L)；10:反应的时间(min): VC:酶液的加入量(ml ) ; 1000: umo I与mmol的换算系数，Imol =100mmol，Immol=100umol0
[0032]综上所述，本发明具有以下有益效果:
本发明所述的一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺提取效率高，且能将青霉素酰化酶牢固的固定在载体上。
【具体实施方式】
[0033]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0034]下面以实施例对本发明进行详细说明。
[0035]实施例1:一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺，包括如下步骤:
①酶的吸附:将发酵液转入到吸附罐中，用醋酸将所述发酵液的PH值调节至6.48，向吸附罐中投入氧化铝，搅拌1.5小时，搅拌时间隔的测量发酵液的PH值，并用36%的醋酸将其PH控制在6.48，搅拌完成后，测量发酵液中酶的活性，酶的活性大于0.5umol/ml时，继续投入氧化铝进行搅拌，直至测量酶的活性小于0.5umol/ml时，吸附完毕，排出废液，吸附完成的氧化铝经无菌水洗涤后，再进行洗脱，无菌水洗涤液和废液经杀菌后再排出；
②酶的洗脱:将步骤①中吸附完成的氧化铝离心甩干，转入洗脱柱中，用PH值为6.8、浓度为0.0 8 m ο I / L的磷酸缓冲液进行脱色洗涤，排出脱色洗涤液，再用P H值为8.0、浓度为
0.9mol/L的磷酸缓冲液进行洗脱；
③浓缩:将不周②中的洗脱液栗入浓缩设备，所述浓缩设备为超滤过滤设备，浓缩至洗脱液内酶的活性大于250umo Ι/ml时形成浓缩液，送冷库冷冻备用；
④除菌:将浓缩液通过细菌过滤器除菌，所述细菌过滤器为平均孔径小于0.22微米的过滤膜；
⑤固定:将浓缩液加入到固定化反应罐中，加入带有环氧基团的多孔固定载体，加入所述多孔固定载体的质量为加入浓缩液质量的1/4，在20-25°C的温度范围内连续搅拌20小时，之后改为间歇搅拌，每隔3小时搅拌8分钟，直至从开始搅拌起满72小时为止；
⑥干燥:将固定完成的浓缩液进行干燥，并用无菌水洗涤至少三遍，真空抽滤干燥后即成。
[0036]实施例2: 一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺，包括如下步骤:
①酶的吸附:将发酵液转入到吸附罐中，用醋酸将所述发酵液的PH值调节至6.52，向吸附罐中投入氧化铝，搅拌2.5小时，搅拌时间隔的测量发酵液的PH值，并用38%的醋酸将其PH控制在6.52，搅拌完成后，测量发酵液中酶的活性，酶的活性大于0.5umol/ml时，继续投入氧化铝进行搅拌，直至测量酶的活性小于0.5umol/ml时，吸附完毕，排出废液；
②酶的洗脱:将步骤①中吸附完成的氧化铝离心甩干，转入洗脱柱中，用PH值为7.2、浓度为0.12 m ο I / L的磷酸缓冲液进行脱色洗涤，排出脱色洗涤液，再用P H值为8.0、浓度为
1.lmol/L的磷酸缓冲液进行洗脱；
③浓缩:将不周②中的洗脱液栗入浓缩设备，所述浓缩设备为超滤过滤设备，浓缩至洗脱液内酶的活性大于250umo Ι/ml时形成浓缩液，送冷库冷冻备用；
④除菌:将浓缩液通过细菌过滤器除菌，所述细菌过滤器为平均孔径小于0.22微米的过滤膜；
⑤固定:将浓缩液加入到固定化反应罐中，加入带有环氧基团的多孔固定载体，孔隙率为45%，加入所述多孔固定载体的质量为加入浓缩液质量的1/3，在25°C的温度范围内连续搅拌28小时，之后改为间歇搅拌，每隔5小时搅拌12分钟，直至从开始搅拌起满72小时为止；
⑥干燥:将固定完成的浓缩液进行干燥，并用无菌水洗涤至少三遍，真空抽滤干燥后即成。
[0037]实施例3:—种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺，包括如下步骤:
①酶的吸附:将发酵液转入到吸附罐中，用醋酸将所述发酵液的PH值调节至6.5，向吸附罐中投入氧化铝，搅拌2小时，搅拌时间隔的测量发酵液的PH值，并用醋酸将其PH控制在6.5，搅拌完成后，测量发酵液中酶的活性，酶的活性大于0.5umol/ml时，继续投入氧化铝进行搅拌，直至测量酶的活性小于0.5umol/ml时，吸附完毕，排出废液；
②酶的洗脱:将步骤①中吸附完成的氧化铝离心甩干，转入洗脱柱中，用PH值为7、浓度为0.lmol/L的磷酸缓冲液进行脱色洗涤，排出脱色洗涤液，再用PH值为8.0、浓度为lmol/L的磷酸缓冲液进行洗脱；
③浓缩:将不周②中的洗脱液栗入浓缩设备，所述浓缩设备为超滤过滤设备，浓缩至洗脱液内酶的活性大于250umo Ι/ml时形成浓缩液，送冷库冷冻备用；
④除菌:将浓缩液通过细菌过滤器除菌，所述细菌过滤器为平均孔径小于0.22微米的过滤膜；
⑤固定:将浓缩液加入到固定化反应罐中，加入带有环氧基团的多孔固定载体，孔隙率为32%，加入所述多孔固定载体的质量为加入浓缩液质量的1/3，在20-25°C的温度范围内连续搅拌25小时，之后改为间歇搅拌，每隔4小时搅拌10分钟，直至从开始搅拌起满72小时为止；
⑥干燥:将固定完成的浓缩液进行干燥，并用无菌水洗涤至少三遍，离心甩干后即成。
【主权项】
1.一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺，其特征在于:包括如下步骤: ①酶的吸附:将发酵液转入到吸附罐中，用醋酸将所述发酵液的PH值调节至6.48-6.52之间，向吸附罐中投入氧化铝，搅拌1.5-2.5小时，搅拌时间隔的测量发酵液的PH值，并用醋酸将其PH控制在6.48-6.52之间，搅拌完成后，测量发酵液中酶的活性，酶的活性大于0.5umol/ml时，继续投入氧化铝进行搅拌，直至测量酶的活性小于0.5Umol/ml时，吸附完毕，排出废液； ②酶的洗脱:将步骤①中吸附完成的氧化铝离心甩干，转入洗脱柱中，用PH值为6.8-7.2、浓度为0.08-0.12mol/L的磷酸缓冲液进行脱色洗涤，排出脱色洗涤液，再用PH值为8.0、浓度为0.9-1.lmol/L的磷酸缓冲液进行洗脱； ③浓缩:将不周②中的洗脱液栗入浓缩设备，所述浓缩设备为超滤过滤设备，浓缩至洗脱液内酶的活性大于250umo Ι/ml时形成浓缩液，送冷库冷冻备用； ④除菌:将浓缩液通过细菌过滤器除菌，所述细菌过滤器为平均孔径小于0.22微米的过滤膜； ⑤固定:将浓缩液加入到固定化反应罐中，加入带有环氧基团的多孔固定载体，加入所述多孔固定载体的质量为加入浓缩液质量的1/4-1/3，在20-25°C的温度范围内连续搅拌20-28小时，之后改为间歇搅拌，每隔3-5小时搅拌8-12分钟，直至从开始搅拌起满72小时为止； ⑥干燥:将固定完成的浓缩液进行干燥，并用无菌水洗涤至少三遍，甩干后即成。2.根据权利要求1所述的一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺，其特征在于:所述步骤①的废液经杀菌后再排出。3.根据权利要求2所述的一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺，其特征在于:所述步骤①中吸附完成的氧化铝经无菌水洗涤后，再进入步骤②进行洗脱，无菌水洗涤液经杀菌后再排出。4.根据权利要求1所述的一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺，其特征在于:所述步骤①中投入氧化铝的千克数等于所述发酵液酶活力的10倍，所述发酵液酶活力的单位为umol/ml。5.根据权利要求1所述的一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺，其特征在于:所述步骤①中醋酸的质量分数为36%-38%。6.根据权利要求1所述的一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺，其特征在于:所述步骤⑤中的多孔固定载体的孔隙率大于30%。7.根据权利要求1所述的一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺，其特征在于:所述步骤⑥中的干燥方法为真空抽滤或离心甩干。
【专利摘要】本发明涉及一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺，属于催化剂制造技术领域。一种固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺，包括如下步骤：①酶的吸附、②酶的洗脱、③浓缩、④除菌、⑤固定、⑥干燥。该固定化青霉素酰化酶的提取及固定工艺提取效率高，且能将青霉素酰化酶牢固的固定在载体上。
【IPC分类】C12N9/84, C12N11/04
【公开号】CN105671026
【申请号】CN201610218270
【发明人】姚凤鸣, 谢再法, 郭锋燕
【申请人】浙江拓普药业股份有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月11日