一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacB基因及应用
【技术领域】
[0001] 发明设及基因工程领域，具体地，本发明设及一种D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶dacB 及其基因和应用。
【背景技术】
[0002] 肤聚糖是由双糖单位，四肤尾还有肤桥聚合而成得多层网状大分子结构。肤聚糖 层的骨架由N-乙酷葡萄糖胺和N-乙酷胞壁酸通过β-1，4糖巧键连接而成，糖链间由肤链交 联，构成稳定的网状结构，运样构成了整个细菌表面的细胞壁。作为细胞壁的主要成分，肤 聚糖的组成与细胞结构的完整性、外膜的通透性的维持、细菌的抗干燥能力和耐热性等均 密切相关。dacB基因表达的D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶能够从肤聚糖五肤上移除最后一个 末端D-Ala，导致转肤反应中供体不可用，可W控制肤聚糖的网状交联水平，从而改变细胞 的通透性。
[0003] 大肠杆菌化schericMa coli)表达系统是目前基因工程中最常用的蛋白表达系 统，有操作简单、成本低廉等优点，可W快速大规模地生产目的蛋白。但是在E.coli的表达 过程中，大部分蛋白在信号肤的引导下分泌到周质空间，会导致中间体大量积聚，对蛋白质 的生产造成阻碍。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种可W提高E.coli胞外分泌水平的D-丙氨酷-D-丙氨酸簇 肤酶、其氨基酸序列、编码该D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶的基因、含有该基因的重组质粒、含 有该重组载体的重组菌株、该D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶的应用。
[0005] 具体包括：
[0006] 本发明提供了一种D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶dacB，其氨基酸序列如序列1所示。
[0007] 序列 1:
[000引 MRFSRFII化TSCIAFSVQAANVDEYVT化PAGANLALMVQKVGASAPAIDYHSQQMALPASTQKVITALAALIQLG PDFRFTTTLETKGNVENG化KGDLVARFGADPTLKRQDIRNMVATL邸SGVNQIDGNVLIDTSIFA甜DKAPGWPWN DMTQCFSAPPAAAIVDRNCFSV化YSAQKPGDMAFIRVASYYPVTMFSQVR化PRGSAEAQYCEUWVPGDLNRFTL TG化PQRSEP…LAFAVQDGASYAGAIL邸ELKQAGITWSGTLLRQTQVNEPGTVVASKQSAPLHDLLKIMLKKSDN MIADTVFRMIGHARFNVPGTWRAGSDAVRQILRQQAGVDIGNTIIADGSGLSRHNLIAPATMMQVLQYIAQ 皿肥 LN FISMLPLAGYDG化QYRAGL册AGVDGKVSAKTG化QGVY化AGFITTASGQRMAFVQ化SGYAVEPADQRNRRIPL VRFESRLYKDIYQNN
[0009] 其中，该酶基因编码477个氨基酸，其理论分子量为51.8化化。
[0010] 本发明提供了编码上述D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶的基因 dacB，具体的，该酶的基 因序列如序列2所示。
[00川序列2:
[0012]
[0013] 本发明通过PCR方法克隆了 D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶基因 dacB，DNA全序列分析 结果表明，D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶的编码基因 dacB全长1434bp。
[0014] 将上述D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶基因 dacB序列及推导出的氨基酸序列在 GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于E.coli str.K-12 substr.MG1655的D-丙氨酷- D-丙氨酸簇肤酶序列相似性最高(99% )。
[0015] 本发明还提供了包含上述D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶基因 dacB的重组质粒，为 pRSFDuet-dacB。将本发明的D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶基因插入至表达载体相应的限制酶 切位点，使其核巧酸序列与表达调控序列相连接，作为本发明的一个最优选实验方案，优选 D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶基因插入到质粒pRS抑uet，使该核巧酸序列位于T71ac启动子的 下游并受其调控，得到重组E.coli表达质粒pRS抑uet-dacB。
[0016] 本发明还提供了上述D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶基因 dacB的应用菌株，优选所述 菌株为E.coli。
[0017] 本发明能够增强E.coli胞内蛋白到达胞外，促进其分泌，降低其在胞内积累，提供 一种可提高E.coli蛋白胞外分泌水平的D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶、及其氨基酸序列、基因 序列。
【附图说明】
[0018] 图1为D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶重组质粒pRS抑uet-dacB图谱。
[0019] 图2为D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶的过量表达
[0020] 图3为过量表达D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶对E.coli胞外分泌α-半乳糖巧酶的影 响。
【具体实施方式】
[0021] 实施例l:E.coli BL21(DE3)D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶基因 dacB的克隆
[0022] 基于PCR获得D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶dacB的DNA序列，将D-丙氨酷-D-丙氨酸簇 肤酶的基因片段与表达载体pRS抑uet连接，获得重组质粒pRS抑uet-dacB(图1)。然后转化 到E.coli BL2UDE3)感受态细胞中，获得重组菌株E.coli BL21(DE3)/dacB。
[0023] 实施例2: D-丙氨酷-D-丙氨酸簇肤酶酶活
[0024] 将已构建的重组菌，接种250mL摇瓶培养，经诱导剂（IPTG)诱导后，收集E. coli细 胞，采用超声破碎法破壁细胞。高速离屯、后，收集破壁上清，取样测定破壁上清中的簇肤酶 酶活力。通过测定酶活力计算出过量表达后，簇肤酶dacB- Δ P在胞内的比酶活力为2.65U/g (图2)，对照组簇肤酶比酶活力仅为1.51U/g。
[0025] 实施例3:过量表达dacB对E.coli胞外分泌α-半乳糖巧酶的影响
[0026] 在Ε. col i中过量表达簇肤酶dacB时，诱导lOh后，Ε. col i胞外分泌α-半乳糖巧酶的 水平显著提高，胞外α-半乳糖巧酶酶活力达到6.80U/g(图3)。但没有过量表达任何簇肤酶 的对照菌株诱导发酵lOh后，在E.coli胞外测得的α-半乳糖巧酶的酶活力仅为1.82U/g。
【主权项】
1. 一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacB，其特征在于：由序列1所示氨基酸序列组成的 蛋白质。2. -种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacB，其特征在于，编码权利要求1所述的D-丙 氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacB。3. 根据权利要求2所述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacB，其特征在于:其DNA序列如 序列2所示。4. 包含权利要求2或3所述的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacB的重组质粒。5. 根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述载体为pRSFDuet。
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体地，一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacB基因及应用。本发明提供了一种来源于大肠杆菌(Escherichia？coli)BL21(DE3)的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacB，其氨基酸序列如序列1所示，且本发明提供了编码上述dacB的编码基因dacB。本发明的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶能够从肽聚糖五肽上移除最后一个末端D-丙氨酸(D-Ala)，导致转肽反应中供体不可用，从而控制肽聚糖的网状交联水平，可以提高E.coli蛋白胞外分泌水平。
【IPC分类】C12N15/57, C12N15/70, C12N9/48
【公开号】CN105671025
【申请号】CN201610123619
【发明人】许菲, 杨海泉, 胡金远, 强书敏, 沈微, 陈献忠, 郑虹宁, 宁璐璐
【申请人】江南大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月4日